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科学家认为这些跨物种的相似性证明了某个特殊的基因完成了一些许多生命形式所必须的基本功能，因此在进化过程中保留了这些序列，而很少发生突变。
10、序列位置标签（SequenceTaggedSite，STS）：
一段短的DNA序列（200-500个碱基对），这种序列在染色体上只出现一次，其位置和碱基顺序都是已知的。
在PCR反应中可以检测出STS来，STS适宜于作为人类基因组的一种地标，据此可以判定DNA的方向和特定序列的相对位置。
二、问答题
一、在分子克隆实验中为提高转化效率需注意哪些因素的影响？
答：
1、受体细胞的生长状态和密度。
2、质粒的质量和浓度，主要是浓度比例要合适，才能最大限度的与目的基因结合，达到最佳的转化效率。
3、试剂的质量，主要是指用于转化试剂的质量，各个厂家、一个厂家不同批次的试剂质量都可能存在很大的差异。
4、防止DNA污染和其他杂菌，主要是指实验所用的仪器设备都要注意彻底消毒灭菌。
二、什么是同裂酶与同尾酶？
及其在基因克隆中有何用途？
同列酶：
是来源于不同物种但能识别相同DNA序列的限制性内切酶，切割位点可以相同也可以不同；
同尾酶：
即能切割产生相同末端的限制性内切酶，一般是指能产生相同粘性末端的限制酶。
这一类的限制酶来源各异，识别的靶字序列也不相同，但产生相同的粘性末端.
三、简述PKA的特性，cAMP-PKA途径的组成与机制及对基因表达调节作用？
答案：
蛋白激酶A（proteinkinaseA，PKA）又称依赖于cAMP的蛋白激酶A，是一种结构最简单、生化特性最清楚的蛋白激酶。
PKA全酶分子是由四个亚基组成的四聚体,其中两个是调节亚基，简称R亚基，另两个是催化亚基，简称C亚基。
R亚基的相对分子质量为49-55kDa,C亚基的相对分子质量为40kDa,总相对分子质量约为180kDa；
全酶没有活性。
在大多数哺乳类细胞中,至少有两类蛋白激A,一类存在于胞质溶胶,另一类结合在质膜、核膜和微管上。
激酶是激发底物磷酸化的酶,所以蛋白激酶A的功能是将ATP上的磷酸基团转移到特定蛋白质的丝氨酸或苏氨酸残基上进行磷酸化,被蛋白激酶磷酸化了的蛋白质可以调节靶蛋白的活性。
一般认为,真核细胞内几乎所有的cAMP的作用都是通过活化PKA,从而使其底物蛋白发生磷酸化而实现的。
蛋白激酶A（ProteinKinaseA，PKA）：
由两个催化亚基和两个调节亚基组成（图8-15），在没有cAMP时，以钝化复合体形式存在。
cAMP与调节亚基结合，改变调节亚基构象，使调节亚基和催化亚基解离，释放出催化亚基。
活化的蛋白激酶A催化亚基可使细胞内某些蛋白的丝氨酸或苏氨酸残基磷酸化，于是改变这些蛋白的活性，进一步影响到相关基因的表达。
cAMP-PKA途径：
四、简述真核基因在原核细胞表达的一般原理？
1、采用的主要表达方式有三种即
（1）融合表达，
（2）非融合表达，（3）及分泌型表达。
（1）融合表达：
是真核基因在大肠杆菌中使其表达融合的一部分及融合蛋白的氨基端是真核序列，羧基端是原核序列。
（2）非融合表达：
是指在细菌内表达的蛋白质以真核蛋白的mRNA的A.U.G为起始，在氨基端不含任何原核蛋白序列。
融合与不融合表达需要不同的载体。
（3）分泌型表达：
是将外源基因整合到编码原核蛋白信号肽序列基因的下游来实现的，当蛋白分泌到细菌周质时，信号肽被切除。
五、简述hnRNA、snoRNA、snRNA和antisenseRNA四个名词的含义及其一级结构的特点？
1、hnRNA：
