几种表达载体.docx

几种表达载体.docx

《几种表达载体.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《几种表达载体.docx（10页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

几种表达载体

表达载体

一、原核细胞表达载体

1. pBAD载体:

特点; 该表达质粒含有araBAD（arabinose）操纵子的PBAD启动子和编码该启动子的正负调控子基因araC，具有紧密调控功能和高水平表达外源蛋白质的原核细胞表达载体。

请注意:

1.当要扦入其他信号肽片段，改建此载体时，请不要利用该载体上的Nde1EcoR1BamH1Kpn1和Pst1位点，以免造成重组困难，因为前述内切酶在此载体上均有二个位点，最好使用只有一个酶切位点的Sac1和Hind111位点。

同时记住，如在不含任何信号肽的PBAD表达质粒扦入信号肽，其非编码N-末端要包含核糖体结合位点（RBS）核苷酸序列。

2在使用含OmpA分泌信号肽的PBAD表达质粒时，请应用OmpA分泌信号肽上的Sac1以及载体Hind111酶切位点，这些在载体序列上都是单个酶切位点。

本公司目前有含OmpA分泌信号肽和不含任何信号肽的二种PBAD表达质粒，其多克隆位点区域图谱如下:

（a）、含OmpA分泌信号肽的PBAD表达质粒多克隆区域

SD

PBAD….TACCCGTTTTTTTCC….GCTAGCAGGAGGAAACGATGAAAAAGACAGCTATCGCGATTGCAGTGGCACTGGCTGGT

A M A  E L 

TTCGCTACCGTAGCCATGGCCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGCCTGCAGGCATCCAAGCTT

Nco1     Sac1  Kpn1 Smal1 BamH1         Pst1       Hind111

（b）、不含分泌信号肽的PBAD表达质粒多克隆区域

EcoR1     Kpn1    BamH1         Pst1

PBAD….TACCCGTTTTTTTGG….GCTAGCGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGCCTGCAGGCATCCAAGCTT

Nde1      Sac1     Smal1                    Hind111

下图显示本公司应用pBAD表达载体完成的实验结果:

pBAD载体驱动大分子蛋白质在原核细胞

Origami（DE3）内高效表达

2. pCAl-n&pCAl-pelB载体

特点:

该原核细胞表达载体是来源于以T7RNA聚合酶为基础的pET载体，含有T7/LacO启动子、编码钙调素结合多肽标鉴和凝血酶切点的核苷酸序列。

因此，该表达载体在E.coliBL21（DE3）或BL21（DE3）pLysS宿主菌中能高水平表达外源蛋白质、且这种表达的外源蛋白质因带有钙调素结合多肽和凝血酶切点，故该蛋白产物易于纯化和产业化。

此外，本公司利用分泌信号肽PelB，构建成新型的的原核细胞表达载体Pcal-PelB。

此载体表达的蛋白产物能在分泌肽PelB的指引下进入细胞周质。

（a）. Pcal-n

M K  R R W K K N  F I A V S A A N R F K K I  S S S G A  L L V P

CATATGAAGGGACGATGGAAAAAACAATTTCATAGCCGTCTCAGCAGCCAACCCGCTTTAAGAAAATCTCATCCTCCGGGGCACTTCTGGTTCC

Nde1

R G S P G I L D S M G R L E L K L R S A

GCGTGGATCCCCGGGAATTCTAGACTCCATGGGTCGACTCGAGCTCAAGCTTAGATCCGCC

BamH1 Sma1 EcoR1    Nco1 Sal1 Xho1 Sac1  Hnd111

（b）.Pcal-PelB:

Nde1                     

actggagactcatATGAAATACCTATTGCCTACGGCAGCCGCTGGATTGTTATTACTCGCGGCCCAGGGC

M  K Y  L L  P T A  A A G L  L L L A A Q P

Nco1 Msc1   BamH1     EcoR1       Sal1

GCCATGGCC aaggatcctaagtaagtagaattctgagtaggtaagtcgacaatcgcgtctagagccccgacgcgctggg

A M A     * * *  * * *

3. pPOW3.0表达载体

特点:

 该原核表达质粒含有噬菌体的重叠λPRPL热诱导启动子和编码热敏感抑制子的C1857基因，可使宿主细胞在合成蛋白前获得高密度的宿主细菌，进行高水平目的蛋白表达，并对蛋白合成提供紧密控制。

PelB分泌信号肽能指引合成的外源蛋白通过胞浆膜进入胞质。

特别提示:

