华蟾素对正常人外周血来源树突状细胞的影响文档格式.docx
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结论：
华蟾素能增强正常人DCs的功能。
【关键词】树突状细胞华蟾素外周血流式细胞仪酶联免疫吸附试验
[Abstract]Objective:
TostudytheeffectofCinobufotalinonthemorphous，phenotypeandfunctionofdendriticcellsderivedfromperipheralbloodofhealthadults,andtoexplainthemechanismofactionofCinobufotalinfromthemoleculeandcelllevelsofDCs.Methods:
Mononuclearcellsofhealthyadultswereisolatedfromperipheralblood,andwereculturedtoinduceDCswiththecombinationofGM-CSFandIL-4.Usingselfmatched-pairsdesigntwogroupsweredividedintheexperiment:
controlsandCinobufotalin.Onthe7thday,DCsof2groupswereobservedtocomparethedifferencesofthemorphous,theexpressionofsurfacemoleculesonDCsweredetectedbyflowcytometer;
theDCs’capacitiesofstimulatingallogeneiclymphocyteproliferationwasdetectedbycellcountkit8（CCK8）,andtheconcentrationofIL-12inthesupernatantsofDCs’cultureswasdetectedbyELISA.Results:
comparedwiththecontrols,theDCsincubatedwithCinobufotalinhadmorematurestate,hadhigherexpressionofsurfacemolecules,andhighercapacitiesofstimulatingallogeneiclymphocyteproliferationandsecretingIL-12.Conclusion:
CinobufotalincanenhancethefunctionofDCsofhealthyadults.
[Keywords]Dendriticcell;
Cinobufotalin；
Peripheralblood；
Flowcytometer；
Enzyme-linkedimmunosorbentassay
华蟾素（cinobufotalin）是由中华大蟾蜍阴干的全皮为原料提取的水溶性制剂，应用于临床治疗乙肝及肝癌已有20多年的历史。
临床应用表明其能显着提高机体的免疫功能[1，2]。
但有关华蟾素作用机制的研究很少，本课题通过研究华蟾素对正常人外周血来源的树突状细胞（DCs）形态、表型和功能的影响，从DCs的分子细胞水平初步探讨华蟾素提高机体免疫功能的作用机制。
1材料与方法
材料
细胞因子和单克隆抗体rhGM-CSF（北京宝赛生物技术有限公司）、rhIL-4（R&
DSystems,Inc）、rhIL-2（南京军事医学科学院）、FITC-CD80鼠抗人单克隆抗体（BioLegend）、PE-CD86、FITC-CD40鼠抗人单克隆抗体（晶美生物工程有限公司）、PE-HLA-DR鼠抗人单克隆抗体、PE和FITC鼠IgG（CALTAGLABORATORIES）。
主要试剂RPMI-1640（Sigma公司）、小牛血清（杭州四季青生物工程有限公司）、淋巴细胞分离液（上海恒信化学试剂有限公司）、IL-12ELISA检测试剂盒（晶美生物工程有限公司）、Cellcountkit8（CCK8，株式会社日本同仁化学研究所中国代表处）。
方法
对象正常人16名，男女各半，为南通大学医学院老师和学生健康志愿者。
外周血DC的体外诱导取正常人外周血常规分离单个核细胞（PBMC），悬浮（浓度为2×
106/ml）后，加入24孔培养板（1ml/孔）。
37℃，5%CO2培养箱中孵育2小时后吸弃上清，轻洗培养板去除非贴壁细胞，即获得贴壁的单核细胞。
每孔加入DC培养液（1640+丁氨卡那霉素+10%小牛血清+IL-4+GM-SCF）1ml，IL-4（500U/ml）、rhGM-CSF（1000U/ml），置37℃，5%CO2培养箱中培养。
华蟾素最适药物浓度选择取一正常人外周血常规分离单核细胞（Monocytes,Mo），用96孔板培养诱导生成DCs。
共分成6组，为5个浓度组和1个对照组。
浓度组于培养48小时加入华蟾素，对照组不加华蟾素。
用CCK8检测DCs增殖情况。
选择最适华蟾素浓度于DCs培养的48小时加入。
流式细胞仪检测DCs表型采用直接荧光抗体标记各组DCs，用流式细胞仪检测DCs表面CD40、HLA-DR、CD80和CD86分子的表达。
同种异体混合淋巴细胞反应（MLR）取一健康人外周血常规分离获得淋巴细胞，收获两组培养第7天的DCs，以DCs和淋巴细胞比例分别为1∶20、1∶40、1∶80混合培养，阴性孔不加DCs，置37℃，5%CO2培养箱中孵育96小时，用CCK8检测各组细胞的增值情况，用刺激指数（Stimulatingindex,SI）表示，SI＝实验孔OD490/阴性对照孔OD490。