在真核细胞核内可以分离到一类含量很高，分子量很大但不稳定的RNA，称为核内不均一RNA（heterogenousnuclearRNA,hnRNA），其平均分子长度为8-10kb，长度变化的范围从2kb左右到14kb左右。
比mRNA的平均长度（1.8-2kb）要大4-5倍。
估计hnRNA仅有总量的1/2转移到细胞质内，其余的都在核内被降解掉。
（短答案：
HnRNA真核细胞核内一组转换极快、大小不一、分子量多超过107kb的RNA称为不均一核RNA，包括基因转录的直接产物和部分加工产物。
hnRNA的结构有以下特点：
（1）5′端有帽结构；
（2）3′端有poly（A）尾巴；
（3）帽结构后有3个寡聚U区，每个长约30nt；
（4）有重复序列，位于寡聚U区后面；
（5）有茎环结构，可能分布于编码区（非重复序列）的两侧；
（6）非重复序列中有内含子区。
2、snoRNA：
是位于细胞核仁中一类小分子非编码RNA，在rRNA生物合成中起着重要作用，是近来生物学研究的热点。
已证明有多种功能，反义snoRNA指导rRNA核糖甲基化。
核仁小RNA与其它RNA的处理和修饰有关，如核糖体和剪接体核小RNA、gRNA等。
核仁小RNA是一个与特性化的非编码RNA相关的大家族。
是一类小型RNA分子，可引导核糖体RNA（rRNA）或其他RNA的化学修饰（如甲基化）作用。
3、snRNA：
它是真核生物转录后加工过程中RNA剪接体（spilceosome）的主要成分。
现在发现有五种snRNA，其长度在哺乳动物中约为100-215个核苷酸。
snRNA一直存在于细胞核中，与40种左右的核内蛋白质共同组成RNA剪接体，在RNA转录后加工中起重要作用。
另外，还有端体酶RNA（telomeraseRNA），它与染色体末端的复制有关；
以及反义RNA（antisenseRNA），它参与基因表达的调控。
4、antisenseRNA即反义RNA，是指与mRNA互补的RNA分子，也包括与其他RNA互补的RNA分子，由于核糖体不能翻译双联的RNA，所以反义RNA特异性的互补结合，即抑制了该mRNA的翻译。
通过反义RNA控制mRNA的翻译是原核生物基因表达调控的一种方式，最早在E.coli的大肠杆菌素的ColE1质粒中发现的，许多实验zhengming在真核生物中也存在反义RNA。
近几年来通过人工合成反义RNA的基因，并将其导入细胞内转录成反义RNA，即能抑制某特定基因的表达，阻断该基因的功能，有助于了解该基因对细胞生长和分化的作用。
细胞中反义RNA的来源有两种途径：
第一是反向转录的产物，即产生mRNA和反义RNA的DNA是同一区段的互补链。
第二种来源是不同基因产物，如OMPF基因是大肠杆菌的膜蛋白基因，与透性有关，起反义基因是MICFZE则为另一基因。
六、简述cDNA探针和cDNA文库的概念及在分子克隆中的用途？
cDNA探针：
cDNA是指互补于mRNA的DNA分子。
cDNA是由RNA经一种称为逆转录酶的DNA聚合酶催化产生的，这种逆录酶是Temin等在70年代初研究致癌RNA病毒时发现的，又称反向转录或逆转录。
cDNA文库：
cDNA文库的构建是分子生物学领域的一项重要技术。
cDNA是以mRNA为模板，在逆转录酶的作用下，在体外被逆转录为cDNA第一链，再以cDNA为模板，由大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ合成第二链，得到双链cDNA。
由于组织或细胞的总RNA或mRNA中，含有该细胞的全部mRNA分子，因而被合成的cDNA产物将是各种mRNA拷贝的群体。
