生物工程实验指导Word文档下载推荐.docx
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（3）蛋白质的翻译，这一系统包含核糖体识别位点（如原核的SD顺序）翻译起始密码子和终止密码子。
SD顺序与原核宿主核糖休16srRNA特异配对而结合，大肠杆菌SD顺序的成基组成为AGGA，mRNA翻译模板与核糖休的亲和力高低对翻译效率极重要，起始密码子是翻译的起始位点，通常为ATG，编码Met（甲硫氨酸），也有极少数生物利用其他密码子作为翻译过程，这些位点可指导宿主的蛋白质翻译系统准确高效地合成目的基因编码蛋白质，根据位点的构造不同还可分为完整蛋白和融合蛋白表达载体：
①完整蛋白表达载体：
目的基因直接克隆进其后，利用自身的起始密码子表达编码蛋白，有的载体其启动子后接有SD顺序，另一些载体其启动子后没有接SD顺序，需要目的基因上游带进SD顺序；
②融合蛋白表达载体：
载体启动子后连有SD顺序和超始密码子并表达另外一种多肽，目的基因按这个多肽的三联密码子阅读框插进多肽基因中的某一位点，表达出来产物为部分多肽与目的蛋白杂合的融合蛋白质。
转录出的mRNA5’上游的SD顺序与ATG的间距长度和组成对目的基因的翻译效率也很关键，间距以6-11个碱基，碱基组成CG比例不超过50%为最好。
真核基因在原核生物中表达时，ATG以后的20-40个碱基组成也很重要，通过适当的CG突变成AT的定点突变改造，有时可使表达效率提高几倍甚至十倍以上，视基因不同和改造的位点不同而有不同的提高。
二、试剂与材料
1、菌种：
大肠杆菌DH5α菌株（无抗生素抗性）或Topl0F+（四环素抗性）
2、原核表达载体质料：
pET28（Ka‘）
3、外源DNA片段：
HBVS基因片段（bp）由PCR从病人血清中扩增得到（引物为：
LEFT5–CGAATTCATGGAGAGCACAACATCAGG-3’
RIGHT5–CAAGCTTAAATGTATACCCAAAGACAAA-3’
上下游分别引入EcoRI和HindIII酶切位点）PCR产物克隆入TA克隆。
4、LB培养基
每升液体LB培养基中含
蛋白胨10克
酵母浸出液5克
NaCl10克
NaOH调pH值至7.0-7.5
每升固体LB培养基：
加1.5%的琼脂于液体之中。
高压蒸气灭菌
5、碱解法抽提质粒之深液
溶液I：
50mM葡萄糖+25mMTris-HCI（pH8.0）+10mMEDTA，高压蒸气灭菌
溶液II：
0.2NNaOH+1%SDS
溶液III：
5MKAC，60ml
冰乙酸，11.5ml
水，28.5ml
6、限制性内切酶EcoRI和HindIII及10×
酶切缓冲溶，-20℃保存
7、胶回收用低熔点琼脂糖凝或者华舜公司胶回收试剂盒
8、T4连接酶或Takara公司快速连接酶试剂盒
9、感受态细菌制备之溶液
0.1%CaCl2溶液，4℃保存。
甘油，4℃保存。
10、其他试剂
氨苄青霉素：
贮存液100mg/ml，-20℃保存，工作浓度60-100ug/ml
卡那霉素：
贮存液50mg/ml，-20℃保存，工作浓度50ug/ml
四环素：
贮存液15mg/ml，-20℃避光保存，工作浓度15ug/ml
TE缓冲液（pH8.0）10mMTris-HCI（pH8.0）+0.1mMEDTA,4℃保存
3MNaAC（pH5.2）4℃保存
无水乙醇
11、电泳试剂
电泳缓冲液TBE：
5×
母液，0.5×
工作液
溴化乙锭（EB）：
10mg/ml
1%agarose：
1克agarose中加入100ml电泳缓冲液加热溶解，然后加入5μg/ml。
溴酚兰指示剂：
0.25%溴酚兰+50%甘油
12、器材
细菌摇床、无菌试管、吸管、三角涂棒、50ml离心管、0.5ml和1.5微量离心管管、微量加样器、高速台式离心机、普通离心机、冰浴、干燥器、电泳仪、电泳槽、-40℃冰箱（菌种保存）等。
