功能化核酸适配子传感器的研究进展王昆重点.docx

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功能化核酸适配子传感器的研究进展王昆重点

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DOI：

10．3724/SP．J．1096．2014．30549功能化核酸适配子传感器的研究进展王昆1，3陶占辉2徐蕾*1刘亚青*31（长春理工大学化学与环境工程学院，长春130022）2（吉林省石油化工设计研究院，长春130021）3（中国科学院长春应用化学研究所电分析化学国家重点实验室，长春130022）摘要适配子生物传感器由于其检测灵敏度高、选择性好并具有良好的稳定性和广泛的适用范围等一系列优点在近年来得到了迅速发展，极大地促进了生物传感器的快速发展。

本文主要针对利用3种检测方法即电化学、荧光和比色法发展的适配子传感器的研究进展进行综述，并对适配子传感器的发展进行了展望。

关键词适配子；生物传感器；荧光；电化学；比色；综述2013-06-06收稿；2013-09-02接受

本文系国家自然科学基金项目（No．21190040）、中国博士后科学基金面上资助项目（No．2012M510857）和吉林省科技发展计划项目（No．20120346）资助

*E-mail：

xul646@163．com；yaqingliu@ciac．ac．cn

1

引言生物传感器是利用生物物质作为识别元件，将生化反应转变成可定量的物理信号，从而在分子水平

实现对生命物质和化学物质检测和监测的分析仪。

1962年，

Clark和Lyons提出用含酶的膜将尿素或葡萄糖转变为产物，

采用pH计或氧电极进行检测［1］

。

1967年，Updike和Hick将葡萄糖氧化酶固化在聚丙烯酰胺胶体中，再将此胶体膜固定在隔膜氧电极上，制成了第一支葡萄糖传感器［2］。

这是生物分析

领域重要的里程碑，标志着生物传感器的诞生。

生物传感器包括生物识别元件和换能器。

传感器的工作原理可以简述为生物识别元件识别待测元素，由换能器将生物化学反应中产生的信息转化为可检测或可处理的化学或物理信号。

如图1所示，传感图1生物传感器的示意图［3］Fig．1Illustrationofthepreparationofbiosensor［3］器中生物识别元件决定了其特异性，而识别元

件的亲和性和换能器的选择决定了其响应速

度和灵敏度。

早期生物传感器所用的识别元素多为抗

体，

有很好的特异性和灵敏度，但也有一定的不足：

抗体体积较大，只能在生理环境下稳

定，且通常需要在动物体内或者细胞环境下

获得，极大的限制了生物传感器的发展。

直

到1996年，

Davis等［4］利用荧光标记的核酸适配子制备了第一个核酸适配子生物传感

器，标志着生物传感器进入了一个新的时代。

核酸适配子（Aptamer，简称适配子）又称为核酸适体［5，6］，通常是由1580个碱基组成的寡聚DNA或ＲNA分子，可利用指数富集配体系统进化法（Systematicevolutionofligandsbyexponentialenrichment，SELEX）筛选获得。

其基本原理是由一个庞大的随机单链寡核苷酸库为待筛选全集，目标分子将与呈特

异亲合性的寡核苷酸片段结合，

在洗脱掉没有高亲和力结合的寡核苷酸后，剩余的即有可能成为核酸适配体的片段。

将得到的片段进行PCＲ（Polymerasechainreaction）扩增后再继续之前的筛选循环，直到筛选到亲和力最高且最短的有效片段，从而获得对目标分子具有高亲合性、高特异性的配体—核酸适配体［7，8］。