当它们与质粒重组后并转化至宿主细胞中，将得到一系列克隆群体，每个克隆仅含有一种mRNA信息，所有克隆的总和则包含细胞内全部mRNA的信息，这种克隆群体则为cDNA文库。
逆转录现在已成为一项重要的分子生物学技术，广泛用于基因的克隆和表达。
从逆转录病毒中提取的逆转录酶已商品化，最常用的有AMV逆转录酶。
利用真核Mrna3’末端存在一段聚腺苷酸尾，可以合成一段寡聚胸苷酸（oligo（dT））用作引物，在逆转录酶催化下合成互补于mRNA的cRNA链，然后再用RNaseH将mRNA消化掉，再加入大肠杆菌的DNA聚合酶I催化合成另一条DNA链，即完成了从mRNA到双链DNA的逆转录过程。
应用cDNA文库筛选和克隆新基因，是一条快速而有效的途径。
也可从cDNA文库中筛选出所需的目的基因，用于该基因的表达和研究。
七、质粒载体应具备哪些基本特征？
并说明其理由。
1具有复制起点这是质粒自我增殖必不可少的基本条件，并可协助维持使每个细胞含有10-20个左右的质粒拷贝。
通常，一个质粒只含有一个复制起点，构成一个独立的复制子。
但在少数情况下，有融合产生的质粒也会含有两个复制子，但其中只有一个有活性。
2具有抗菌素抗性基因一种理想的质粒克隆载体应具有两种抗菌素抗性基因，以便为寄主细胞提供易于检测的表型性状作为选择记号，而且在有关的限制每识别位点上插入外源DNA片段后形成的重组质粒，至少仍要保留一个强选择记号。
3具有若干限制酶单一识别位点这样的分子结构特性，可以满足基因克隆的需要，而且在其中插入适当大小的外源DNA片段之后，应不影响质粒DNA的复制功能。
4具有较小的分子量和较高的拷贝数低分子量的质粒首先易于操作，克隆了外源DNA片段后仍可有效的转化给受体细胞；
而且这类质粒往往含有较高的拷贝数，这不仅有利于质粒DNA的制备，同时还会使细胞中克隆基因的剂量增加；
最后，低分子量的质粒载体，对限制酶具有多重识别位点的几率也就相应降低。
八、简述IP3-DG信号转导系统的组成及作用机制？
（1）、IP3-DG就是甘油二脂（DG）-蛋白激酶C途径。
甘油二脂（DG）是该途径的第二信使，它是肌醇磷脂的分解产物之一。
当激素与受体结合后经G蛋白转导，激活磷脂酶C，由磷脂酶C将质膜上的磷脂酰肌醇二磷酸（PIP2）水解成三磷酸肌醇（IP3）和DG。
（2）、IP3和DG的作用：
由PIP2水解产生的IP3是水溶性的小分子物质，离开细胞膜后能在细胞质内很快地扩散，IP3与内质网膜上的特异Ca2+-通道结合后，就能使内质网腔里的Ca2+释放到细胞质，而且释放的Ca2+具有正反馈效应，即释出的Ca2+结合到Ca2+通道，再促进Ca2+释放。
DG的重要作用是激活蛋白激酶C（proteinkinaseC,PKC），PKC是一类Ca2+依赖的蛋白激酶，能使选择性的靶蛋白的丝氨酸/苏氨酸残基磷酸化。
因IP3作用升高的细胞质内Ca2+能使PKC从细胞质转移到细胞膜胞质面。
在Ca2+，DG和细胞膜磷脂成分中的磷脂酰丝氨酸的共同作用下激活PKC。
哺乳动物中脑细胞的PKC浓度最高，其作用是使神经细胞的离子通道蛋白磷酸化，从而改变神经细胞膜的兴奋性。
在许多细胞中，PKC能通过激活磷酸化级联反应，最后使一些转录因子磷酸化并激活，从而调控相关基因的表达。
（作用（短答案）：
IP3使内质网腔里的Ca2+释放到细胞浆。
DG的作用是激活C激酶，C激酶再激活靶蛋白。
对C激酶的激活还需Ca2+和磷脂酰丝氨酸共同作用。
九、何谓顺式作用元件和反式作用因子？
反式因子的结构有何特点？
（1）顺式作用元件：
顺式作用元件是同一DNA分子中具有转录调节功能的特异DNA序列。