三、操作
1、碱裂解法小量制备细菌质粒DNA（pTA/HBs以及pET28）
（1）接种环挑取LB平板上的单个菌落，接种于2ml含相应抗生素的LB液体培养基中，37℃，200rpm振摇培养过夜。
（2）吸取1.5ml菌液于一微量离心管管中，10000g离心1min，倒掉培养液，使细菌沉淀尽量干燥。
（3）加入100μl溶液I，旋涡振荡器上充分振荡，使沉淀悬浮。
（4）加入200μl新鲜配制的溶液II，盖紧盖子，上下颠倒五次，冰上静置5分钟。
（5）加入150μl溶液III，盖紧盖子、上下颠倒五次，冰上静置5分钟。
（6）15000rpm离心5分钟。
上清转移到另一微量离心管管中。
（7）加入等量酚：
氨仿（体积比1：
1）抽提一次，15000离心5分钟，将上清转移到另一微量离心管中。
（8）加入2倍体积的无水乙醇，冰上放置20分钟，15000rpm离心10分钟，小心倾去上清液。
（9）用1ml70%乙醇洗涤DNA沉淀，15000rpm离心5分钟，小心倾去上清液，在空气中使核酸沉淀干燥15分钟。
（10）加30μl含Rnase（20ug/ml）的TE溶液（pH8.0）或ddH2O溶解DNA沉淀。
（11）取2μl质粒溶液进行琼脂糖凝胶电泳，检查质粒抽提结果。
2、限制性内切酶反应
（1）混合下列溶液于一个0.5ml的微量离心管中。
10μl质料DNA溶液（pTA/HBs或pET28）（100ng/μl）
7μlddH2O
2μl10×
酶切反应缓冲液
0.5μl（10U/μl）EcoRI
0.5μl（10U/μl）HindIII
（总体积20μl）
（2）37℃，温育1小时
3、低熔点琼脂糖凝胶回收DNA片段及载体
（1）DNA样品用合适的限制性内切酶完全消化，低熔点琼脂糖凝胶电泳，溴乙锭染色，然后用解剖切切下目的条带（尽量小）。
（2）将凝胶块于68℃熔化，估计融胶的体积，加入等休积的TE缓冲液（pH8.0）平衡酚，旋涡振荡器上剧烈振荡。
（3）15000rpm离心5分钟，依次可见酚相、琼脂糖相和水相。
小心吸取水相。
（4）往剩下的酚、琼脂糖相中加入与融胶等体积的水，1500rpm离心5分钟，小心吸取水相。
（5）合并两次得到的水相，估计体积，加入1/10体积的3MNaAc溶液（pH5.2）。
再用两倍体积无水乙醇沉淀DNA（室温放置30分钟）。
15000rpm离心15分钟，小心吸去上清。
（6）用200μl70%的乙醇洗涤沉淀一次，15000rpm离心5分钟,小心弃去上清。
（7）加入适量的ddH2O或TE缓冲液溶解DNA。
注：
如用华舜公司胶回收试剂盒回收，则按说明书进行。
4、连接反应
混合下列溶液于一个0.5ml的微量离心管中：
1μl质粒pET28
3μlHBVS基因片段
1μl10×
连接缓冲液
1μlT4DNA连接酶（5U/μl）
4μl水
（总体积为10μl，16℃连接2小时）
载体和片段的摩尔比为1：
3.如用Takara公司快速连接酶试剂盒则按说明书进行。
5、感受态细菌的制备，要求无菌操作
（1）接种大肠杆菌E.coliDH5α或Top10F+单一菌落于2mlLB培养基中，37℃振摇培养过夜。
（2）吸取1ml的菌液，转移到100mlLB培养基中，37℃振摇培养约3小时，使细菌处于对数生长期。
（3）菌液放冰浴中冷却10分钟，然后将菌液分装到2个预冷无菌的50ml离心管中。
（4）4℃,4000rpm离心10分钟，弃上清，细胞沉淀用10ml冰上预冷的0.1M的CaCl2溶液重新县浮，冰上放置半小时。
（5）5℃,4000rpm离心10分钟，弃上清，细胞沉淀用2ml冰上预冷的0.1MCaCl2溶液重新悬浮，即得新鲜的感受态细胞。
（6）如果冻存，加入预冷的甘油（15%体积），然后分装到无菌预冷的微量离心管中，100μl/每管，冻存于-70℃。
6、质料DNA转化大肠杆菌DH5α或Top10F+细胞。