在进行重组质粒时，最好在N-未端用Nco1或Msc1位点，C-末端则可用BamH1、EcoR1位点进行拼接。

图示为启动子、PelB分泌信号肽和多克隆位点区域

Xho1

λPRPL启动子ggggtgtgtgatacgaaacgaagcattggcgcctcgagtaatttaccaacactactacgttttaactgaaacaa

RBS Nde1                     

actggagactcatATGAAATACCTATTGCCTACGGCAGCCGCTGGATTGTTATTACTCGCG

M  K Y  L L  P T A  A A G L  L L L A

Nco1 Msc1   BamH1    EcoR1     Sal1

GCCCAGGGCGCCATGGCC aaggatcctaagtaagtagaattctgagtaggtaagtcgacaatcgcgtctagagccc

A Q  P  A M A      * * *  * * *

说明:

   RBS为核糖体结合位点;       * 为终止密码子 

二、真核细胞表达载体

1.pCMVp-NEO-BAN载体

特点:

该真核细胞表达载体分子量为6600碱基对，主要由CMVp启动子、兔β-球蛋白基因内含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo基因以及pBR322骨架构成，在大多数真核细胞内都能高水平稳定地表达外源目的基因。

更重要的是，由于该真核细胞表达载体中抗neo基因存在，转染细胞后，用G418筛选，可建立稳定的、高表达目的基因的细胞株。

扦入外源基因的克隆位点包括Sal1、BamH1和EcoR1位点。

注意在此载体中有二个EcoR1位点存在。

2.pEGFP,增强型绦色荧光蛋白表达载体

（EnhancedFluorecentProteinVector）

特点:

pEGFP表达载体中含有绿色荧光蛋白，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。

载体骨架中的SV40origin使该载体在任何表达SV40T抗原的真核细胞内进行复制。

Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。

此外，载体中的pUCorigin能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。

用途:

该表达载体EGFP上游有Nde1、Eco47111和Age1克隆位点，将外源基因扦入这些位点，将合成外源基因和EGFP的融合基因。

借此可确定外源基因在细胞内的表达和/或组织中的定位。

亦可用于检测克隆的启动子活性（取代CMV启动子,Acet1-Nhe1）。

Excitationmaximum=488nm;Emissionmaximum=507

图示为启动子分泌信号肽和多克隆位点区域：

Ase1.pCMV…ccgctagcgctaccggtcgccaccatg-.EGFP…BamH1…SV40polyA+

Nhe1    Age1

3. pEGFT-Actin,增强型绿色荧光蛋白/人肌动蛋白表达载体

特点:

pEGFP-Actin表达载体中含有绿色荧光蛋白和人胞浆β-肌动蛋白基因，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。

载体骨架中的SV40origin使该载体在任何表达SV40T抗原的真核细胞内进行复制。

Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。

此外，载体中的pUCorigin能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。

用途:

pEGFP-Actin载体在真核细胞表达EGFP-Actin融合蛋白，该蛋白能整合到胞内正在生的肌动蛋白，因而在活细胞和固定细胞中观察到细胞内含肌动蛋白的亚细胞结构。

Excitationmaximum=488nm; Emissionmaximum=507

图示为启动子和多克隆位点区域：

pCMV….Nhe1….Age1….EGFP…Bgl11…Actin…BamH1…SV40polyA+

4.pSV2表达载体

特点：

该表达质粒是以病责SV40启动子驱动在真核细胞目的基因进行表达的，克隆位点为Hind111。

SV40启动子具有组织/细胞的选择特异性。

此载体不含neo基因，故不能用来筛选、建立稳定的表达细胞株。

图示为启动子和多克隆位点区域：

Pvu11…pSV40….Hind111….SV40IVS….SV40polyA+

5．CMV4表达载体

特点:

该真核细胞表达载体由CMV启动子驱动，多克隆区域酶切位点选择性较多。

含有氨苄青霉素抗性基因和生长基因片段以及SV40复制原点和fl单链复制原点。

但值得注意的是，该表达载体不含有neo基因，转染細胞后不能用G418筛选稳定的表达细胞株。

图示为启动子和多克隆位点区域：

CMVp…Bgl11…Kpn1…Mlu1…Cla1…Hind111…Xbal1…Sma1…GH…….SV40ori

其他常用克隆Vector：

pBluscriptIIKSDNA  15ug  

pUC18DNA        25ug  

pUC19DNA        25ug  

保存液:

TEBuffer    

TEBuffer组成:

10mMTris.HCL（Ph8.0）

1mMEDTA