按功能特性，真核基因顺式作用元件分为启动子、增强子及沉默子。
反式作用因子：
以反式作用影响转录的因子可统称为转录因子（transcription
factors,
TF）。
RNA聚合酶是一种反式作用于转录的蛋白因子。
在真核细胞中RNA聚合酶通常不能单独发挥转录作用，而需要与其他转录因子共同协作。
与RNA聚合酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ相应的转录因子分别称为TFⅠ、TFⅡ、TFⅢ，对TFⅡ研究最多。
（2）反式因子的结构特点：
①螺旋-转角-螺旋：
是最早发现于原核生物中的一个关键因子，该结构域长约20个aa，主要是两个α-螺旋区和将其隔开的β转角。
其中的一个被称为识别螺旋区，因为它常常带有数个直接与DNA序列相识别的氨基酸。
②锌指：
长约30个aa，其中4个氨基酸（Cys或2个Cys，两个His）与一个Zinc原子相结合。
与Zinc结合后锌指结构较稳定。
③同源域：
最早来自控制躯体发育的基因，长约60个氨基酸，其中的DNA结合区与helix-turn-helixmotif相似，人们把该DNA序列称为homeobox。
主要与DNA大沟相结合。
④亮氨酸拉链：
是亲脂性（amphipathic）的α螺旋，包含有许多集中在螺旋一边的疏水氨基酸，两条多肽链以此形成二聚体。
每隔6个残基出现一个亮氨酸。
由赖氨酸（Lys）和精氨酸（Arg）组成DNA结合区。
⑤碱性螺旋-环-螺旋（basichelix-loop-helix）该调控区长约50个aa残基，同时具有DNA结合和形成蛋白质二聚体的功能，其主要特点是可形成两个亲脂性α-螺旋，两个螺旋之间由环状结构相连，其DNA结合功能是由一个较短的富碱性氨基酸区所决定的。
十、什么是配体和受体，受体是如何分类的，简要说明受体的作用特点？
配体：
同锚定蛋白结合的任何分子都称为配体。
在受体介导的内吞中,与细胞质膜受体蛋白结合,最后被吞入细胞的即是配体。
受体：
在细胞生物学中是一个很泛的概念,意指任何能够同激素、神经递质、药物或细胞内的信号分子结合并能引起细胞功能变化的生物大分子。
受体分类
（1）胞内受体：
甾类激素等
（2）细胞表面受体：
水溶性多肽激素等
受体作用特点
（1）受体与配体结合的特异性这是受体的最基本特点，保证了信号传导的正确性。
配体和受体的结合是一种分子识别过程，它依靠氢键、离子键与范德华力的作用使两者结合，配体和受体分子空间结构的互补性是特异性结合的主要因素。
特异性除了可以理解为一种受体仅能与一种配体结合之外，还可以表现为在同一细胞或不同类型的细胞中，同一配体可能有两种或两种以上的不同受体；
同一配体与不同类型受体结合会产生不同的细胞反应，例如肾上腺素作用于皮肤粘膜血管上的α受体使血管平滑肌收缩，作用于支气管平滑肌等使其舒张。
（2）高度的亲和力
（3）配体与受体结合的饱和性
十一、举例说明原核生物基因转录的两种正调控的类型及其机制？
正调控是（正控制）：
在没有调节蛋白质存在时基因是关闭的，加入某种调节蛋白质后基因活性就被开启，这样的控制系统就叫做正控制系统。
其调节蛋白质叫做无辅基诱导蛋白。
例子：
乳糖操纵子
（1）乳糖操纵子的结构
大肠杆菌的乳糖操纵子含Z、Y及A三个结构基因，分别编码β-半乳糖苷酶、透酶、乙酰基转移酶，此外还有一个操纵序列O、一个启动序列P及一个调节基因Ⅰ。
Ⅰ基因编码一种阻遏蛋白，后者与O序列结合，使操纵子受阻遏而处于转录失活状态。
在启动序列P上游还有一个分解（代谢）物基因激活蛋白CAP结合位点，由P序列、O序列和CAP结合位点共同构成LAC操纵子的调控区，三个酶的编码基因即由同一调控区调节，实现基因产物的协调表达。