（1）于100μl感受态细胞（新鲜或冻存，冻存的感受细胞应先置冰浴上融化）中加入5μl连接反应产物，轻轻旋转以混匀。
（2）冰浴45分钟，42℃热击90秒。
（3）加入无抗生素的LB培养基900μl，37℃120rpm振荡培养1小时。
（4）6000rpm离心2分钟，弃上清600μl。
吸取200μl于LB平板（含相应抗生素）上，用无菌三角涂棒涂布均匀，37℃培养12-16小时，平板上出现菌落，即为转化体。
7、重组质料转化体的酶切鉴定
（1）用接种环从平板上挑取克隆，接种到2mlLB培养基中（含相应抗生素），37℃振荡培养12-16小时。
（2）酶切鉴定：
碱裂解法抽提质料，用限制性内切酶消化，琼脂糖凝胶电脉查看酶切结果。
如果有大小正确的片段切下，说明质料pUC19中已插入HBVS基因片段。
（3）PCR鉴定：
随机挑取转化平板上数个菌落接种于微量孔板上（每孔加入含应的抗生素的LB液100μl）37℃孵育3-4小时后进行PCR。
PCR反应总体积30μl，含正、反向引物（25uM）各lul、10×
Buffer3μl（含MgC121.5mM）、Taq酶0.3μl（1.5U）、10mMdNTPlul、菌液3μl，根据需要鉴定的片段大小设计PCR循环方式，进行25-30个PCR循环后，取5μlPCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，判断有无基因片段插入。
（4）测序鉴定：
将酶切鉴定或PCR鉴定得到阳性克隆进行扩增后，用“小量质料抽提试剂盒”抽提质料后送至公司测序，或直接送细菌样品进行测序。
8、菌种的保存
对获得的阳性细菌必须进行保存。
将确证为阳性的细菌克隆进行扩增后取出约800-900ul的菌液加入甘油管中（甘油终浓度为15%），混匀后放置-40℃或-70℃保存。
注意：
1、在细菌接种、扩增等过程中，LB液中必须加有对应抗生素，否则细菌缺少这种压力携带的质粒拷贝会逐渐丢失，使得抽提的质粒量少，难以进行实验。
2、mRNA转录出来后，如果在SD序列或目的基因的ATG位点及附近出现有二级折叠结构，并且其茎环中茎的长度大于5bp时，会严重影响到蛋白质的翻译效率，产率极低。
通过定点突变或更换载体使这类二级结构消除，可使表达效率提高10-100倍以上。
PET28a-c原核表达载体图谱
实验二重组蛋白的诱导表达
最早建立并得到广泛应用的表达系统是以大肠杆菌lac操纵子调控机理为基础设计、构建的表达系统，称为Lac表达系统，lac操纵子是研究最为详尽的大肠杆菌基因操纵子，该操纵子的转录受正调节因子CAP和负调节因子lacl的调控。
在无诱导物情形下，lacl基因产物形成四聚体阻遇蛋白。
与启动子下游的操纵基因紧密结合，阻止转录的起始，异丙基-α-βD-硫代半乳糖苷（IPTG）等乳糖类似物是lac操纵子的诱导物，它们与阻遇蛋白结合后使之改变构象，导致与操纵基因的结合能力降低而解离出来，lac操纵子的转录因此被激活，由子lac操纵子具有这种可诱导调控基因转录的性质，因此其元件和它们的一些突变体经常被用于表达载体的构建。
如前图所示，pET-28原核表达载体中则带有lacl基因，故可用IPTG进行透导表达。
表达载体、目的基因和宿主菌共同构成一个完整的表达系统，因此良好的表达系统不仅与表达载体的目的基因有关，选择合适的宿主菌也十分重要。
首先表达载体的启动子应在宿主中具有强起动功效，不同的启动子对应的宿主往往不同，如大场杆菌中的启动子选用大肠杆菌宿主，枯草杆菌启动子选用枯草杆菌宿主，这样有利于充分发挥强启动子的效率；
其次，某些表达载体自身不带抑制药基因，用这类载体就应选择能产生抑制物蛋白质的宿主菌，否则表达不能调控，不利于高诳表达目的的基因，第三，表达的蛋白质产物因宿主菌内的蛋白酶作用会发生降解，所以许多用作表达的宿主都经过改造，以便于表达蛋白的积累。
