定量PCR技术Word格式文档下载.docx
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目前已经建立的定量PCR方法较多，但根据其定量所选择标准可分的外参标法及内参标法两大类。
其中外参标法中主要有PCR产物的直接定量法，极限稀释法；
内参标法中主要有同步扩增法和竞争性PCR等。
（一）外参标法
1.PCR产物的直接定量法
1.1原理：
以已知不同浓度的同种模板的系列品作为外参照品，在相同条件下与待测模板一起进行PCR扩增，通过比较待测样品与参照品的扩增结果，推断出待测样品中原始模板量，扩增产物可通过电泳扫描[34]、放射性自显影[33，35]及杂交显色[30，31，32]等方法测定，由于此法简单、易行，故许多研究者乐于用来进行定量分析。
但有3点值得注意：
①由于扩增效率的差异，对样品间（管间）PCR产物作定量不够准确。
②PCR产物的定量务必在对数期进行。
因为在平台期扩增产物的积累量不受起始模板量的影响。
③待测样品中原始模板与外参照品中原始模板在数量上相近或相等定量效果最佳。
1.2PCR的要求
1.2.1模板的制备：
从组织、细胞或各种体液中提取DNA或RNA模板，严格防止污染，并用紫外吸收法测定核酸含量及判定其纯度。
1.2.2引物的设计及合成：
设计及合成PCR扩增靶基因的特异性引物，引物可进行生物素或荧光素的标记。
1.2.3外参照的设置：
外参照模板一般是可以准确定量的含靶基因的质粒、细菌或病毒感染的细胞。
一般要求外参标模板与待测模板的扩增效率尽可能相同或相近。
质粒可以通过紫外光的吸收定量，细菌可用菌落形成的数量定量，细胞常用细胞计数仪定量。
标准品应为含不同拷贝（1-105）靶基因的系列品，并在PCR扩增中看到2倍的差别。
1.2.4PCR扩增：
PCR产物应在对数增长期定量，故PCR的循环次数一般不能超过20次。
1.3分类：
根据PCR产物的测定方法可分为电泳扫描及探针杂交法等。
1.4方法：
1.4.1电泳扫描法：
根据PCR产物的大小及分离的要求，可以对PCR产物作琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳。
然后可对PCR产物作以下处理。
①EB染色法：
PCR产物遇EB后，在紫外光照射下产生荧光。
找出待测品与系列参照品中对应荧光强度的条带，二者所对应的原始模板数应该是相等的。
如果待测品条带的荧光强度大于参照品中的最大荧光强度，就应该对待测样品作适当稀释后重复测定。
如果待测品的荧光条带看不到，可稀释参照品的浓度，并适当增加PCR的循环次数。
本方法操作简单、易行。
如采用本所生产的GQS-960型定量扫描系统，便可实现定量检测的自动化。
该方法不足之处是敏感度有限，对低拷贝数的模板，常要求PCR扩增的循环数较多。
②荧光测定：
为了提高检测的敏感度，尤其是要求定量在指数增长期进行，常常在引物中标记了荧光素，通过检测电泳条带中荧光的强度判断待测样品中原始模板数。
缺点是造价高，需特殊设备。
③放射性强度测定：
是通过在PCR产物中掺入放射性同位素（32p）标记的dATP，检测PCR产物电泳条带中的放射性强度来实现定量的。
敏感度高，但对机体有损害。
1.4.2探针杂交法
通过对PCR产物的探针杂交，提高检测的特异性；
在探针上标记同位素或酶等，提高了检测的敏感度。
1）Southern杂交法[33,121]
将PCR产物作聚丙烯酰胺凝胶电泳，再将产物转移至硝酸纤维素膜上，然后作预杂交及标记探针杂交，最后进行放射性自显影或酶显色。
