华蟾素对正常人外周血来源树突状细胞的影响文档格式.docx
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结论:
华蟾素能增强正常人DCs的功能。
【关键词】树突状细胞华蟾素外周血流式细胞仪酶联免疫吸附试验
[Abstract]Objective:
TostudytheeffectofCinobufotalinonthemorphous,phenotypeandfunctionofdendriticcellsderivedfromperipheralbloodofhealthadults,andtoexplainthemechanismofactionofCinobufotalinfromthemoleculeandcelllevelsofDCs.Methods:
Mononuclearcellsofhealthyadultswereisolatedfromperipheralblood,andwereculturedtoinduceDCswiththecombinationofGM-CSFandIL-4.Usingselfmatched-pairsdesigntwogroupsweredividedintheexperiment:
controlsandCinobufotalin.Onthe7thday,DCsof2groupswereobservedtocomparethedifferencesofthemorphous,theexpressionofsurfacemoleculesonDCsweredetectedbyflowcytometer;
theDCs’capacitiesofstimulatingallogeneiclymphocyteproliferationwasdetectedbycellcountkit8(CCK8),andtheconcentrationofIL-12inthesupernatantsofDCs’cultureswasdetectedbyELISA.Results:
comparedwiththecontrols,theDCsincubatedwithCinobufotalinhadmorematurestate,hadhigherexpressionofsurfacemolecules,andhighercapacitiesofstimulatingallogeneiclymphocyteproliferationandsecretingIL-12.Conclusion:
CinobufotalincanenhancethefunctionofDCsofhealthyadults.
[Keywords]Dendriticcell;
Cinobufotalin;
Peripheralblood;
Flowcytometer;
Enzyme-linkedimmunosorbentassay
华蟾素(cinobufotalin)是由中华大蟾蜍阴干的全皮为原料提取的水溶性制剂,应用于临床治疗乙肝及肝癌已有20多年的历史。
临床应用表明其能显着提高机体的免疫功能[1,2]。
但有关华蟾素作用机制的研究很少,本课题通过研究华蟾素对正常人外周血来源的树突状细胞(DCs)形态、表型和功能的影响,从DCs的分子细胞水平初步探讨华蟾素提高机体免疫功能的作用机制。
1材料与方法
材料
细胞因子和单克隆抗体rhGM-CSF(北京宝赛生物技术有限公司)、rhIL-4(R&
DSystems,Inc)、rhIL-2(南京军事医学科学院)、FITC-CD80鼠抗人单克隆抗体(BioLegend)、PE-CD86、FITC-CD40鼠抗人单克隆抗体(晶美生物工程有限公司)、PE-HLA-DR鼠抗人单克隆抗体、PE和FITC鼠IgG(CALTAGLABORATORIES)。
主要试剂RPMI-1640(Sigma公司)、小牛血清(杭州四季青生物工程有限公司)、淋巴细胞分离液(上海恒信化学试剂有限公司)、IL-12ELISA检测试剂盒(晶美生物工程有限公司)、Cellcountkit8(CCK8,株式会社日本同仁化学研究所中国代表处)。
方法
对象正常人16名,男女各半,为南通大学医学院老师和学生健康志愿者。
外周血DC的体外诱导取正常人外周血常规分离单个核细胞(PBMC),悬浮(浓度为2×
106/ml)后,加入24孔培养板(1ml/孔)。
37℃,5%CO2培养箱中孵育2小时后吸弃上清,轻洗培养板去除非贴壁细胞,即获得贴壁的单核细胞。
每孔加入DC培养液(1640+丁氨卡那霉素+10%小牛血清+IL-4+GM-SCF)1ml,IL-4(500U/ml)、rhGM-CSF(1000U/ml),置37℃,5%CO2培养箱中培养。
