免疫荧光检测Word文件下载.docx
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荧光素标记的抗人球蛋白用前需混匀并以PBS-Tween缓冲液稀释。
7．冲洗：
8．封片：
将盖片直接放于泡沫塑料板凹槽中，滴加甘油/PBS至盖片：
每反应区约10μl。
从PBS-Tween缓冲液中取出1张生物薄片，用纸擦干背面和四边。
还要擦拭反应区间隙。
将生物薄片面朝下放在已准备好的盖玻片上，立即查看并调整使盖片嵌入载片的凹槽中。
然后继续下1张。
结果判定
荧光显微镜下观察
1．细胞核发黄绿色荧光为阳性染色细胞，不发荧光为阴性。
抗原片中出现阳性染色细胞为ANA阳性，否则为阴性。
阳性待检血清可作进一步稀释后测定效价。
2．根据细胞核着染色荧光的图像，可区分为：
①均质型：
细胞核呈均匀一致的荧光；
②周边型（核膜型）：
细胞核周围呈现荧光；
③斑点型（颗粒型）：
细胞核内呈现斑点状荧光；
④核仁型：
核仁部分呈现荧光。
⑤混合型：
两种以上核染色；
⑥应用细胞片做抗原片可检出着点型（ACA）
注意事项
1．PBS-Tween缓冲液在4℃下可存放两周。
2．根据每次实验的标本量决定需要稀释的FITC标记的抗人球蛋白的量，稀释后可在4℃下可存放1周。
3．血清或FITC标记的抗人Ig应滴加至加样板上，不能直接滴到载片上。
4．载片盖到加样板上后，确保反应区与液滴完全接触后，才开始记时温育。
5．冲洗载片时水流要缓慢，以免冲洗掉基质。
载片上的反应区应保持湿润，不要将载片风干。
6．封片进不可用力挤压盖玻片，以免损坏基质。
可左右挪动盖玻片以使其正确嵌入载片凹槽里。
7．封片介质含有荧光稳定剂，应保存在2-8℃。
封好的载片可于4℃长期保存。
实验讨论
方法评价
间接免疫荧光技术是检测ANA最常用的方法。
该方法简便、敏感，且可根据核染色形态确定核抗原的类型。
鼠肝印片细胞分布不均匀，多有重叠，冲洗时易丢失。
Hep-2细胞具有核大、有丝分裂旺盛、核内细胞器较明显、具备人源性抗原的特征，对诊断和鉴别不同类型的自身免疫病十分有利。
检测抗核抗体（ANA）的实验方案
ANA简介
抗核抗体（antinuclear
antibodies，ANAs）
经典定义：
针对细胞核成分的一大组抗体谱。
抗核抗体新概念（FANA）
传统定义：
顾名思义是指抗细胞核抗原成分的自身抗体的总称®
狭义定义
现代定义：
是指抗细胞内所有抗原成分的自身抗体的总称。
对ANA的理解已不再局限于核成分，而是指抗核酸（nucleicacid）和核蛋白（nucleoprotein）抗体的总称®
广义定义
靶抗原分布：
细胞核
细胞核、细胞浆、细胞骨架、细胞分裂周期
抗核抗体检测方法
检测细胞内抗原自身抗体“金标准”－IIF
ANA检测方法进展：
仅限于IIF改良法（底物选择、制备方法）试图将ELISA发推广为最基本的筛选方法未获成功
复制细胞抗原全部成分极其困难®
抗原存在的相对浓度、自然抗原决定簇的二级结构及高级结构
荧光染色模型可初步判断相应抗体性质范围或确定抗体特异性
IIF法：
HEp-2细胞底物（90%以上实验室采用）
#完整的ANAs抗原谱（细胞核、浆、骨架、周期）
#可预测分析ANA靶抗原范围
#经验性强
ELISA法：
采用高度纯化抗原或全细胞抗原
#抗原谱有限（十余种）
#
假阴性结果
#操作简单快速
其他方法：
金标法、比浊法
ANA靶抗原
多核苷酸：
双链DNA、单链DNA、RNA
组蛋白：
H1，H2A，H2B，H3，H4，H2A-H2B复合物
核浆的核糖核蛋白:
U1-nRNP、Sm、SS-A（Ro）、SS-B（La）、Ku、Mi-1、Mi-2、核点、增殖性细胞核抗原…
核仁抗原：
Scl-70、U3-nRNP/原纤维蛋白、RNA多聚酶I、PM-Scl（PM-1）、7-2-RNP（To）、4-6-S-RNA、核仁形成中心（NOR）…
核膜抗原：
板层素（层粘连蛋白）
着丝点：
着丝点蛋白
……
ANA检出率
与年龄和性别有关
与个体的免疫稳定性相关
使用足够敏感的方法，每个人都可检测出一些ANA。
_________天然ANA_________
生理性自身免疫
维持机体内环境的生理稳定。
滴度较低，亲和力弱，大多为IgM型。
ANA检测方法
初筛抗核抗体：
IIF
最佳基质：
联合生物薄片（HEp-2细胞/猴肝冰冻组织）
区分抗核抗体的靶抗原：
ELISA、印迹法和免疫印迹法
ANA初筛
IFT：
HEp-2细胞/灵长类肝脏
完整的抗原谱（细胞核及细胞浆）
可预测靶抗原
协助检测其它项目（如ANCA、ENA）
ELISA：
采用高度纯化的抗原初筛ANA
抗原谱有限
操作简单快速
采用滴定平板技术进行间接免疫荧光实验
为了使实验操作标准化，欧蒙开发了滴定平板技术?