根据待测样品显影或显色斑块的大小，找出相对应大小的标准品管，推断出待测样品中靶基因的拷贝数。
2）微孔板中的杂交显色法[30,39]
利用计算机分析系统设计PCR引物，在一条引物的5'
-端结合生物素，在PCR产物的特异性杂交探针上标记辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（APK）。
将PCR产物与预先包被有亲和素的微孔板壁结合，用碱变性除去一条链，然后加入特异性探针作杂交，洗涤后加入酶的底物进行显色。
同时设立外参照标准，根据待测样品的光吸收度求出待测样品中模板拷贝数。
本方法不需对PCR产物作电泳分析；
由于采用了探针杂交对PCR产物作进一步鉴定，提高了检测的特异性；
在特异性杂交探针上结合了酶，利用酶促放大作用分析结果，保证了PCR扩增产物在对数期内定量的敏感性。
3）利用PCR扩增到达平台期（threshold）时所对应的循环次数（cycles）值（Ct）定量。
①定量的原理
近期，美国PE公司推出了7700型定量PCR仪及TaqMan定量PCR试剂盒。
其对核酸进行定量的依据是在PCR扩增某一特定基因时，反应体系中原始模板数愈多，到达平台期所需的循环数愈少；
原始模板数愈少，到达平台期所需的循环次数愈多。
将不同浓度的原始模板数对PCR扩增到平台期所需的循环次数（Ct值）作图，便得到一个标准曲线，如果知道了某一基因在相同条件下扩增到平台期所需的循环次数，便知道了其在反应体系中的原始模板数。
②方法
TaqMan定量PCR试剂盒是在常规PCR试剂盒的基础上增加了一个寡核苷酸探针，这个探针带有一个荧光发光分子和一个荧光淬火分子，完整的探针在激光激发下，发光分子所产生的荧光被淬火分子全部吸收，样品无荧光。
而在PCR扩增过程中，Taq酶分子在链延伸过程中可以通过自身的5'
-3’核酸外切酶活性降解与模板结合的特异性荧光探针，使得荧光发光分子从探针上切下来而与荧光淬火分子分开，从而在激光激发下产生特定波长的荧光，这种荧光随PCR扩增过程而动态增强。
7700型定量PCR仪通过全过程动态监测，可以得到每一样品实际扩增曲线，并找到PCR扩增的对数期，软件通过标准样品和待测样品的对数期比较，很容易得到每一样品中特定模板的起始拷贝数。
③特点特异性强：
采用与靶基因互补的荧光探针，使特异性PCR扩增时才产生荧光信号，而非特异性扩增不产生信号，特异性比常规PCR更强；
稳定性高：
PCR反应及其产物的检测同步进行，整个过程不需打开试管盖，实现了自动化，污染机会少，实验具有良好的重复性；
线性范围广：
定量的动态范围达5个数量级。
因而相差较大的DNA起始拷贝数也不需稀释；
工作效率高：
一次定量96个样品仅需1-2小时。
但仪器及配套试剂极其昂贵。
2.极限稀释法[36,37]
2.1原理：
从理论上，在适宜的条件下，只要PCR反应体系中存在一个拷贝的DNA分子，经过30-40次循环的PCR扩增后即可被检出。
但实际工作中模板数一般大于1。
在定量PCR中，通过稀释阳性样品直至靶基因不能再扩增为止，同时设置已知浓度的参照品，根据阳性结果的最大稀释度及内参标或外参标的极限检出底线，计算出待检标本中原始模板的分子数。
此方法的优点是不需特殊设备。
但要取得可靠结果必须把握以下几点：
①PCR产物的最低可检测极限必须具有重复性。
②对每个稀释度必须作多次PCR，一般先对模板DNA作10倍连续稀释后作PCR，首先找到PCR结果呈阴性的接近稀释点，然后再对各稀释度作系列的2倍稀释，每个稀释点作5次PCR。
