香菇母种液体培养Word格式文档下载.docx
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TangLinLin
Abstract
Theexperimenttheopeningoffreshmushroomsnotthefruitbodyandsporesfortestmaterials.ThesporesandnoJunZientitydilutionsofvaccinationtothesamepotatoesareliquidmedium,Atthesamespeedwavebedtraining,recordtime,withhyphaegerminationhyphaeofmediaconcentration（time,hyphaethanturbiditymethod）,hyphaedegreesstrainscomprehensiveanalysisofthedegreeofquality.
Testresultsindicatethatusingthesporestobreedingthanamoreidealcafasystem.
Touseliquidwavebedlegalkindofpollutionrateislow,kindofshorttime,eatmaterialcapability,highqualityofstrainshyphaehascertainrejuvenationandreducetheroleoftraditionalbreedingrateofpollutionandlowyieldpotential,bigtime.
Keywords:
mushrooms;
Motherspecies;
Liquid;
Wavebe
目录
摘要1
Abstract2
目录3
前言4
1香菇制种的选材5
1.1子实体5
1.2孢子的提取6
2香菇母种液体培养方法6
2.1香菇母种液体培养的主要原理6
2.2常用的香菇母种培养的方法及其作用6
2.2.1根据营养物质的成分分类6
2.2.2根据培养基的状态分类7
3.传统固体制种培养基的特点8
3.1优点8
3.2缺点8
4.液体培养基的配方8
4.1此次试验液体培养基的配方8
4.2液体培养基的可行性9
5.试验操作9
5.1培养基的制作：
9
5.2接种9
5.3调节适应生长环境11
5.4注意事项11
6结果分析11
7结论12
致谢12
参考文献12
前言
香菇（mushrooms）是世界第二大食用菌，也是我国特产之一，在民间素有“山珍”之称。
香菇富含维生素B群、铁、钾、维生素D原（经日晒后转成维生素D）、味甘，性平。
主治食欲减退，少气乏力。
香菇属于真菌界，伞菌目，口蘑科，香菇属。
香菇栽培始源于中国，至今已有800年以上的历史。
香菇的砍花栽培源于中国，现行的段木纯菌丝接种栽培则源于日本。
至1989年，我国香菇总产首次超过日本，一跃成为世界香菇生产第一大国[1]。
香菇子实体（Mushroomsfruitbody）单生、丛生或群生，菌盖直径5-12cm，有时可达20cm，幼时半球形，后呈扁平至稍扁平，表面菱色、浅褐色、深褐色至深肉桂色，中部往往有深色鳞片，而边缘常有污白色毛状或絮状鳞片。
菌肉白色，稍厚或厚，细密，具香味。
菌盖下面有菌幕，后破裂，形成不完整的菌环。
菌褶白色，密，弯生，不等长。
菌柄常偏生，白色，弯曲，长3-8cm,粗0.5-1.5
（2）cm,菌环易消失，白色。
孢子印（Sporeseal）白色。
孢子光滑，无色，椭圆形至卵圆形，4.5-7×
3-4μm，用孢子生殖。
生态环境：
冬春季生于阔叶树倒木上,群生,散生或单生。
分布地区：
山东、河南、浙江、福建、台湾、广东、广西、安徽、湖南、湖北、江西、四川、贵州、云南、陕西、甘肃。
香菇是具有高蛋白、低脂肪、多糖、多种氨基酸和多种维生素的菌类食物[2]。
1.提高机体免疫功能：
香菇多糖可提高小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能，还可促进T淋巴细胞的产生，并提高T淋巴细胞的杀伤活性。