:
滴加标本或标记抗体至加样板的反应区，然后将生物薄片载片盖在加样板表面的凹槽里，这时，载片上的所有生物薄片均与液滴接触，反应同时开始。
系统的几何结构决定了液滴的位置和高度。
因为液体被局限在一封闭的空间里，所以不再需要传统的“湿盒”。
并且可在一致的反应条件下同时温育任何数量的标本。
准备：
检查加样板是否反应区亲水而周边疏水？
如果不是，可用湿纸巾擦拭，必要时可使用家用洗涤剂或ExtranMA01（默克公司），再用水彻底冲洗。
需要消毒时，可于3％的SekuseptExtra（汉高公司）中浸泡1小时。
只有当载片平衡到室温后方可打开袋子。
不要触及生物薄片。
按照要求用记号笔对玻片进行标记。
稀释：
按照试剂盒使用说明稀释血清标本。
每次实验均需加入阳性和阴性对照。
对照血清使用前必须混匀。
加样：
在加样板的每个反应区加入稀释血清，避免产生气泡。
滴加完所有待测标本后才开始温育（一次最多200份）。
使用聚苯乙烯加样板。
加样体积:
10µ
l/反应区（3x3mm）
25µ
l/反应区（5x5mm）
70µ
l/反应区（7x9mm）
温育：
将载片盖在加样板对应的凹槽里，反应即开始。
确保每个标本均能够与生物薄片相接触，而标本之间不相互接触。
室温温育30分钟。
清洗：
用烧杯盛PBS-Tween缓冲液，流水冲洗载片，然后立即放入装有PBS-Tween缓冲液的小杯中浸洗至少5分钟。
冲洗1秒钟
小杯内浸洗5分钟
将荧光标记的抗人免疫球蛋白（酶结合物）加入洁净加样板的每个反应区。
完全加完所有的二抗后，方可继续温育（最多可加50个载片）。
使用连续加样器。
加样前应使用加样器混匀。
为节约时间，可在第一步温育的同时滴加酶结合物至另一个加样板的反应区中。
20µ
60µ
从PBS-Tween清洗缓冲液中取出一张载片，5秒钟内用吸水纸擦一下背面和边缘后，立即将载片覆有生物薄片的一面朝下，盖在加样板的凹槽里。
注意：
为防止破坏基质，不要擦拭反应区的间隙。
检查生物薄片是否与液滴接触良好，然后继续下一张。
从现在开始，注意避免阳光直射载片。
可在每150ml磷酸盐缓冲液中加10滴（150µ
l）伊文氏蓝进行复染。
封片：
在盖玻片上滴加甘油/PBS。
使用聚苯乙烯封片板。
从PBS-Tween清洗缓冲液中取出一张载片，用纸擦干背面和四边，注意不要擦拭反应区间隙。
将载片的生物薄片朝下置于准备好的盖玻片上，立即检查盖玻片是否放入载片的凹槽里，如有必要，需调整位置，正确放置。
然后再进行下一个载片的操作。
封片体积:
结果判断：
荧光显微镜下观察荧光。
具体操作
荧光工作台的布置
清洗
载片的擦拭
封片
ANA的结果
间接免疫荧光法的独特优势
（一种基质–可筛查上百种不同的抗体
）
用HEp-2细胞检测自身抗体
ANA荧光模型
核均质型
核仁型
核颗粒型
胞浆型
ANA确认实验
（1）
IFT:
-HEp-2细胞/灵长类肝脏：
特殊的荧光模型
如着丝点、核膜型、核糖体P蛋白、肌动蛋白
ELISA:
-ANA分项（含ENA谱）:
包被高度纯化抗原
斑点法/印迹法
-ENA谱:
采用各种高度纯化的抗原
抗ENA谱
印迹法：
抗ENA谱
抗ENA谱
免疫印迹法
ANA确认实验
（2）
Westernblot:
HEp-2细胞提取物
-
定性
适宜特别需要（如区分靶抗原Ro52或Ro60）
检测目前无法纯化的靶抗原的抗体（如PM-Scl、Ku）
结
论
初筛实验：
免疫荧光技术（HEp-2细胞/灵长类肝脏）
ELISA
（纯化的多种核抗原）
确认实验：
ELISA
印迹法
斑点法
Westernblot
ANA谱与相关疾病
相关疾病的ANA谱
ANA的各种荧光模型、靶抗原及相关性
高滴度的ANA仅出现在自身免疫性疾病中
自身免疫性疾病
ANA阳性率（％）
系统性红斑狼疮
活动期
95－100
非活动期
80－100
药物诱导的红斑狼疮
100
混合性结缔组织病
100
类风湿性关节炎
20－40
进行性系统性硬化症
20－50
多发性肌炎及皮肌炎
85－95
干燥综合征
30－50
慢性活动性肝炎
70－80
溃疡性结肠炎
其它风湿病
26