与抗体相比，适配子作为识别元素表现出诸多优点，具有合成重复性好、成本低、稳定性好及可第42卷

2014年2月分析化学（FENXIHUAXUE）评述与进展ChineseJournalofAnalyticalChemistry

第2期298304

逆变性等特点，存储运输方便，可通过自动化的固相合成进行大规模制备。

适配子易于功能化修饰，其靶标分子范围广，且能够高特异性识别靶标分子并形成独特的空间结构，从而引起检测信号的改变，可满足作为分子识别元件的要求。

基于上述优点，适配子作为识别元素已被广泛地与荧光、比色、电化学等换能器结合，发展出一系列新型生物传感器。

本文将围绕荧光、比色和电化学适配子传感器介绍其近期的研究进展。

2荧光适配子传感器

荧光基团可以通过非共价作用、静电作用、疏水作用、镶嵌、共价作用等对适配子进行功能化修饰，基于荧光基团的特性，如消光系数、量子产率、荧光寿命、波长、各向异性和能量转移等，发展出了多种荧光适配子传感器。

通过共价作用与适配子结合制备的荧光适配子传感器有多种。

Yamamoto等［9］将适配子分为两个独立的部分，如图2所示。

适配子中一部分能形成发夹结构，其两端共价结合上荧光基团和淬灭剂，由

于荧光基团和淬灭剂离得很近，

产生了荧光共振能量转移现象，发生荧光淬灭。

当加入靶分子HIVTat蛋白质后，发夹结构被破坏，并与另一条DNA杂化形成双链，导致荧光基团远离淬灭剂，从而产生较强的荧光信号。

利用此原理成功地检测了HIVTat蛋白质

［9］。

相似地，Stojanovic等［10］也将适配子分为两

部分，检测可卡因。

适配子分为两部分后，对靶分子的亲和力会下降，并且不是对所有的适配子都适用，所以Nutiu等［11］制备了一种不将适配子分割成两部分的荧光生物传感器（图3）。

与适配子相联的DNA片段可与标记有荧光基团的链互补，而与适配子互补的单链上被标记上了荧光淬灭剂。

由于荧光基团与淬灭物

质离得很近，

荧光信号很低。

当加入靶分子后适配子与靶分子结合，与适配子互补的DNA脱落，这时荧光信号增强。

基于此原理，Nutiu等［11］成功检测了ATP与凝血酶

。

图2

检测HIVTat蛋白质的荧光适配子传感器［9］Fig．2FluorescentbiosensorforhumanimmunodeficiencyvirusTat（HIVTat）proteindetection［9

］图3检测ATP和凝血酶的荧光适配子传感器［11］Fig．3Fluorescentbiosensorforadenosinetriphosphate

（ATP）andthrombindetection［11］利用共价作用将荧光基团标记在适配子上制备适配子传感器的方法还有很多，

Zhang等［12］将富含T碱基的适配子标记上荧光基团，在没有靶分子Hg2+时，适配子将环绕在单壁碳纳米管上，使得荧光信号很低。

当加入Hg2+后，富含T碱基的适配子由于形成T-Hg2+-T结构从单壁碳纳米管上脱离下来，使

得荧光基团远离碳纳米管，荧光信号增强，以此检测Hg2+。

Wu等［13］在上转换材料表面修饰上OTA

（OchratoxinA）和FB1（FumonisinB1）的适配子，在无靶分子的情况下，由于适配子和石墨烯之间强烈的π-π作用修饰有适配子的上转化材料被吸附在石墨烯表面，上转换材料的荧光被石墨烯完全淬灭。

当加入靶分子后，适配子与靶分子结合从石墨烯表面脱离，荧光信号增强，从而实现对OTA与FB1的检

测，检出限分别为0．05和0．1ng/mL［13］。

Li等［14］利用量子点CdSe/ZnS作为荧光基团，石墨烯作为淬

灭物质，成功检测了Pb2+。

Chen等［15］利用π-π作用将修饰有不同荧光染料的3条DNA链吸附在多壁碳纳米管上，当不存在靶分子时，染料的荧光被多壁碳纳米管完全淬灭；加入靶分子后，修饰有染料的DNA链从多壁碳纳米管上脱落，产生荧光信号，实现了多元检测。