2.延缓衰老：
香菇的水提取物对过氧化氢有清除作用，对体内的过氧化氢有一定的消除作用。
3.防癌抗癌：
香菇菌盖部分含有双链结构的核糖核酸，进入人体后，会产生具有抗癌作用的干扰素。
4.降血压、降血脂、降胆固醇：
香菇中含有嘌呤、胆碱、酪氨酸、氧化酶以及某些核酸物质，能起到降血压、降胆固醇、降血脂的作用，又可预防动脉硬化、肝硬化等疾病。
5.香菇还对糖尿病、肺结核、传染性肝炎、神经炎等起治疗作用，又可用于消化不良、便秘等[3]。
1964年中国开始进行人工栽培食用菌，1979年开始使用木屑袋栽技术，1990年使用野草栽培技术，先如今不断完善，开始使用液体栽培技术[4]。
香菇母种传统的制种工艺将母种直接接入原种培养基中，经多年制种实践，总结出将母种先接入液体培养基，采用液体浅层培养技术，再将菌丝体接入原种培养基中。
用此方法制种成功率高，而且发菌快，吃料能力强，菌丝粗壮、浓白[5]。
更重要的是还对菌株有一定的复壮作用，它适用于大多数食用菌菌种的制作。
减轻了传统制种中污染率大、产量低、制种时间长等问题[6]。
此次实验用马铃薯液体培养基（Potatoliquidmedium）对香菇的孢子和子实体在特定条件下的摇床中进行培养。
用实验结果（培养基的澄清度,菌球形态,菌丝球个数,菌体干重等）[7]，证明孢子或子实体培养的那一方法更利于高效培养香菇母种。
结合实验数据作出对比，得出结论。
1香菇制种的选材
在晴天下午采摘已成熟还未开幕的长势良好的香菇，如果没有次类条件的可在市场或超市购买，但必须较为新鲜，菌体较为完整，七八成熟，菌幕还未打开，这样更利于对孢子的收集。
1.1子实体
取新鲜香菇，清洗干净，切取菌柄，在无菌操作台中，用75%的酒精对子实体表面进行消毒灭菌处理，放入无菌操作盘中，用无菌刀从中部剖开，从里部切取长2mm的立方体若干，装入小烧杯中待用。
让烧杯处于无菌环境中。
且不能放置太久。
1.2孢子的提取
2.2.1将新鲜的子实体用刀片齐菌褶把菌柄切断，然后把菌盖扣在白纸上（有色孢子）或黑纸上（白色孢子），也可把一半白纸和一半黑纸拼粘成一张纸而将菌盖扣于上面，再用玻璃罩扣上。
经过2至4小时，担孢子就散落在纸上，从而得到了l张与菌褶或菌管排列方式相同的孢子印。
2.2.2将用来接收孢子的纸折迭起来，在中央剪出一个适合的圆孔。
再把菌柄插入洞内，使菌褶紧贴纸上。
然后再将子实体连同纸一起放在盛有半杯水的小杯口上，此法可加速孢子印的接收。
2香菇母种液体培养方法
2.1香菇母种液体培养的主要原理
在发酵罐或三角瓶中加入液体培养基，通入无菌空气以增加培养基中的溶氧量，提供食用菌菌丝体的呼吸代谢所需要的氧气。
同时加以搅拌或振荡并控制适宜的外界条件等[8]。
2.2常用的香菇母种培养的方法及其作用
2.2.1根据营养物质的成分分类：
a.天然培养基：
培养基利用天然有机物配制而成。
材料来源广，成本低，制作简单，在生产栽培广泛使用。
如马铃薯培养基、豆芽汁培养基、麦粒培养基、草粪培养基等。
b.半合成培养基：
在天然培养基中添加无机盐或在合成培养基中添加少量有机物。
这类培养基是根据不同菌类菌丝生长的需要而改良的，有利于促进菌丝生长。
如马铃薯培养基增加硫酸镁0.5克，磷酸二氢钾0.6克，维生素B15毫克时草菇菌丝生长特别旺盛。
组分
质量份
蒸馏水
1000ml
马铃薯
200g
蔗糖
20g
硫酸镁
0.5g
磷酸二氢钾
0.6g
维生素B1
5mg
c.合成培养基：
培养基成分明确、稳定。
适合试验、母种分离、菌种贮藏使用。
适合各种菇类菌丝生长及保种。
葡萄糖
琼脂
蛋白胨
2g
磷酸二氢钾
0.46g
磷酸氢二钾
1g
硫酸镁
2.2.2根据培养基的状态分类：
a.液体培养基：
这类培养基不加凝固剂，不保留固态物，多用化合物或固态物的煮汁制成。
在这种培养基中，菌丝生长快速，而且可以根据培养菌丝体的需要中途补充养分及调节酸碱度，最适合工业发酵用。
氯化钙
0.1g
微生素B1
0.5
b.固体培养基：