华蟾素最适药物浓度选择取一正常人外周血常规分离单核细胞(Monocytes,Mo),用96孔板培养诱导生成DCs。
共分成6组,为5个浓度组和1个对照组。
浓度组于培养48小时加入华蟾素,对照组不加华蟾素。
用CCK8检测DCs增殖情况。
选择最适华蟾素浓度于DCs培养的48小时加入。
流式细胞仪检测DCs表型采用直接荧光抗体标记各组DCs,用流式细胞仪检测DCs表面CD40、HLA-DR、CD80和CD86分子的表达。
同种异体混合淋巴细胞反应(MLR)取一健康人外周血常规分离获得淋巴细胞,收获两组培养第7天的DCs,以DCs和淋巴细胞比例分别为1∶20、1∶40、1∶80混合培养,阴性孔不加DCs,置37℃,5%CO2培养箱中孵育96小时,用CCK8检测各组细胞的增值情况,用刺激指数(Stimulatingindex,SI)表示,SI=实验孔OD490/阴性对照孔OD490。
IL-12检测留取2组培养第7天的DCs上清,用ELISA法检测IL-12的浓度。
统计学方法使用软件,进行自身配对t检验,P<为有统计学意义。
2结果
华蟾素最适药物浓度收获加入不同浓度华蟾素培养第7天的DCs,用CCK8检测各组DCs的增殖情况。
从曲线可以看出,加入不同浓度华蟾素的各组DCs均较未加华蟾素的DCs生长好,浓度为3×
10-3mol/ml的一组DCs生长最好。
DCs培养过程中形态观察华蟾素组与对照组相比,细胞数相对多,体积相对大,形态相对不规则(见图2)。
华蟾素对DCs表型的影响见表1。
华蟾素组DCs表面分子表达水平比对照组高,其中CD40、CD80和CD86的差异有统计学意义(),HLA-DR的差异无统计学意义()(见表1)。
华蟾素对DCs刺激同种异体淋巴细胞增殖能力的影响见图3。
DCs加入华蟾素后刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力较对照组强()。
IL-12检测结果用IL-12ELISA试剂盒检测DCs培养第7天的上清。
华蟾素组DCs和MLR上清中IL-12的含量较对照组高()。
3讨论
DCs是目前已知的唯一能激活初始型T细胞的、功能最强的抗原提呈细胞(APC),是机体免疫反应的始动者。
在免疫相关性疾病的发病中起重要作用,广泛参与各种自身免疫性疾病、免疫缺陷病、肿瘤、某些炎症反应和移植物排斥反应的病理过程。
研究发现,DCs功能缺陷是一些慢性病毒感染和肿瘤的重要原因之一[4,5]。
我们将华蟾素加入DCs培养液,培养第7天镜下观察发现,华蟾素组细胞比对照组相对多,细胞体积也相对大些,这说明华蟾素对DCs的生长发育有利;
流式细胞仪检测表面分子表达水平显示,加入华蟾素后DCs表面分子的表达水平升高,同种异体混合淋巴细胞反应增强,这些结果提示了华蟾素能上调DCs协同刺激分子的表达,提高DCs的成熟度,增强DCs的作用。
由此推断,华蟾素增强DCs功能可能是增强机体免疫力的重要方面。
IL-12是DCs释放的迄今为止最有效的CTL和自然杀伤细胞活性刺激因子,能刺激它们分泌多种细胞因子,特别是Th1细胞分泌的γ-干扰素,而IFN-γ反过来又可促进DCs功能的成熟和IL-12的分泌,它们之间形成了一个正反馈,最终对DCs诱导Th0向Th1分化起放大作用,在细胞免疫中发挥重要作用[6,7]。
Lohr等用磁珠分选出CD34+造血干细胞,体外诱导生成DCs,将重组IL-12与之共孵育,结果与之共培养T细胞的增殖能力提高了2倍。
我们的实验中加入华蟾素培养的DCs上清中IL-12的含量较对照组有所增高,说明华蟾素对DCs分泌IL-12有利,这也可能是华蟾素增强机体免疫力作用的又一方面。
综上所述,华蟾素能增强正常人外周血DCs的免疫功能,这从DCs角度初步探讨了华蟾素增强机体免疫力的作用机制。
但我们的研究对象是正常人,华蟾素是否也能增强慢性病毒感染和肿瘤患者DCs的功能还有待进一步研究。
【参考文献】
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LohrHF,PingerS,BocherWO,etal.ReducedvirusspecificThelpercellinductionbyautologousdendriticcellsinpatientswithchronichepatitisBrestorationbyexogenousinterleukin-12[J].ClinExpImmunol,2002,130:
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