由于对DNA进行标记不仅费时，而且必然会增加成本，并且在适配子上标记荧光探针有可能影响适配子对目标分子的识别能力，从而影响检测效果。

而免标记检测方法则避免了这些不足。

在免标记的方法中，荧光分子不是以共价作用与适配子结合在一起的，而是通过非共价作用、静电作用、疏水作用、嵌入等与适配子结合。

免标记方法中所用的荧光分子在结合到某些特定DNA结构时，

其荧光强度会得到显著增强。

利用该原理制备了系列适配子生物传感器。

Ｒen等［16］制备了检测DNA

的适配子传感器。

他们利用Tetrakis（diisopropylguanidino）-

zinc-phthalocyanine（Zn-DIGP）和N-methyl-mesoporphyrinIX（NMM）作为荧光探针。

在这种方法中，两条单独的DNA链形成的四极子可以结合荧光探针。

这两条单独的DNA链的末端可以与靶分子互补。

当加入靶分子后，由于环境改变探针的荧光

强度就会发生明显变化。

Zn-

DIGP为探针时荧光强度降低，与之相反，NMM的荧光强度则增强。

它们作为荧光探针时的检出限分别为3．2和5．4nmol/L。

Elbaz等［17］将含有可以识别Pb2+和L-组氨酸的

DNA酶的序列两端与类辣根过氧化物酶序列相互连接。

当靶分子存在时，类辣根过氧化物酶序列将会

被释放，进而催化H2O2氧化ABTS2!

反应，成功实现了基于信号放大高灵敏检测Pb2+和L-组氨酸。

Li

等［18］利用Pb2+驱动DNA的分子装置，实现了对Pb2+的高灵敏检测。

Pb2+可以很好地稳定DNA

（T30695）的四极子结构，当Pb2+存在时，T30695和其互补链就会解旋，由T30695形成的四极子与荧光

探针ZnPPIX结合，可极大地增强其荧光强度，从而实现高灵敏度检测Pb2+，检出限为20nmol/L。

加入

Pb2+的强效络合剂DOTA（1，4，7，10-Tetraazacyclododecane-1，4，7，10-tetraaceticacid）则可以实现传感器的循环使用。

