1、几种表达载体表达载体一、原核细胞表达载体1. pBAD载体: 特点; 该表达质粒含有araBAD(arabinose)操纵子的PBAD启动子和编码该启动子的正负调控子基因araC,具有紧密调控功能和高水平表达外源蛋白质的原核细胞表达载体。请注意: 1. 当要扦入其他信号肽片段,改建此载体时,请不要利用该载体上的Nde1 EcoR1 BamH1 Kpn1和 Pst1位点,以免造成重组困难,因为前述内切酶在此载体上均有二个位点,最好使用只有一个酶切位点的Sac1和Hind111位点。同时记住,如在不含任何信号肽的PBAD表达质粒扦入信号肽,其非编码N-末端要包含核糖体结合位点(RBS)核苷酸序列。
2、2 在使用含Omp A分泌信号肽的PBAD表达质粒时,请应用Omp A分泌信号肽上的Sac1以及载体Hind111酶切位点,这些在载体序列上都是单个酶切位点。本公司目前有含Omp A分泌信号肽和不含任何信号肽的二种PBAD表达质粒, 其多克隆位点区域图谱如下: (a)、含Omp A分泌信号肽的PBAD表达质粒多克隆区域SDPBAD.TACCCGTTTTTTTCC.GCTAGCAGGAGGAAACG ATG AAA AAG ACA GCT ATC GCG ATT GCA GTG GCA CTG GCT GGTA M A E L TTC GCT ACC GTA GCC ATG GCC GAG CT
3、C GGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGCCTGCAGGCATCCAAGCTTNco1 Sac1 Kpn1 Smal1 BamH1 Pst1 Hind111(b)、不含分泌信号肽的PBAD表达质粒多克隆区域EcoR1 Kpn1 BamH1 Pst1PBAD.TACCCGTTTTTTTGG.GCTAGCGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGCCTGCAGGCATCCAAGCTTNde1 Sac1 Smal 1 Hind111下图显示本公司应用pBAD表达载体完成的实验结果:pBAD载体驱动大分子蛋白质在原核细胞Origami(DE3)内高效表达2
4、. pCAl-n & pCAl-pelB载体 特点: 该原核细胞表达载体是来源于以T7 RNA聚合酶为基础的pET载体,含有T7/LacO启动子、编码钙调素结合多肽标鉴和凝血酶切点的核苷酸序列。因此,该表达载体在E.coli BL21(DE3)或BL21(DE3)pLysS宿主菌中能高水平表达外源蛋白质、且这种表达的外源蛋白质因带有钙调素结合多肽和凝血酶切点,故该蛋白产物易于纯化和产业化。此外,本公司利用分泌信号肽PelB,构建成新型的的原核细胞表达载体Pcal-PelB。此载体表达的蛋白产物能在分泌肽PelB的指引下进入细胞周质。(a). Pcal-nM K R R W K K N F I
5、A V S A A N R F K K I S S S G A L L V PCATATG AAG GGACGATGGAAAAAACAATTTCATAGCCGTCTCAGCAGCCAACCCGCTTTAAGAAAATCTCATCCTCCGGGGCACTTCTGGTTCCNde1R G S P G I L D S M G R L E L K L R S AGCGTGGATCCCCGGGAATTCTAGACTCCATGGGTCGACTCGAGCTCAAGCTTAGATCCGCCBamH1 Sma1 EcoR1 Nco1 Sal1 Xho1 Sac1 Hnd111(b). Pcal-PelB:Nde
6、1 actggagact catATG AAA TAC CTA TTG CCT ACG GCA GCC GCT GGA TTG TTA TTA CTC GCG GCC CAG GGCM K Y L L P T A A A G L L L L A A Q PNco1 Msc1 BamH1 EcoR1 Sal1GCC ATG GCC aaggatcctaagtaagtagaattctgagtaggtaagtcgacaatcgcgtctagagccc cgacgcgctgggA M A * * * * * *3. pPOW3.0 表达载体特点: 该原核表达质粒含有噬菌体的重叠PRPL热诱导启动子和编
7、码热敏感抑制子的C1857基因,可使宿主细胞在合成蛋白前获得高密度的宿主细菌,进行高水平目的蛋白表达,并对蛋白合成提供紧密控制。PelB分泌信号肽能指引合成的外源蛋白通过胞浆膜进入胞质。特别提示: 在进行重组质粒时,最好在N-未端用Nco1或Msc1位点,C-末端则可用BamH1、EcoR1位点进行拼接。图示为启动子、PelB分泌信号肽和多克隆位点区域Xho1PRPL 启动子ggggtgtgtgatacgaaacgaagcattggcgcctcgagtaatttaccaacactactacgttttaactgaaacaaRBS Nde1 actggagact catATG AAA TAC CT
