核酸电泳相关试剂缓冲液配制方式文档格式.docx
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溶液见光或高温灭菌后会变黄。
变黄时也可利用,但变黑时不要利用。
溴乙锭(10mg/ml)
组份浓度10mg/ml溴乙锭
配制量100ml
1g溴乙锭,加入到100ml容器中。
2.加入去离子水100ml,充分搅拌数h完全溶解溴乙锭。
3.将溶液转移至棕色瓶中,室温避光保留。
0.5g/ml。
注意:
溴乙锭是一种致癌物质,必需警惕操作。
Agarose凝胶
配制方式1.配制适量的电泳及制胶用的缓冲液(一般是×
TBE或1×
TAE)。
2.根椐制胶量及凝胶浓度,准确称量琼脂糖粉,加入适当的锥形瓶中。
3.加入必然量的电泳缓冲液(总液体量不宜超过锥形瓶的50%容量)。
注:
用于电泳的缓冲液和用于制胶的缓冲液必需统一。
4.在锥形瓶的瓶封上保鲜膜,并在膜上扎些小孔,然后在微波炉中加热熔化琼脂糖。
加热进程中,当溶液沸腾后,请戴上防热手套。
警惕摇动锥形瓶。
使琼脂糖充分均匀熔化。
此操作重复数次,直至琼脂糖完全熔化。
必需注意,在微波炉中加热时刻不宜太长,每次当溶液起泡沸腾时停止加热,不然会引发溶液过热暴沸,造成琼脂糖凝胶浓度不准,也会损坏微波炉。
熔化琼脂糖时,必需保证琼脂糖充分完全熔化,不然,会造成电泳图像模糊不清。
60℃左右,如需要可在现在加入溴乙锭溶液(终浓度µ
g/ml)。
并充分混匀。
溴乙锭是一种致癌物质。
利用含有溴乙锭的溶液时,请戴好手套。
6.将琼脂糖溶液倒入制胶模中,然后在适当位置处插上梳子。
凝胶厚度一样在3~5min之间。
7.在室温下使胶凝固(大约30min~1h),然后放置于电泳槽中进行电泳。
凝胶不当即利历时,请用保鲜膜将凝胶包好后在4℃下保留,一般可保留2~5天。
琼脂糖凝胶浓度与线形DNA的最正确分辨范围
琼脂糖浓度
最佳线形DNA分辨范围(bp)
%
1,000~30,000
800~12,000
500~10,000
400~7,000
200~3,000
50~2,000
6×
LoadingBuffer(DNA电泳用)
组份浓度
30mM
EDTA
36%(V/V)
Glycerol
%(W/V)
XyleneCyanolFF
BromophenolBlue
配制量500ml
配制方式1.称量以下试剂,置于500ml烧杯中。
250mg
2.向烧杯中加入约200ml的去离子水后,加热搅拌充分溶解。
3.加入180ml的甘油(Glycerol)后,利用2NNaOH调剂pH值至。
4.用去离子水定容至500ml后,室温保留。
10×
LoadlngBuffer(RNA电泳用)
组份浓度
10mM
50%(V/V)
配制置10ml
配制方式1.称量以下试剂,置于10ml离心管中。
0.5MEDTA
200µ
l
25mg
2.向离心管中加入约4ml的DEPC处置水后,充分搅拌溶解。
3.加入5ml的甘油(Glycerol)后,充分混匀。
10ml后,室温保留。
四、核酸、蛋白质杂交用相关试剂、缓冲液的配制方式
20×
SSC
组份浓度3.0MNaCl,0.3MNa3citrate·
2H2O(柠檬酸钠)
配制方式1.称量以下试剂,置于lL烧杯中。
NaCl
175.3g
Na3citrate·
88.2g
3滴加14NHCl,调剂pH值至后,加去离子水将溶液定容至1L。
4.高温高压灭菌后,室温保留。
SSPEBuffer
组份浓度3.0MNaCl,0.2MNaH2PO4,0.02MEDTA
配制量
g
NaH2PO4·
H2O
3.加NaOH调剂pH值至(约ml的10NNaOH)。
4.加去离子水将溶液定容至lL。
5.高温高压灭菌后,室温保留。
50XDenhardt’S溶液
1%(W/V)
Ficoll400(菲可400/水溶性聚蔗糖400)
Polyvinylpyrrolidone
(聚维酮/聚乙烯吡咯烷酮)
BSA
配制量500ml
配制方式1.称量以下试剂,置于500ml烧杯中。
Flcoll400
5g
PoLyvlnylpyrrolldone
2.加去离子水约400ml,充分搅拌溶解
3.加去离子水将溶液定容至500ml。
4.用µ
m滤膜过滤后,分装成每份25ml。
5.-20℃保留。
0.5M磷酸盐Buffer
组份浓度0.5MNa2HPO4。
配制量lL
134gNa2HPO4·
7H2O置于lL烧杯中。
2.加入约800ml的去离子水充分搅拌溶解。