SLE抗核抗体的检出率
靶抗原
检出率（%）
dsDNA
30-90
Sm
5-30
核糖体P蛋白
5-15
周期蛋白I（PCNA）
3
ssDNA
70-95
组蛋白
40-80
U1-nRNP
15-40
SS-A
20-60
SS-B
10-20
Ku
5-10
心磷脂、b2-GP1
20-40
抗细胞抗体荧光模型（immunofluorescentpattern）
常见的荧光染色模型有6种：
核均质型（homogeneous
pattern，H）
核颗粒型（Granuloguspattern，S）
核仁型（nucleous
pattern，N）
核膜型（membranous
pattern，M）
着丝点型（centromert
pattern，ACA）
胞浆型（cytoplasmic
pattern，ACYA）
HEp-2细胞/灵长类肝脏：
核均质型
ssDNA/dsDNA
靶抗原：
单链、非天然DNA（嘌呤和嘧啶硷基对）
双链、天然DNA（脱氧核糖核酸结构）
相关性：
ssDNA
类风湿
80.8%
SLE
40.0%
44.0%
皮肌炎
12.3%
类风湿性关节炎
51.7%
献血员
6.8%
30%-90%
抗dsDNA：
绿蝇短膜虫
组蛋白
组蛋白H1、H2A、H2B、H3、H4
（主要抗原H1和H2B）
功能：
形成核小体
药物诱导性LE:
100%（唯一的标志抗体）
SLE：
40%-80%
其它风湿性疾病：
少见
HEp-2细胞/灵长类肝脏：
抗RNP/Sm
U1-nRNP
与U1-nRNA连接的3个蛋白分子（70K、A和C蛋白）
切割pre-mRNA
MCTD:
95%-100%
SLE:
15%-40%
抗Sm抗体
与U1-、U2-、U4-、U5-或U6-nRNA
连接的6种不同蛋白分子
（coreproteinsB,B´
D,E,F,G）
SLE:
5%-30%
HEp-2细胞/灵长类肝脏:
抗核糖体P蛋白
抗核糖体P蛋白抗体
抗原：
核糖体的亚单位（60S）,3个蛋白分子组成:
P0、P1、P2（38、19、17kDa）。
在碳末端具有相似的免疫反应表位。
蛋白合成易位过程中的辅蛋白
SLE：
5%-15%
原发性干燥综合征的抗体谱
阳性率（%）
40-95
HEp-2细胞/灵长类肝脏：
抗SS-A/SS-B
抗SS-A抗体
与Y1,Y3,Y4或Y5型RNA连接的2个蛋白（52kDa和60kDa）
调节mRNA的转译活性
干燥综合征：
40%-95%
20%-60%
抗SS-B抗体
与小分子RNA（U6-RNA,pre-tRNA）结合的磷脂蛋白（48kDa）
RNA多聚酶III的辅蛋白
40%-95%
10%-20%
进行性系统性硬化征的抗体谱
阳性率（%）
着丝点
80-95
Scl-70
25-75
30-60
原纤维蛋白
RNA聚合酶
4
PM-Scl（重叠综合征）
3
NOR-90（核仁形成区）
少见
Ku（多肌炎型重叠综合征）
1-7
抗着丝点抗体
连接动粒（着丝点）上的4个蛋白分子：
A-、B-、C-、D-蛋白，分子量（17、80、140、50kDa）
主要的靶抗原：
着丝点B蛋白（与IIFT相关性：
100%）
与纺锤体纤维连接
硬皮病：
18%
局限性硬化征（CREST综合征）:
80%-95%
抗Scl-70
抗Scl-70抗体
DNA拓扑异构酶I（100kDa）
DNA复制和翻译过程的辅蛋白
25%-75%
HEp-2/灵长类肝脏：
抗PM-Scl
抗PM-Scl抗体
多个蛋白分子的复合物
主要的靶抗原100kDa
（与DNA拓扑异构酶I不同）
未知
2%-5%
肌炎：
8%
重叠综合征：
24%
抗RNA多聚酶
RNA多聚酶I、II和III
多个蛋白亚单位组成的核仁酶复合物
多聚酶I:
转录rRNA基因
多聚酶II:
转录mRNA基因
多聚酶III:
转录tRNA基因
4%
抗原纤维蛋白
抗原纤维蛋白（U3-nRNP）抗体
与基础蛋白（34kDa）连接的U3-nRNA和其它5个蛋白
分离pre-rRNA
皮肌炎：
5%-10%
抗NOR
抗Ku
多肌炎和皮肌炎的抗体谱
升级会员 