（2）阻遏蛋白的负性调节
在没有乳糖存在时，乳糖操纵子处于阻遏状态。
此时，Ⅰ基因列在P启动序列操纵下表达的乳糖阻遏蛋白与O序列结合，故阻断转录启动。
阻遏蛋白的阻遏作用并非绝对，偶有阻遏蛋白与O序列解聚。
因此，每个细胞中可能会有寥寥数分子β半乳糖苷酶、透酶生成。
当有乳糖存在时，乳糖操纵子即可被诱导。
真正的诱导剂并非乳糖本身。
乳糖经透酶催化、转运进入细胞，再经原先存在于细胞中的少数β-半乳糖苷酶催化，转变为别乳糖。
后者作为一种诱导剂分子结合阻遏蛋白，使蛋白构型变化，导致阻遏蛋白与O序列解离、发生转录，使β-半乳糖苷酶分子增加1000倍。
（3）CAP的正性调节
分解代谢物基因激活蛋白CAP是同二聚体，在其分子内有DNA结合区及cAMP结合位点。
当没有葡萄糖及cAMP浓度较高时，cAMP与CAP结合，这时CAP结合在乳糖启动序列附近的CAP位点，可刺激RNA转录活性，使之提高50倍；
当葡萄糖存在时，cAMP浓度降低，cAMP与CAP结合受阻，因此乳糖操纵子表达下降。
由此可见，对乳糖操纵子来说CAP是正性调节因素，乳糖阻遏蛋白是负性调节因素。
两种调节机制根据存在的碳源性质及水平协调调节乳糖操纵子的表达。
（4）对调节机制的解释
大肠杆菌根据碳源性质选择代谢方式。
倘若有葡萄糖存在时，细菌优先选择葡萄糖供应能量。
葡萄糖通过降低cAMP浓度，阻碍cAMP与CAP结合而抑制乳糖操纵子转录，使细菌只能利用葡萄糖。
在没有葡萄糖而只有乳糖的条件下，阻遏蛋白与O序列解聚，CAP结合cAMP后与乳糖操纵子的CAP位点，激活转录，使得细菌利用乳糖作为能量来源。
。
2色氨酸操纵子-色氨酸操纵子（tryptophaneoperon）负责色氨酸的生物合成，当培养基中有足够的色氨酸时，这个操纵子自动关闭，缺乏色氨酸时操纵子被打开，trp基因表达，色氨酸或与其代谢有关的某种物质在阻遏过程（而不是诱导过程）中起作用。
由于trp体系参与生物合成而不是降解，它不受葡萄糖或cAMP-CAP的调控。
色氨酸的合成分5步完成。
每个环节需要一种酶，编码这5种酶的基因紧密连锁在一起，被转录在一条多顺反子mRNA上，分别以trpE、trpD、trpC、trpB、trpA代表，编码了邻氨基苯甲酸合成酶、邻氨基苯甲酸焦磷酸转移酶、邻氨基苯甲酸异构酶、色氨酸合成酶和吲哚甘油-3-磷酶合成酶。
trpE基因是第一个被翻译的基因，和trpL和trpa（不是trpA）。
trp操纵子中产生阻遏物的基因是trpR，该基因距trp基因簇很远，后者在大肠杆菌染色体图上25min处，而前者则位于90min处。
在位于65min处还有一个trpS（色氨酸tRNA合成酶），它和携带有trp的tRNATrp也参与trp操纵子的调控作用。
十二、目前有关原核生物核糖体的结构、功能以及rRNA、tRNA相互作用取得了的哪些重要进展？
功能：
它是装配蛋白质的场所，参与的成分很多，功能复杂。
核糖体的结构至少满足如下部位：
（1）.容纳mRNA的部位。
（2）.结合氨基酰-tRNA的部位（称A-位点）。
（3）.结合肽基-tRNA的部位（称P-位点）。
（4）.形成肽键的部位（转肽酶中心）。
结构：
原核生物；
70S核糖体，有大小亚基组成，小亚基30S，大亚基50S。
还有rRNA与它们结合在一起.只有大小亚基结合在一起才能发挥功能。
相互作用：
（1）mRNA结合部位和16sRNA的3’端，30s亚基的平台区。
（2）有两个tRNA结合位点，SD序列位于30s亚基上。
（3）鸟甘酸酶活性位于50s亚基上。