③必须严格控制污染，因为假阳性会使结果产生极大误差。
2.2方法
①将参照品与待测样本依次作10倍稀释进行PCR扩增，找出PCR结果呈阴性的接近稀释点。
②然后再对10倍释稀的最低检出线依次作2倍稀释，得到参照品及待测标本阳性结果的最大稀释度。
③在相同的PCR扩增条件下，待测样品的最低检出线应等同于参照品的检出下线。
从而计算出待测样品中原始模板数。
（二）内参标法
1.非相关模板同等扩增法[38,43]
在同样的条件下，在同一试管内同步扩增来自同一DNA的一段靶序列及另一段内参标序列（看家基因）或与靶基因无关的已知模板。
内参标序列的扩增可以校正诸如DNA量、可扩增性及不同管间扩增效率的差异。
通过比较两种序列的扩增量可对靶基因定量。
只有当靶序列与内参标序列以相同效率扩增时才能获得理想的结果，这取决于选择不同引物最佳配比的经验。
由于扩增效率的差异常发生在PCR扩增的终末期，故应在指数扩增期对产物作分析，因此循环次数及初始模板量对结果的影响甚为重要。
只有当靶序列和内参标序列以相同的量存在时，才能对靶序列作定量，此方法很适用于单基因缺失的检测[122]。
1.2方法：
①设计并合成PCR扩增靶基因及无关基因的引物，优化引物配比的条件。
②在指数增长期实现对靶基因及一系列已知含量无关基因的PCR扩增。
③PCR产物琼脂糖凝胶电泳，EB染色。
④电泳条带的紫外光下分析。
⑤二者荧光强度相等管的DNA含量亦相等。
如果以同一DNA的看家基因作参照，则用于判断靶基因的缺失。
2.竞争性定量PCR
2.1原理[112,123]：
即在完全相同的反应条件下，使靶序列与参照序列同步扩增。
参照模板与靶序列共用同一对引物，故又称为竞争模板。
对竞争模板通常作系列稀释后加入到恒定量的样品DNA中，反之亦然。
靶DNA的扩增量取决于添加的竞争性DNA的量，一般应尽可能使二者PCR终产物的摩尔数相等，根据竞争性模板被抑制的程度推断靶基因的量。
由于竞争模板与靶序列使用同一引物参与同一扩增反应，所以两种扩增产物的相对含量便反映了竞争模板与靶序列在初始反应混合物中的相对浓度。
2.2竞争性模板的设置：
通常情况下，通过改变克隆的靶基因的序列来设计竞争性模板，例如插入一个新的限制性酶切位点或使原来的酶切位点缺失，或通过基因重组技术插入一个与特异性蛋白结合的DNA片段，或者使靶序列发生定点诱变，也可以人工合成竞争性模板。
竞争性模板如此设计的目的是为了使其与靶基因的PCR扩增产物相区别（酶切、杂交、显色等）。
但无论哪种情况的设计，都应该尽可能地缩小竞争性模板与靶序列的差异，以便最大限度地降低扩增效率的系统误差。
故竞争性模板一般都是在靶基因序列基础上发生某种诱变获得的。
2.3定量的基本条件：
竞争性PCR定量的基本条件是靶序列和竞争性序列均用相同的引物并以相同的效率扩增。
这样，在指数扩增期内靶序列与竞争性序列的初始比值在整个反应过程中保持不变。
设定靶序列和竞争序列在开始扩增时的分子数为T0和C0，经n次扩增后，达到Tn和Cn，那么log（Tn/Cn）应为一常数。
如果竞争性序列和靶序列的原始模板数及扩增效率均相同，则Tn/Cn始终等于1，不受循环次数的影响，适应于对扩增产物作绝对定量。
事实上在多数情况下，靶序列与竞争性序列的量并不能完全相等，故常选择指数扩增期的竞争性PCR对待测模板作相对定量。
2.4竞争性定量PCR的分类：
根据竞争性模板与靶基因的PCR产物区别的方法可分为杂交法、酶切法等。
2.4.1限制性内切酶切割法[45]