3.加入85%的H3PO4(浓磷酸)调剂溶液pH值至。
SalmonDNA(鲑鱼精DNA)
组份浓度10mg/mlSalmonDNA
配制量约100ml
配制方式1.称取鲑鱼精DNA2g置于500ml烧杯中,加入约200ml的TEBuffer。
2用磁力搅拌器室温搅拌2~4h,溶解后加入4ml的5MNaCl,使其终浓度为0.1M。
3.用苯酚和苯酚/氯仿各抽提1次。
4.回收水相溶液后,利用17号皮下注射针头快速吸打溶液约20次,以切断DNA。
5.加入2倍体积的预冷乙醇进行乙醇沉淀。
6.离心回收DNA后,溶解于100ml的去离子水中。
测定溶液的OD260值。
7.计算溶液的DNA浓度后,稀释DNA溶液至10mg/ml。
min后,分装成小份(1ml/份)。
-20℃保留。
min后,迅速冰浴冷却。
DNA变性缓冲液
组份浓度1.5MNaCl,0.5MNaOH
配制方式1.称量以下试剂,置于lL烧杯中。
87.7g
NaOH
20g
预杂交液/杂交液(DNA杂交用)
6×
SSC(或SSPE)
5×
Denhardt’s
SDS
100µ
g/ml
SalmonDNA
配制置100ml
配制方式1.称量以下试剂,置于200ml烧杯中。
30ml
10ml
10%SDS
5ml
10mg/mlSalmonDNA
1ml
dH2O
54ml
2.充分混匀后,利用µ
m滤膜滤去杂质后利用。
预杂交液/杂交液(RNA杂交用)
Denhardt‘s
100g/ml
Formamlde
配制量100mL
配制方式1.称量以下试剂,置于200ml烧杯中。
Formamide(甲酰胺)
50ml
4ml
2.充分混匀后,利用µ
膜转移缓冲液(Western杂交用)
组份浓度39mMGlycine,48mMTris,%(W/V)SDS,20%(V/V)甲醇
Glycine
2.9g
5.8g
0.37g
2.向烧杯中加入约600ml的去离子水,充分搅拌溶解。
3.加去离子水将溶液定溶至800ml后,加入200ml的甲醇。
4.室温保留。
TBSTBuffer(Western杂交膜清洗液)
组份浓度20mMTris-HCl,150mMNaCl,%(V/V)Tween20
8.8g
1MTris-HCl
3.加入mlTween20后充分混匀。
4.加去离子水将溶液定容至lL后,4℃保留。
封锁缓冲液(Western杂交用)
组份浓度5%(W/V)脱脂奶粉/TBSTBuffer
5g脱脂奶粉加入到100mlTBSTBuffer中,充分搅拌溶解。
2.4℃保留待用(本封锁液应该现配现用)。
五、实验室经常使用培育基的配制方式
Ampicillin(氨卡青霉素)(100mg/ml)
组份浓度100mg/mlAmpicillin
配制量50ml
5gAmpicillin置于50ml离心管中。
2.加入40ml灭菌水,充分混合溶解后,定容至50ml。
3.用µ
m过滤膜过滤除菌。
4.小份分装(1ml/份)后,-20℃保留。
IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)(24mg/ml)
组份浓度24mg/mLIPTG
配制量50mL
1.2gIPTG置于50ml离心管中。
3.用022µ
4小份分装(1ml,份)后,-20℃保留。
X-Gal(20mg/ml)
组份浓度20mg/mlX-Gal
配制方式1.称量lgX-Gal置于50ml离心管中。
2.加入40mlDMF(二甲基甲酰胺),充分混合溶解后,定容至50ml。
3.小份分装(1ml/份)后,-20℃避光保留。
LB培育基
组份浓度1%(W/V)Tryptone(胰蛋白胨),%(W/V)YeastExtract(酵母提取物),1%(W/V)NaCl
配制方式1.称取以下试剂,置于lL烧杯中。
Tryptone
10g
YeastExtract
2.加入约800ml的去离子水,充分搅拌溶解。
3.滴加5NNaOH(约0.2m1),调剂pH值至。
5高温高压灭菌后,4。
C保留。
LB/Amp培育基
mg/ml
Ampicillin
3.滴加5NNaOH(约mL)。
调剂pH值至。
5.高温高压灭菌后,冷却至室温。
6.加入1mlAmpicillin(100mg/ml)后均匀混合。
7.4℃保留。
%(V/V)
17mM
KH2PO4
72mM
K2HPOa
TB培育基
配制方式1.配制磷酸盐缓;
中液(0.17MKH2PO4,0.72MK2HPO4)100ml。