8、A TTG CCT ACG GCA GCC GCT GGA TTG TTA TTA CTC GCG M K Y L L P T A A A G L L L L ANco1 Msc1 BamH1 EcoR1 Sal1GCC CAG GGC GCC ATG GCC aaggatcctaagtaagtagaattctgagtaggtaagtcgacaatcgcgtctagagcccA Q P A M A * * * * * *说明: RBS 为核糖体结合位点; * 为终止密码子 二、真核细胞表达载体1. pCMVp-NEO-BAN载体特点: 该真核细胞表达载体分子量为6600碱基对,主要由CMVp启
9、动子、兔-球蛋白基因内含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo基因以及pBR322骨架构成, 在大多数真核细胞内都能高水平稳定地表达外源目的基因。更重要的是,由于该真核细胞表达载体中抗neo基因存在,转染细胞后,用G418筛选,可建立稳定的、高表达目的基因的细胞株。扦入外源基因的克隆位点包括Sal1、BamH1和EcoR1位点。注意在此载体中有二个EcoR1位点存在。2. pEGFP, 增强型绦色荧光蛋白表达载体(Enhanced Fluorecent Protein Vector)特点: pEGFP表达载体中含有绿色荧光蛋白,在PCMV启动子驱动下,在真核细胞中高水平表达。载体骨架中的SV
10、40 origin使该载体在任何表达SV40 T 抗原的真核细胞内进行复制。Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成,能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。此外, 载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制, 而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。用途: 该表达载体EGFP上游有Nde1、Eco47111和Age1克隆位点,将外源基因扦入这些位点,将合成外源基因和EGFP的融合基因。 借此可确定外源基因在细胞内的表达和/或组织中的定位。亦可用于检测
11、克隆的启动子活性(取代CMV启动子,Acet1-Nhe1)。Excitation maximum = 488 nm; Emission maximum = 507图示为启动子分泌信号肽和多克隆位点区域:Ase1.pCMVccg cta gcg cta ccg gtc gcc acc atg- .EGFPBamH1SV40 poly A+Nhe1 Age13. pEGFT-Actin, 增强型绿色荧光蛋白/人肌动蛋白表达载体特点: pEGFP-Actin表达载体中含有绿色荧光蛋白和人胞浆-肌动蛋白基因,在PCMV启动子驱动下,在真核细胞中高水平表达。载体骨架中的SV40 origin使该载体在任
12、何表达SV40 T 抗原的真核细胞内进行复制。Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成,能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。此外, 载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制, 而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。用途: pEGFP-Actin载体在真核细胞表达EGFP-Actin融合蛋白,该蛋白能整合到胞内正在生的肌动蛋白,因而在活细胞和固定细胞中观察到细胞内含肌动蛋白的亚细胞结构。Excitation maximum = 488 nm; E
13、mission maximum = 507图示为启动子和多克隆位点区域:pCMV.Nhe1.Age1.EGFPBgl11ActinBamH1SV40 poly A+4. pSV2表达载体特点:该表达质粒是以病责SV40启动子驱动在真核细胞目的基因进行表达的,克隆位点为Hind111。SV40启动子具有组织/细胞的选择特异性。此载体不含neo基因,故不能用来筛选、建立稳定的表达细胞株。图示为启动子和多克隆位点区域:Pvu11pSV40.Hind111.SV40 IVS.SV40 polyA+5 CMV4 表达载体特点:该真核细胞表达载体由CMV启动子驱动,多克隆区域酶切位点选择性较多。含有氨苄青霉素抗性基因和生长基因片段以及SV40复制原点和fl单链复制原点。但值得注意的是,该表达载体不含有neo基因,转染細胞后不能用G418筛选稳定的表达细胞株。图示为启动子和多克隆位点区域:CMVpBgl11Kpn1Mlu1Cla1Hind111Xbal1Sma1GH.SV40 ori其他常用克隆Vector:pBluscript II KS DNA 15 ug pUC18 DNA 25 ug pUC19 DNA 25 ug 保存液: TE Buffer TE Buffer组成: 10 mM Tris.HCL(Ph 8.0)1 mM EDTA
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