当表达的蛋白质对宿主菌有毒害，应考虑换一种宿主细胞，目前，我们对原核生物的了解要比对真核生物更全面更深入。
当前开发出的基因工程产品中80%-90%是用的原核生物表达系统。
原核生物表达系统因基相关的基本理论和技术方法成熟、操作成本较低而得到广泛的应用。
但是表达真核基因方面，因宿主缺少真核生物的蛋白质加工系统（如剪切和糖基化）、基因的密码子偏爱性不同及包含体复性等而受到限制。
原核生物除大肠杆菌表达系统外，还有棒状杆菌、枯草杆菌和沙门氏杆菌等表达系统，它们都有各自的优缺点。
1、表达菌株BL21DE3plysS感受态细胞
2、pET28/HBs阳性克隆质粒
3、LB液体培养基（无抗性）
4、LB液体培养基（kan+）
5、LB平板（kan+）
6、IPTG贮备液：
2gIPTG溶于10mlddH2O，0.22μm滤膜过滤除菌，分装成1ml/份，-20℃保存。
工作浓度为1mM。
7、器材：
细菌摇床、无菌试管、吸管、三角涂棒、50ml离心管、0.5ml和1.5ml微量离心管管、微量加样器、高速台式离心机、普通离心机、制冰机、-40℃冰箱（菌种保存）等。
1、转化
取前面构建的阳性质粒10ng加入100ul表达细菌（BL21DE3plysS）感受态中，冰上放置45分钟，在此过程中可以每隔几分钟用手轻弹Eppendof管，然后进行热休克（42℃水浴90秒，取出立即插入冰中放置5分钟），加入预热的无抗生素的LB液900ul、于37℃摇床中200rpm摇1小时，吸取50-100ul菌液进行均匀涂板，LB平板必须含有相应的抗生素，将LB平板放在37℃温箱中过夜培养。
2、诱导表达
随机挑取数个菌落，各加3ml含的LB液于37℃摇过夜，取出300ul菌液加3ml有抗生素的LB液，作1：
10稀释，37℃250rpm摇2小时（OD值约为0.2-0.6），于各管中加100mMIPTG30ul（终浓度为1mM），37℃250rpm摇6小时，进行诱导。
诱导后6000rpm离心2分钟，收集菌体，用50ulddH2O重悬菌体，加等体积2×
蛋白上样液（约60ul），于沸水浴中变性5分钟，同时取一个阴性对照（即未加IPTG诱导的菌体）经过变性处理后同时进行SDS-PAGE分析，着有无目的的蛋白表达（下一次实验的内容）。
若须纯化蛋白，最好选择一表达量最大的菌种进行以后实验。
3、诱导表达条件的优化
对于不同的可溶性蛋白，进行诱导的IPTG浓度、温度、时间均不同，必须进行选择优化，即在上述不同的条件下分别进行诱导，通过SDS-PAGE分析选择最佳条件进行蛋白诱导、表达和纯化。
表达菌株的过夜培养物接种，是为了在诱导地培养基中的细菌能尽量处于同步生长状态，以便于产物的大量表达，在按排实验时前一天应考虑到将过夜菌接种培养，该实验的时间较长，第一次操作时，时间安排不当，当天可能做不完，而表达产物又不适合于过夜放置，应当予以注意。
实验三重组蛋白的聚丙烯凝胶电泳（PAGE）
聚丙烯酰胺凝胶电泳由丙烯酰胺单体和交联剂甲又双丙烯酰胺，在催化剂作用下，形成三维网状结构，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳具有很高的分辨率，这主要是由于浓缩胶的浓缩效应和分离胶的分子筛效应。
在浓缩胶中，缓冲液pH为6.8,HCI几乎全部解离；
甘氨酸的等电点为Ph6,解离度小；
蛋白质的等电点多为pH5左右，其解离度在HCI和甘氨酸之间，在电场中，迁移率大小次序为CI＞Pro＞Gly，电泳开始后，CI超过了蛋白质，将蛋白质离子推倒它的后面，Gly则将蛋白质离子推到它的前面，由于浓缩胶和分离胶的不连续pH梯度作用，可在二者之间形成三种离子的界面，蛋白质离子就聚集在Cl和Gly之间，原来lcm厚的样品层可以被压缩至0.25μm，样品被压缩成一条狭窄区带，从而提高了分离效果。
在分离胶中，缓冲液的pH为8.8,甘氨酸进入分离胶后解离度大为增加，其迁移率与Cl相仿，泳至蛋白质离子前面，因此浓缩效应消失。