Zhou等［19］

利用了另外一种荧光探针H2DCFDA（2，

7-dichlorodihydrofluoresceindiacetate）和两种核酸酶根据不同机理设计了两种适配子传感器，成功检测了DNA的互补链。

众所周知，核酸外

切酶对DNA二级结构没有活性。

利用该性质，Zheng等［20］提出了一种可以检测小分子、蛋白质和无机

离子的机理。

并成功检测了可卡因、

凝血酶和K+。

免标记荧光适配子传感器具有省时、成本低、简单等优点，但是免标记荧光传感器也有一定的不足，比如荧光信号容易受到复杂环境的影响等，这还需要进一步深入研究。

3电化学适配子传感器

电化学适配子传感器是将适配子作为分子识别元素固定在电极上，根据适配子与靶分子结合前后信号探针电化学信号的变化来进行检测的生物传感器。

电化学适配子传感发展地非常迅速，表现出很

多优点，比如电化学信号灵敏、消耗低、检测方法多样。

Fan等［21］利用电极表面的适配子与靶分子作用

后构象的变化，制备了一种简单的传感器。

其传感性能依赖于适配子末端标记的信号探针与电极表面的距离变化，引起电化学信号的变化。

在与靶分子作用后，由于DNA的双链结构使得信号探针远离电

极表面，电流信号相应降低，从而实现对靶分子的检测。

这种方法是基于信号降低（Signal-

off）进行检测的，检测结果容易产生“假阳性”，且其检测信号由高到低，背景信号较强，对检测灵敏度有一定的影响。

他们还发展了一种基于信号增强（Signal-

on）的方法，实现了对ATP的高灵敏度检测。

他们在ATP适配子末端标记Fc（Ferrocene）为信号探针，初始状态下，ATP适配子与其互补链形成双链结构，信号探针

远离电极表面（图4）。

与ATP作用后，适配子会形成特定的结构，其互补链释放到溶液中，信号探针则靠近电极表面使得信号增强。

这种方法避免了信号降低类传感器的一些弊端，但是由于在适配子上标

记有信号探针，有可能会对适配子的识别特性有所影响［22］。

Xiao等［23］利用构象变化实现了对凝血酶

的检测。

在凝血酶的互补链末端标记上信号探针，初始状态下，由于DNA双链结构的刚性，信号探针远离电极表面，电化学信号较低。

当凝血酶存在时适配子与凝血酶作用形成四极子结构将互补链释放出来，探针就会靠近电极表面，产生放大信号。

这一传感策略中信号探针标记在适配子的互补链上，可以

避免影响适配子与靶分子的亲和性，方法检出限为3nmol/L。

Liang等［24］以金纳米粒子-石墨烯复合材

料作为电极，利用构象变化实现了对L-组氨酸的检测。

L-组氨酸将底物切割成两端，释放出底物来，而电极表面的DNA则形成二级结构，使得信号探针靠近电极，而修饰的金纳米粒子-石墨烯复合材料能够

极大地促进电子传递，增强电化学信号。

这种方法对L-组氨酸的检出限为0．1pmol/L。

Zhao等［25］还

利用辣根过氧化物酶和去铁铁蛋白放大电化学信号成功构建出一种超灵敏的电化学适配子传感器，这

图4检测ATP的电化学适配子传感器［22］Fig．4ElectrochemicalbiosensorforATPdetection［22］种方法对凝血酶的检出限为0．07pmol/L。

以上构筑的电化学传感器均需对DNA进

行标记，还有很多学者致力于免标记适配子传

感器的研究。

Yuan等［26］利用DNA构筑了一

种超级三明治结构，采用电化学发光的方法检

测Hg2+。

超级三明治结构包括3种DNA单

链，在Hg2+存在时，这些DNA链由于T-

Hg2+-T的作用，组装在电极表面。

电化学信号探针Ｒu（phen）2+

3则会通过静电作用镶嵌到DNA双链结构中，产生输出信号，实现对Hg2+的免标记灵敏检

测，检出限为0．25nmol/L。

Li等［27］利用K+和血红素和AGＲO100作用形成四极子结构，再与HeLa细

胞作用，催化鲁米诺-过氧化氢反应，产生信号，以检测HeLa细胞。

这种检测方法更加简单，不需要将适配子修饰到电极表面。

另外，基于电化学阻抗法发展了多种免标记电化学适配子传感器。

在此类传感器中，

［Fe（CN）6］3!

/4!

是常用的氧化还原探针。

由于带有负电的DNA和分子量较大的物质对其电子传递产生

抑制作用，

降低其靠近电极表面发生氧化还原的能力。

Jalit等［28］利用巯基将4-MBA（4-Mercapto-benzoicacid）自组装到Au电极表面，再通过共价作用将SA（Streptavidin）组装到4-

MBA分子层上。

利用SA将凝血酶适配子固定在电极表面。

结合了凝血酶的适配子形成特定结构，使得氧化还原探针（K3［Fe（CN）6］）远离电极表面，导致传感器的阻抗值增加，基于此实现了对凝血酶的高灵敏检测（检出限

为240fmol/L）。

Xu等［29］利用在玻碳电极上poly（pyrrole-NTA）发生的电聚合反应，将Poly（pyrrole-

NTA）修饰到电极上，然后加入Cu2+，使得标记有组氨酸的凝血酶适配子通过配位作用组装到玻碳电极上。

在

凝血酶作用下，

适配子形成特定的结构，使得溶液中的氧化还原探针（Hydroquinone）不能靠近电极。

由于poly（pyrrole-NTA）在电极表面形成了一层薄膜，该传感器可以在复杂环境下保持很好的检测性能。

4比色适配子传感器

比色适配子传感器是利用识别反应前后体系的颜色变化作为输出信号的传感体系。

由于不需要复

杂的分析仪器，

可以制备出方便携带的适配子传感器。

2002年，Stojanovic等［30］将35种不同的染料与可卡因适配子结合，发现在加入可卡因后只有一种染料可使溶液颜色发生变化。

而如果用肉眼观察到

颜色的变化则需要加入20μmol/L适配子，

等待反应12h。

由于不是所有的适配子都可以找到对应的染料，这种方法并不适用于其它比色适配子传感器的设计。

而基于“血红素-适配子”