（4）50s亚基与膜结合部位距肽链出口较近。
重要进展：
主要有以下12个方面：
（1）RNA转录、反转录、复制和转录后加工；
（2）RNA和蛋白质生物合成关系；
（3）RNA催化活性的发现与RNA世界；
（4）一级和二级结构的测定与模拟；
（5）修饰核苷酸和具有生物功能小分子活性的核苷酸的发现；
（6）各种信息调控RNA的发现；
（7）重要的核酸工具酶的发现；
（8）RNA—RNA、RNA—DNA、RNA—蛋白质间的相互作用；
（9）RNA的生物合成，嘌呤和嘧啶核苷酸的生物合成；
（10）RNA的人工合成（我国80年代初人工合成酵母丙氨酸tRNA工作至今在国际上享有很高声誊）；
（11）RNA研究的产业化；
（12）RNA研究中的各种新技术的进入等。
十三、如何从转化后获得的受体菌中筛选出含有目的基因的重组体？
由体外重组产生的DNA分子，通过转化、转染、转导等适当途径引入宿主会得到大量的重组体细胞或噬菌体。
面对这些大量的克隆群体，需要采用特殊的方法才能筛选出可能含有目的基因的重组体克隆。
同时也需要用某种方法检测从这些克隆中提取的质粒或噬菌体DNA，看其是否确实具有一个插人的外源DNA片段。
即便在这一问题得到了证实之后，也还不能肯定这些重组载体所含有的外源DNA片段就一定是编码所研究的目的基因的序列。
为解决这一系列的问题，从为数众多的转化子克隆中分离出含有目的基因的重组体克隆，需要建立一整套行之有效的特殊方法。
目前已经发展和应用了一系列构思巧妙、可靠性较高的重组体克隆检测法，包括使用特异性探针的核酸杂交法、免疫化学法、遗传检测法和物理检测法等。
一、遗传检测法
遗传检测法可分为根据载体表型特征和根据插入序列的表型特征选择重组子两种方法。
1．根据载体表型特征选择重组体分子的直接选择法
（1）抗药性标记插入失活选择法
（2）β—半乳糖苷酶显色反应选择法
2．根据插入序列的表型特征选择重组体分子的直接选择法
二、物理检测法
1．凝胶电泳检测法
2.小规模制备质粒DNA进行限制酶切分析
3．R—环检测法
三、核酸杂交筛选法
1．原位杂交
2.Southern印迹杂交
3.Northern杂交
四、免疫化学检测法
1．放射性抗体检测法
2．免疫沉淀检测法
3．表达载体产物之免疫化学检测法
五、DNA—蛋白质筛选法
十四、以Puc8/9为例说明插入失活法的原理？
pUC载体是在pBR322质粒载体的基础上，组入了一个在其5，—端带有一段多克隆位点的lacZ'
基因，而发展成为具有双功能检测特性的新型质粒载体系列。
常用的插入失活方法有大肠杆菌β—半乳糖苷酶失活和免疫功能失活两种。
原理：
利用β—半乳糖苷酶插入失活的载体（如λgtll、λgtl8—23等），在生色底物（X—gal）和诱导物（1PTG）存在时，与相应的Lac—宿主铺平板可形成深蓝色噬菌斑。
用这种载体进行克隆时，β—半乳糖苷酶基因的大部分被外源DNA片段取代，所产生的重组噬菌体丧失α—互补能力，在含有X-gal和IPTG的平板下形成无色噬菌斑。
因此，对于这类入噬菌体载体，可通过组织化学方法进行重组子的筛选。
在免疫功能插入失活型载体的基因组中与免疫功能有关的DNA区段中含有一、二种限制酶的单一切点，当外源DNA片段由这些位点插入时，就会使载体所具有的合成活性阻遏物的功能遭到破坏，而无法进入溶源周期。
因此，凡带有外源DNA片段的重组体只能形成清晰的噬菌斑，而没有外源DNA插入的亲本则形成混浊的噬菌斑，不同的噬菌斑形态可作为筛选重组体的标志。
这种类型的载体中的λgtl0最
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