溶解2.31gKH2PO4和l2.54gK2HPO4于90ml的去离子水中,搅拌溶解后,加去离子水定容至100ml,高温高压灭菌。
2.称取以下试剂,置于lL烧杯中。
12g
24g
4m
3.加入约800ml的去离子水,充分搅拌溶解。
1L后,高温高压灭菌。
60℃以下时,;
加入100ml的上述灭菌磷酸盐缓冲液。
6.4℃保留。
TB/Amp培育基
17mM
72mM
K2HPO4
配制方式1.配制磷酸盐缓冲液(0.17MKH2PO4,0.72MK2HPO4)100ml。
溶解2.31gKH2PO4,和K2HPO4于90ml的去离子水中,搅拌溶解后,加去离子水定容至100ml,高温高压灭菌。
4.加去离子水将培育基定容至lL后,高温高压灭菌。
60℃以下时,加入100ml的上述灭菌磷酸盐缓冲液。
4℃保留。
SOB培育基
2%(W/V)
KCl
MgCl2
250mMKCl溶液。
在90ml的去离子水中溶解l.86gKCl后,定容至100ml。
2MMgCl2溶液。
在90ml去离子水中溶解19gMgCl2后,定容至100ml,高温高压灭菌。
3.称取以下试剂,置于lL烧杯中。
0.5g
4.加入约800ml的去离子水,充分搅拌溶解。
10m1250mMKCl溶液,加入到烧杯中。
6.滴加5NNaOH溶液(约0.2m1),调剂pH值至。
7.加入去离子水将培育基定容至lL。
8.高温高压灭菌后,4℃保留。
9.利用前加入5ml灭菌的2MMgCl2溶液。
SOC培育基
2.5mM
20mM
Glucose
配制方式1.配制lMGlucose溶液。
将18gGlucose溶于90ml去离子水中,充分溶解后定容至100ml。
用µ
m滤膜过滤除菌。
2.向l00mlSOB培育基中加入除菌的1MGlucose溶液2ml,均匀混合。
3.4℃保留。
2×
YT培育基
组份浓度%(WV)Tryptone,1%(W/V)YeastExtract,%(W/V)NaCl
16g
3.滴加5NNaOH,调剂pH值至。
5.高温高压灭菌后,4℃保留。
Фb×
broth
组份浓度2%(W/V)Tryptone,%(W/V)YeastExtract,o5%(W/V)MgSO4·
7H2O
MgSO4·
7H2O
3.滴加1NKOH。
NZCYM培育基
%(WV)
CasaminoAcid(酪蛋白氨基酸)
1%(WV)
NZ胺
7HO
配制方式1.称取以下试剂。
置于lL烧杯中。
CasaminoAcid
1g
2g
NZYM培育基
配制方式NZYM培育基除不含CasaminoAcid外,其他成份与NZCYM培育基相同。
NZM培育基
配制方式NZM培育基除不含YeastExtract(酵母提取物)外,其他成份与NZYM培育基相同。
一样固体培育基的配制
配制方式1.依照液体培育基配方预备好液体培育基,在高温高压灭菌前,加入以下试剂中的一种。
Agar(琼脂;
铺制平板用)
15g/L
配制顶层琼脂用)
7g/L
Agarose(琼脂糖;
2.高温高压灭菌后,戴上手套掏出培育基,摇动容器使琼脂或琼脂糖充分混匀(现在培育基温度很高,警惕烫伤)。
3.待培育基冷却至50~60℃时,加入热不稳固物质(如抗生素等),摇动容器充分混匀。
4.铺制平板(30~35ml培育基/90mm培育皿)。
LB/Amp/X-Gal/LPTG平板培育基
ml
IPTG
X-GaL
Agar
3.滴加5NNaOH(约mL),调剂pH值至。
1L后,加入15gAgar。
5.高温高压灭菌后,冷却至60℃左右。
6.加入1mlAmpicillin(100mg/ml)、1mlIPTG(24mg/ml)、2mlX-Gal(20mg/mL)后均匀混合。
7.铺制平板(30~35ml培育基/90mm培育皿)。
8.4℃避光保留。
TB/Amp/X-Gal/LPTG平板培育基
mL
配制方式1.配制磷酸盐缓冲液(0.17MKH2PO4,0.72MK2HPO4)100ml。
溶解2.31gKH2PO4和gK2HPO4于90ml的去离子水中,搅拌溶解后,加去离子水定容至100ml,高温高压灭菌。
1L后。
加入l5gAgar。
0ml的上述灭菌磷酸盐缓冲液、lmlAmpicillin(100mg/ml)、1mlIPTG(24mg/mL)、2mlX-Gal(20mg/ml)后均匀混合。
84℃避光保留。
六、抗生素的贮存溶液及其工作浓度
抗生素
贮存液*1
工作浓度
浓度保存条件
严紧型质粒松弛型质粒
氨