DNA酶和贵金属纳米粒子的比色适配子传感体系因其响应快、适用范围广等优点被广泛研究。

下面对这两种比色适配子传感器进行讨论。

4．1基于纳米粒子的比色适配子传感器

贵金属纳米粒子是比色适配子传感器中利用非常广泛的信号探针。

如金纳米粒子，其光学性能优

异，具有很强的表面等离子共振（Surfaceplasmonresonance，SPＲ）吸收峰，其峰值与纳米粒子的粒径及间

距密切相关。

当纳米粒子的分散状态变化时，其SPＲ吸收峰会发生明显的移动，颜色也会有相应的变化。

当金纳米粒子处于分散状态时表现为红色，当其处于聚集状态时则会表现出蓝色或紫色。

据此原理设计出了一系列比色适配子传感器。

Mirkin研究组［31，32］在金纳米粒子表面修饰上含巯基的单链DNA，成功地检测了其互补DNA链，创

造实现了利用金纳米粒子制备比色适配子传感器。

Huang等［33］在金纳米粒子表面修饰血小板源性生

长因子的适配子，由于血小板源性生长因子有2个识别位点，会将修饰在不同的金纳米粒子上的适配子结合在同一个血小板源性生长因子上，使得金纳米粒子聚集产生颜色变化，以此检测血小板源性生长因

子，检出限为2nmol/L。

Qi等［34］利用聚胸腺嘧啶会与三聚氰胺通过3个氢键作用联接在一起，基于此

构筑了聚胸腺嘧啶稳定的金纳米粒子检测三聚氰胺，检出限为20nmol/L。

Li和Ｒothberg［35］发现单链

会通过静电作用吸附在金纳米粒子表面，阻止金纳米粒子聚集。

而形成双链后DNA会从金纳米粒子表

面脱落，导致金纳米粒子聚集。

此方法不需要对DNA进行特殊的修饰就可以检测其互补链，检出限可

以达到100fmol/L。

Wang等［36］利用没有K+存在时其适配子会吸附在金纳米粒子表面，阻止纳米粒子

聚集，在加入K+后，适配子会形成四极子结构，从金纳米粒子表面脱落，以此检测K+。

利用相似的原

理成功检测了凝血酶，检出限为0．83nmol/L［37］。

金纳米粒子无论是否聚集在520640nm范围内都会产生吸收。

若纳米粒子的聚集浓度程度太高

易产生沉淀，

限制了其进一步的发展。

因此，Liu等［38］设计了一种基于非聚集金纳米粒子的比色传感器，与目标DNA的一端互补的DNA链通过巯基修饰到金纳米粒子上，而与目标DNA另一端互补的DNA链修饰磁性的探针。

加入目标DNA后，金纳米子和磁性探针会与目标DNA结合。

在外加磁场的作用下，与目标DNA作用连接在一起的金纳米子全部聚集到底部，上清液只有未聚集的金纳米子。

通过检测未聚集的上清液的吸收峰值成功实现了天花病毒的检测，检出限为4fmol/L。

根据不同吸收峰的纳米粒子，可以实现多功能检测。

该方法极大扩展了比色适配子传感器的适用范围。

4．2基于“血红素—适配子”DNA酶的比色适配子传感器

Li等［3942］发现血红素在与DNA链PS2．M和PS5．M作用后有类似辣根过氧化酶的（HＲP）的活性。

这是最早关于四极子DNA酶的报道。

血红素与四极子结合所表现出的DNA酶活性被认为遵从了与HＲP同样的机理。

由于四极子作为寡聚核苷酸，可以方便地连接到其它DNA的一端，这为检测策略设计提供了广阔的空间。

Deng等［43］将血红素适配子分为两段，只有在目标DNA存在时血红素适配子才会与血红素作用形

成四极子结构，

产生DNA酶的活性。

催化H2O2氧化ABTS2!