IL-12检测留取2组培养第7天的DCs上清，用ELISA法检测IL-12的浓度。
统计学方法使用软件，进行自身配对t检验，P＜为有统计学意义。
2结果
华蟾素最适药物浓度收获加入不同浓度华蟾素培养第7天的DCs，用CCK8检测各组DCs的增殖情况。
从曲线可以看出，加入不同浓度华蟾素的各组DCs均较未加华蟾素的DCs生长好，浓度为3×
10-3mol/ml的一组DCs生长最好。
DCs培养过程中形态观察华蟾素组与对照组相比，细胞数相对多，体积相对大，形态相对不规则（见图2）。
华蟾素对DCs表型的影响见表1。
华蟾素组DCs表面分子表达水平比对照组高，其中CD40、CD80和CD86的差异有统计学意义（），HLA-DR的差异无统计学意义（）（见表1）。
华蟾素对DCs刺激同种异体淋巴细胞增殖能力的影响见图3。
DCs加入华蟾素后刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力较对照组强（）。
IL-12检测结果用IL-12ELISA试剂盒检测DCs培养第7天的上清。
华蟾素组DCs和MLR上清中IL-12的含量较对照组高（）。
3讨论
DCs是目前已知的唯一能激活初始型T细胞的、功能最强的抗原提呈细胞（APC），是机体免疫反应的始动者。
在免疫相关性疾病的发病中起重要作用，广泛参与各种自身免疫性疾病、免疫缺陷病、肿瘤、某些炎症反应和移植物排斥反应的病理过程。
研究发现，DCs功能缺陷是一些慢性病毒感染和肿瘤的重要原因之一[4，5]。
我们将华蟾素加入DCs培养液，培养第7天镜下观察发现，华蟾素组细胞比对照组相对多，细胞体积也相对大些，这说明华蟾素对DCs的生长发育有利；
流式细胞仪检测表面分子表达水平显示，加入华蟾素后DCs表面分子的表达水平升高，同种异体混合淋巴细胞反应增强，这些结果提示了华蟾素能上调DCs协同刺激分子的表达，提高DCs的成熟度，增强DCs的作用。
由此推断，华蟾素增强DCs功能可能是增强机体免疫力的重要方面。
IL-12是DCs释放的迄今为止最有效的CTL和自然杀伤细胞活性刺激因子，能刺激它们分泌多种细胞因子，特别是Th1细胞分泌的γ-干扰素，而IFN-γ反过来又可促进DCs功能的成熟和IL-12的分泌，它们之间形成了一个正反馈，最终对DCs诱导Th0向Th1分化起放大作用，在细胞免疫中发挥重要作用[6，7]。
Lohr等用磁珠分选出CD34+造血干细胞，体外诱导生成DCs，将重组IL-12与之共孵育，结果与之共培养T细胞的增殖能力提高了2倍。
我们的实验中加入华蟾素培养的DCs上清中IL-12的含量较对照组有所增高，说明华蟾素对DCs分泌IL-12有利，这也可能是华蟾素增强机体免疫力作用的又一方面。
综上所述，华蟾素能增强正常人外周血DCs的免疫功能，这从DCs角度初步探讨了华蟾素增强机体免疫力的作用机制。
但我们的研究对象是正常人，华蟾素是否也能增强慢性病毒感染和肿瘤患者DCs的功能还有待进一步研究。
【参考文献】
[1]樊万虎，李芝.华蟾素治疗慢性活动型乙型病毒性肝炎临床疗效观察[J].陕西医学杂志,1998,27
（1）:
38-41.
兰云南.华蟾素治疗慢性乙型肝炎远期疗效观察[J].临床肝胆病杂志,2002,18（6）:
374-378.
HartDNJ.Dendriticcells:
uniqueleukocytepopulationswhichcontroltheprimaryimmuneresponse[J].Blood,1997,90（9）:
3245-3251.
BeckebaumS,CicinnatiVR,DworackiG,etal.ReductioninthecirculationpDC1/pDC2rationandimpairedfunctionofexvivogeneratedDC1inchronichepatitisBinfection[J].ClinImmunol,2002,104:
138-142.
BeckebaumS,CicinnatiVR,ZhangX,etal.HepatitisBvirus-induceddefectofmonocyte-deriveddendriticcellsleadstoimpairedThelpertype1responseinvitromechanismsforviralimmuneescape[J].Immunology,2003,109:
487-489.
RossolS,MarinosG,CarucciP,etal.Interleukin-12inductionofTh1cytokinesisimportantforviralclearanceinchronichepatitisB[J].BJClinInvest,1997,99:
3025-3029.
TrinchieriG.Interleukin-12andtheregulationofinnateresistanceandadaptiveimmunity[J].NatRevImmunol，2003,3
（2）:
133-136.
LohrHF,PingerS,BocherWO,etal.ReducedvirusspecificThelpercellinductionbyautologousdendriticcellsinpatientswithchronichepatitisBrestorationbyexogenousinterleukin-12[J].ClinExpImmunol,2002,130:
107-109.
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