培养基加入凝固剂或固态物质制成的培养基，有较稳定的形态。
（1）琼脂培养基：
1.斜面培养基。
这种培养基可以增大菌丝的扩展面，可以观察菌丝体的生长状态。
但由于培养基浅薄，易失水，故保存菌种的时间不长。
2.直管琼脂培养基。
这种培养基不摆斜面，基质深厚，保持养分、保水性好，适合菌种保藏使用。
（2）草料、麦粒、棉子壳、木屑、甘蔗渣等固形物配制的培养基。
（3）种木培养基。
把树木或木材制成1.2—1.5厘米长，1.5—2厘米粗的木段，或圆柱状、或锲状、或圆饼状拌入木屑、麸皮制成。
接种时取木段种接入段木或袋料中。
3.传统固体制种培养基的特点
3.1优点：
3.1.1发酵培养基中没有游离水的流动，适宜于水活度在0.93～0.98的微生物生长，限制了应用范围，同时也限制了某些杂菌的生长。
3.1.2固态发酵中培养基提供的与气体的接触面积大，供氧充足，同时，空气通过固体层得阻力较小，能量消耗低。
3.1.3使用固体原料，在发酵过程中，糖化和发酵过程同时进行，简化操作工序，节约能耗。
3.1.4由于产物浓度高，提取工艺简单可控，没有大量有机废液产生，但提取物含有底物成分。
3.2缺点：
3.2.1底物浓度存在梯度，发酵不均匀，菌体的生长、对营养物的吸收和代谢产物的分泌存在不均匀。
3.2.2机械化程度较低，缺乏在线传感仪器，过程控制较困难。
3.2.3接种时操作时间长，增加染菌率。
4.液体培养基的配方
4.1此次试验液体培养基的配方：
具体制作方法是：
将200g马铃薯去皮，去芽眼，切成小条放入铝锅中，加入1000mL水，煮沸10～20分钟左右至马铃薯软而不烂时，用6～8层纱布过滤，取滤汁于锅中，补水至1000mL，再加入糖搅拌均匀，趁热分装于试管中。
4.2液体培养基的可行性：
液体培养基因营养物质分布均匀，与菌体表面接触充分，还能大量溶解微生物的代谢产物等优点，广泛用于微生物的生理、代谢研究以及大规模的工业化生产中。
5.试验操作
其做法是称取200g马铃薯，洗净去皮切成小块，加水煮到酥而不烂（煮沸10~20分钟，能被玻璃棒戳破即可），用四层纱布过滤，再据实际实验需要加葡萄糖，继续加热搅拌混匀，稍冷却后再补足水分至1000毫升，分装三角烧瓶，加塞、包扎，（121℃）灭菌20分钟左右后取出，冷却后贮存备用。
5.2接种
5.2.1接种子实体
提前半小时打开接种室的紫外灯，如长时间没用超静工作台，可用75%酒精檫拭台面和壁面。
提前十五分钟打开超静工作台的紫外灯和风机。
准备试验器材，将其放入工作台中，用75%的酒精对手部进行消毒处理，点燃酒精灯。
把酒精瓶中的镊子放在酒精灯的外焰上反复灼烧，后伸入接种瓶中的瓶壁进行冷却处理，用小指和无名指将装有培养基的试管棉塞在酒精灯外的无菌处打开，用镊子将相同体积的子实体接种在培养基中，让子实体处于半漂浮状态。
把棉塞在酒精灯外焰进行旋转灭菌处理后，迅速封住试管。
标注好名称、时间、编号等。
依次进行如此操作三次。
5.2.2接种孢子
a.种菇选择：
最好选秋菇的二潮菇，在高产的床面上，选取菇形圆整，色泽纯正，菌肉结实，菇柄粗壮的菇，一般菌盖直径6-8cm，鲜菇单重100-150克。
七八成熟，菌膜不能破，如菌膜已破，难以进行表面灭菌，对分离工作不利。
b.表面灭菌，将种菇的菌柄剪去2/3，在清水中洗去粘附的污物，然后浸入0.1%升汞溶液处理2分钟，取出后，用灭菌水冲洗2-3次，表面灭菌处理的时间不能太长，以防升汞溶液透过菌膜渗入菌体内，杀伤孢子。
然后，用灭菌纱布或灭菌滤纸吸干菌体表面水分，即可进行分离。
c.弹射分离。
分离前，要准备的弹射分离装置。
用一个直径13cm的大培养皿（或搪瓷盘）作为底盘，上面放一个直径9cm的小培养皿（来收集孢子），小培养皿内放一个不锈钢支架（供插种菇用），上面加盖玻璃钟罩。
然后将整个分离装置用双层纱布包好，在0.15兆帕压力下灭菌45分钟备用。
分离时，在无菌室（箱）内打开钟罩，将种菇的菌柄插在支架上，加盖钟罩后，在钟罩下部放一道纱布或脱脂棉，倒入0.1%升汞溶液，以纱布（脱脂棉）浸湿为度。
主要是防止杂菌侵入及维持分离装置内的相对湿度。