，以此检测靶分子DNA。

也可以用这种机理定量分析单碱基变异。

Liu等［44］将适配子与DNA酶连接在一起作为A链，

设计了一条B链可以与A链部分互补来检测ATP。

在ATP存在时A链会与B链解旋，

DNA酶催化H2O2氧化ABTS2-产生颜色变化，

成功检测了ATP，检出限为1μmol/L。

Kong等［45］在实验中发现，所研究的DNA中可形成平行结构的四极子会与血红素结合后产生DNA酶的性质，而反平行结构的四极子与血红素结合后不具有DNA

酶的性质。

在此基础上，Li等［46］设计出了基于构象变化的比色适配子传感器，成功检测了Pb2+（图5）。

在没有Pb2+存在时，PS2．M在K+稳定下会形成平行结构的四极子，与血红素结合后可以催化H2O2氧

化ABTS2–产生颜色变化。

在加入Pb2+后，

平行结构的四极子会转变为反平行结构，这时DNA酶失去活性，以此检测Pb2+。

Sun等［47］深入研究了K+，Na+和Pb2+对四级子结构稳定起到的作用，构建了类

似的适配子传感器，实现了在Pb2+存在的情况下检测K+，检出限为1．9nmol/L

。

图5

检测Pb2+的比色适配子传感器［46］Fig．5ColorimetricbiosensorforthedetectionofPb2+［46］

Li等［48］利用带有两个自由链部分的双分子四极子DNA酶，当加入低浓度的与自由链部分互补的DNA链后，可以增强DNA酶的活性。

首次揭示了一定程度的碱基配对DNA双链对四极子的DNA酶活性有增强效果。

利用该机理对目标链进行检测，检出限为10nmol/L。

他们还发现如果将已知适配子中的双链部分嫁接到其它适配子上，产生的新的DNA结构表现出更高的亲和性和更好的DNA酶活

第2期王昆等：

功能化核酸适配子传感器的研究进展303性。

这为适配子与DNA酶的设计提供了新的策略。

由此，Tang等［50］设计出了一种检测DNA的比［51］色适配子传感器，具有很高的选择性和灵敏度，检出限达到了0．2nmol/L。

Li等还设计出了一系列［49］2+2比色适配子传感器。

特别是在检测Hg中，他们利用了四甲基联苯胺（TMB）取代了ABTS作为过氧化2TMB的引入促进了比色由于ABTS的氧化产物在溶液中不稳定，容易发生歧化反应而褪色，物酶底物，适配子传感体系的稳定性。

5总结与展望适配子的应用极大地促进了生物传感器的发展，其靶分子广泛、合成简单、亲和力强、序列可以自由设计、修饰方便等优点使得适配子传感器在以后的应用中受到广泛关注。

目前，适配子传感器已经得到了快速发展，深入到多个分析领域，展现出独特优势。

然而，也应看到适配子传感器在很多方面还有待预计今后相关研究将侧重于以下几个方面：

（1）提高适配子传感器的长期稳定性，能在于进一步优化，长时间保存后仍能保持良好的性能；

（2）研究设计能够多次重复使用的适配子传感器；（3）目前的文献选择性不够等不足，因此需深入研究适配中很多适配子传感器在实际样品检测中普遍出现灵敏度下降，保证在复杂环境下的选择性和灵敏度；（4）为了适应实际样品检测的需求，需要子与靶分子作用机理，研制更加经济、快速、便捷的传感器以满足市场需要。

相信随着分析方法及检测手段的进一步发展，有科学、能应用于实际样品检测的适配子传感器。

望设计出更加方便、Ｒeferences123456789101112131415161718192021222324252627ClarkLC，LyonsC．AnnalsoftheNewYorkAcademyofSciences，1962，102

（1）：

29－451967，214（5092）：

986－988UpdikeSJ，HicksGP．Nature，LeeJO，SoHM，JeonEK，ChangH，WonK，KimY．Anal．Bioanal．