蛋白质具有不同的电荷和分子量，在经过阴离子去污剂SDS处理后，蛋白质分子上的电荷被中和，蛋白质分子带上均一负电荷，在聚丙烯酰胺凝胶电泳时，不同的蛋白质按照其分子量大小进行分布，电泳迁移率仅取决于蛋白质的分子量，此时，由于凝胶浓度增加，孔径变小，分子筛效应起主要作用，使得电泳迁移率仅取决于蛋白质的分子量大小。
采用考马斯亮蓝快速染色，可及时观察电泳分离效果。
1、30%（W/V）凝胶贮存液
丙烯酰胺30克；
甲又双丙烯酰胺0.8克
加蒸馏水溶到100ml，用新华3号滤纸过滤，棕色瓶中4℃保存
2、4×
分离胶缓冲液（HCI调pH至8.8）
Tris18.2g;
SDS0.4g,加蒸馏水深至100ml
3、4×
浓缩胶缓冲液（HCI调pH至6.8）
Tris6.06g;
SDS0.4g,加蒸馏水溶至100ml
4、10×
PAGE电泳缓冲液
Tris30.3g;
Glycine144.2g;
SDS10g,加蒸馏水溶至1000ml
5、2×
蛋白上样缓冲液（HCI调pH至6.8）
Tris1.21g;
SDS4g;
2-Mercaptoethanol10ml;
Glycerol20ml;
BromophenolBlue0.2g,加蒸馏水溶至100ml
6、染色液：
95%乙醇500ml
冰醋酸100ml
考马斯亮蓝2.5g,加蒸馏水溶至1000ml
7、脱色液：
95%乙醇55ml
冰醋酸75ml，加蒸馏水至1000ml
8、10%过硫酸铵（AP）、TEMED
9、SDS-PAGE低分子量蛋白Maker
97.4、66.2、43、31、20.1、14.4KD
10、SDS-PAGE电泳装置
11、脱色摇床
1、将玻璃板洗涤干净，固定于电泳憎上，用0.8%琼脂糖凝胶封底（约高5mm）。
2、灌分离胶：
7.5%
10%
12%
15%
6ml
H2O
3ml
2.5ml
2.1ml
1.5ml
30%凝胶贮存液
2ml
2.4ml
4×
分离胶缓冲液（pH8.8）
10%过硫酸铵
60μl
TEMED
3μl
2.5μl
2μl
1.5μl
加入TEMED后立即混匀，小心灌入玻璃板夹层中，（胶顶距离Teflon梳子5mm左右），然后用100μl正于醇封顶，保持胶面平整。
3、灌浓缩胶：
待分离胶凝固后，倒出正丁醇和析出的水相，灌入浓缩胶，插好Teflon梳子。
4.5%
4ml
1.2ml
0.6ml
0.3ml
分离胶缓冲液
（pH8.8）
1ml
0.5ml
40μl
20μl
4μl
4、样品处理：
蛋白样品加入等体积的2×
蛋白上样缓冲液，沸水浴5-10分钟（冷却后上样）
5、上样：
在电泳槽中加入1×
PAGE电泳缓冲液，小心拔出梳子，上样10-20μl.
6、电泳：
起始用低电压8V/cm（约60V），当溴酚兰前沿进入分离胶后，电压提高位15V/cm（约120V），直到溴酚兰泳到胶底为止。
关闭电泳仪。
7、剥胶：
取出玻璃板，小心撬开，切除封底胶和浓缩胶，切去左右上角作记号。
8、染色和脱色：
将凝胶浸泡在染色液中，振荡染色1-2小时，有时可根据染色液质量，染色过夜。
然后换脱色液，洗至背景干净、条带清晰为止。
9、染色和脱色：
拍照或用干胶机干胶保存。
1、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的有效分离范围
丙烯酰胺浓度（%）
线性分离范围（KD）
15
12-43
10
16-68
7.5
36-94
5.0
57-212
2、宿主菌都有其自身的蛋白质，表达的产物在SDS-PAGE电泳时，其分子量可能会与宿主菌的蛋白质条带重叠，给分析结果带来麻烦，遇到这种情况。
一般采用以下几种办法来处理：
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