然后将分离装置移至18-20℃处培养1-2天，种菇开伞弹射孢子，若室温为20℃，通常在16小时后即有孢子弹射，培养皿内沉积的孢子，由淡咖啡色转为咖啡色时，应停止弹射。
终止弹射分离后，用纱布蘸取0.1%升汞溶液，擦洗分离装置的外部，移入灭菌室（箱）内，取出种菇，在落有蘑菇孢子的培养皿上，加盖培养皿盖，供稀释分离或保藏用[9]。
此次实验我们用稀释分离法对孢子进行接种，通过不断稀释孢子悬浮液，
孢子分散最终孢子浓度控制在300-500个孢子/毫升,吸取0.1毫升的孢子液注入液体培养基表面，分散孢子各自萌发形成单孢菌落，其步骤如下：
①制备无菌水试管:
取10支试管,其中1支装10毫升蒸馏水,其它9支装9毫升蒸馏水,经高压灭菌即成无菌水。
②制孢子悬液：
取一小块收集有孢子的滤纸条，浸入10毫升无菌水试管中,摇振使孢子分散成悬液,用无菌1毫升移液管吸取1毫升孢子悬液于第2支试管中,摇振使其混匀,再从第2支试管中吸取1毫升注入第3支试管中,如此反复稀释直到孢子浓度达到300-500个孢子/毫升,接种。
吸取0.1毫升的孢子液注入液体培养基表面，分散孢子各自萌发形成单孢菌落，标住好名称、时间、编号等。
如此操作三次。
把上述的接种后的子实体和孢子共六支试管放入已调节好的摇床中，进行培养，每三天观察记录一次，直到菌丝体较为良好的萌发出来。
为增加实验的科学性和可信度，再如此重复操作三次。
排除试验的偶然性。
5.3调节适应生长环境
摇床震荡的频率为130/min，培养温度为28℃，培养时间为9天[10]。
5.4注意事项
无菌操作必须过关
接种器具禁止放置在操作台上
分离孢子的装置需做好灭菌工作
稀释孢子液应在超净工作台上进行，避免杂菌进入。
滴入孢子液时应注意与液体培养基的融合状态，如果太深则影响孢子的繁殖与萌发
如有被污染的试管应即时取出，在高湿，高温不通风的条件下更容易受霉菌污染，应及时避免。
试验过程中应做好记录工作，为试验数据提供条件，打下基础。
6结果分析
经试验后得到以下数据，分别为5月12日、19日、29日用孢子培养出的培养液和用子实体培养出的培养液的吸光度：
孢子
子实体
0.866
0.851
0.884
0.875
1.043
0.987
1.938
1.661
由表中可得：
稀释的倍数越小其吸光度越大，孢子的吸光度明显大于子实体的吸光度。
初步证明孢子萌发的菌丝比子实体萌发的菌丝多、浓。
0.836
0.850
0.883
0.871
1．012
0.965
1.903
1.650
由表中所得：
此时间段的吸光度在前两次的吸光度相差并不是很大，后两次的吸光度相差较为明显，总体结果孢子的吸光度大于子实体的吸光度。
0.845
0.852
0.882
0.869
1.035
0.972
1.927
1.658
前一次孢子的吸光度小于子实体0.007，但后三次孢子的吸光度明显大于子实体的吸光度。
证明孢子萌发的菌丝比子实体萌发的菌丝多、浓。
从取用量来说相同的香菇用孢子制种更为经济，孢子的取用量是占总孢子量的1/80000。
（开始取用接收孢子的滤纸的1/4，稀释1000倍，后取孢子液的1/20进行接种。
）跟子实体相比利用率更大。
经显微镜镜检，三次试验所得孢子的菌丝都比子实体的菌丝粗壮。
7结论
经所得数据分析证明用孢子为原材料置于马铃薯液体培养基中进行摇床培养比子实体制种更为理想。
致谢
特别感谢张敬慧老师对此次试验的特别指导。
感谢学校实训中心为此次试验提供条件、感谢李俊强博士传授给我们写作论文的步骤和经验、感谢赵军老师为此次实验提供的药用摇床、感谢辜义洪老师对我们论文的关心和支持、没有你们，我们的试验都不可能顺利的开展，真诚感谢！
参考文献
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科学技术出版社.1989：
4
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化学工业出版社.2011：
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