竞争性模板的制备：
如果靶基因中含有某种限制性内切酶的单一切点，或不含任何限制性内切酶的作用位点，通过定点诱变使该限制性内切酶的作用位点缺失或使其增加一个新的限制性内切酶的作用位点，然后将其克隆入pUC或pGEM中，得到竞争性内参标模板。
竞争性PCR扩增：
将一系列已知浓度的竞争模板分别与一系列不同倍数稀释的待测模板混合，作竞争性PCR扩增。
对PCR产物作限制性内切酶的切割及酶切产物的琼脂糖凝胶电泳，EB染色。
同时设标准品系列对照。
结果判断:
于紫外光下观察各泳道的电泳条带数及其荧光强度，并与标准品作对照，找出靶基因与竞争性模板荧光强度相同的标准管，该标准管中靶基因的初始量与待测管中待测模板的初始模板数应相同。
2.4.2杂交检测法[39,43,44]
竞争性模板及杂交探针的制备：
通过定点诱变在靶基因序列中造成部分序列缺失或增加部分序列，作克隆及测序。
针对该突变序列设计杂交探针，并进行标记（同位素，酶，地高率等）。
竞争性定量PCR标准曲线的建立：
在同一试管内竞争性扩增靶基因及内参标模板，对PCR产物作探针杂交，测定内参标模板的扩增量。
根据已知量的靶基因抑制已知量内参标模板扩增的程度，建立竞争性定量PCR的标准曲线。
待测样品的定量：
先需利用PCR扩增估计待测模板的浓度范围，然后调节其浓度（与竞争模板浓度相等或相近）作竞争性PCR，从标准曲线查其浓度。
2.4.3改变竞争性模板的长度
本方法中竞争性模板可以是重组的或人工合成的[41,42]。
在制备竞争模板时，在两条引物结合区间内引入或缺失部分序列，使得靶基因与竞争性模板的PCR扩增产物的分子大小不同，在普通琼脂糖凝胶电泳中出现相互分离的条带。
由于两种模板在初始反应体系中比例不同，相等几率扩增后产物量亦不同。
当竞争性模板与标本中模板量基本相等时，两模板扩增产物的量也相当，琼脂糖电泳条带的密度相等，这时初始反应体系中竞争模板的量就相当于靶基因的量，从而达到定量的目的。
但这种人工合成的模拟内参标模板，有可能影响其PCR扩增的效率。
（三）RNA的定量检测
相对与DNA的定量情况，对RNA的定量已广泛应用。
这种PCR程序已被用于检测体液中RNA病毒的含量及分析mRNA的瞬时表达。
然而由于RNA需先将其反转录成cDNA后再进行定量，故除了影响DNA定量的各种因素外尚需有逆转录效率差异的问题。
有报道说cDNA合成步骤的效率是变化不定的，介于5%-90%之间,cDNA片段的扩增产量在重复试验之间的变化甚至高达6倍[46]；
加之RNA的不稳定性，这使得RNA的准确定量困难重重。
为此应采取以下措施：
①确保总RNA的制备、逆转录和扩增等关键步骤的完善性。
②根据RNA含量的已知差异来检测样品，并定期评估这些相对差异。
③将RNA序列与一个内对照一起扩增，比较RNA与对照RNA的比例。
内对照可以是外源性的mRNA，也可以是内源性的mRNA。
关于内参照RNA模板的选择和构建与DNA内参照品的制备基本相同。
常用的方法有cDNA内参标定量PCR，mRNA内参标定量PCR及PCR辅助的转录物滴定试验（PCRaidedtranscripttitrationassayPATTY）[45,124],即利用目的mRNA上单个碱基的改变造成一个新的酶切位点，将两mRNA共同逆转录和PCR扩增后,用合适的限制性内切酶对产物进行消化，内参标模板将会被切成两个片段，在琼脂糖凝胶电泳中与目的DNA分开。
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