免疫荧光检测Word文件下载.docx
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荧光素标记的抗人球蛋白用前需混匀并以PBS-Tween缓冲液稀释。
7.冲洗:
8.封片:
将盖片直接放于泡沫塑料板凹槽中,滴加甘油/PBS至盖片:
每反应区约10μl。
从PBS-Tween缓冲液中取出1张生物薄片,用纸擦干背面和四边。
还要擦拭反应区间隙。
将生物薄片面朝下放在已准备好的盖玻片上,立即查看并调整使盖片嵌入载片的凹槽中。
然后继续下1张。
结果判定
荧光显微镜下观察
1.细胞核发黄绿色荧光为阳性染色细胞,不发荧光为阴性。
抗原片中出现阳性染色细胞为ANA阳性,否则为阴性。
阳性待检血清可作进一步稀释后测定效价。
2.根据细胞核着染色荧光的图像,可区分为:
①均质型:
细胞核呈均匀一致的荧光;
②周边型(核膜型):
细胞核周围呈现荧光;
③斑点型(颗粒型):
细胞核内呈现斑点状荧光;
④核仁型:
核仁部分呈现荧光。
⑤混合型:
两种以上核染色;
⑥应用细胞片做抗原片可检出着点型(ACA)
注意事项
1.PBS-Tween缓冲液在4℃下可存放两周。
2.根据每次实验的标本量决定需要稀释的FITC标记的抗人球蛋白的量,稀释后可在4℃下可存放1周。
3.血清或FITC标记的抗人Ig应滴加至加样板上,不能直接滴到载片上。
4.载片盖到加样板上后,确保反应区与液滴完全接触后,才开始记时温育。
5.冲洗载片时水流要缓慢,以免冲洗掉基质。
载片上的反应区应保持湿润,不要将载片风干。
6.封片进不可用力挤压盖玻片,以免损坏基质。
可左右挪动盖玻片以使其正确嵌入载片凹槽里。
7.封片介质含有荧光稳定剂,应保存在2-8℃。
封好的载片可于4℃长期保存。
实验讨论
方法评价
间接免疫荧光技术是检测ANA最常用的方法。
该方法简便、敏感,且可根据核染色形态确定核抗原的类型。
鼠肝印片细胞分布不均匀,多有重叠,冲洗时易丢失。
Hep-2细胞具有核大、有丝分裂旺盛、核内细胞器较明显、具备人源性抗原的特征,对诊断和鉴别不同类型的自身免疫病十分有利。
检测抗核抗体(ANA)的实验方案
ANA简介
抗核抗体(antinuclear
antibodies,ANAs)
经典定义:
针对细胞核成分的一大组抗体谱。
抗核抗体新概念(FANA)
传统定义:
顾名思义是指抗细胞核抗原成分的自身抗体的总称®
狭义定义
现代定义:
是指抗细胞内所有抗原成分的自身抗体的总称。
对ANA的理解已不再局限于核成分,而是指抗核酸(nucleicacid)和核蛋白(nucleoprotein)抗体的总称®
广义定义
靶抗原分布:
细胞核
细胞核、细胞浆、细胞骨架、细胞分裂周期
抗核抗体检测方法
检测细胞内抗原自身抗体“金标准”-IIF
ANA检测方法进展:
仅限于IIF改良法(底物选择、制备方法)试图将ELISA发推广为最基本的筛选方法未获成功
复制细胞抗原全部成分极其困难®
抗原存在的相对浓度、自然抗原决定簇的二级结构及高级结构
荧光染色模型可初步判断相应抗体性质范围或确定抗体特异性
IIF法:
HEp-2细胞底物(90%以上实验室采用)
#完整的ANAs抗原谱(细胞核、浆、骨架、周期)
#可预测分析ANA靶抗原范围
#经验性强
ELISA法:
采用高度纯化抗原或全细胞抗原
#抗原谱有限(十余种)
#
假阴性结果
#操作简单快速
其他方法:
金标法、比浊法
ANA靶抗原
多核苷酸:
双链DNA、单链DNA、RNA
组蛋白:
H1,H2A,H2B,H3,H4,H2A-H2B复合物
核浆的核糖核蛋白:
U1-nRNP、Sm、SS-A(Ro)、SS-B(La)、Ku、Mi-1、Mi-2、核点、增殖性细胞核抗原…
核仁抗原:
Scl-70、U3-nRNP/原纤维蛋白、RNA多聚酶I、PM-Scl(PM-1)、7-2-RNP(To)、4-6-S-RNA、核仁形成中心(NOR)…
核膜抗原:
板层素(层粘连蛋白)
着丝点:
着丝点蛋白
……
ANA检出率
与年龄和性别有关
与个体的免疫稳定性相关
使用足够敏感的方法,每个人都可检测出一些ANA。
_________天然ANA_________
生理性自身免疫
维持机体内环境的生理稳定。
滴度较低,亲和力弱,大多为IgM型。
ANA检测方法
初筛抗核抗体:
IIF
最佳基质:
联合生物薄片(HEp-2细胞/猴肝冰冻组织)
区分抗核抗体的靶抗原:
ELISA、印迹法和免疫印迹法
ANA初筛
IFT:
HEp-2细胞/灵长类肝脏
完整的抗原谱(细胞核及细胞浆)
可预测靶抗原
协助检测其它项目(如ANCA、ENA)
ELISA:
采用高度纯化的抗原初筛ANA
抗原谱有限
操作简单快速
采用滴定平板技术进行间接免疫荧光实验
为了使实验操作标准化,欧蒙开发了滴定平板技术?
:
滴加标本或标记抗体至加样板的反应区,然后将生物薄片载片盖在加样板表面的凹槽里,这时,载片上的所有生物薄片均与液滴接触,反应同时开始。
系统的几何结构决定了液滴的位置和高度。
因为液体被局限在一封闭的空间里,所以不再需要传统的“湿盒”。
并且可在一致的反应条件下同时温育任何数量的标本。
准备:
检查加样板是否反应区亲水而周边疏水?
如果不是,可用湿纸巾擦拭,必要时可使用家用洗涤剂或ExtranMA01(默克公司),再用水彻底冲洗。
需要消毒时,可于3%的SekuseptExtra(汉高公司)中浸泡1小时。
只有当载片平衡到室温后方可打开袋子。
不要触及生物薄片。
按照要求用记号笔对玻片进行标记。
稀释:
按照试剂盒使用说明稀释血清标本。
每次实验均需加入阳性和阴性对照。
对照血清使用前必须混匀。
加样:
在加样板的每个反应区加入稀释血清,避免产生气泡。
滴加完所有待测标本后才开始温育(一次最多200份)。
使用聚苯乙烯加样板。
加样体积:
10µ
l/反应区(3x3mm)
25µ
l/反应区(5x5mm)
70µ
l/反应区(7x9mm)
温育:
将载片盖在加样板对应的凹槽里,反应即开始。
确保每个标本均能够与生物薄片相接触,而标本之间不相互接触。
室温温育30分钟。
清洗:
用烧杯盛PBS-Tween缓冲液,流水冲洗载片,然后立即放入装有PBS-Tween缓冲液的小杯中浸洗至少5分钟。
冲洗1秒钟
小杯内浸洗5分钟
将荧光标记的抗人免疫球蛋白(酶结合物)加入洁净加样板的每个反应区。
完全加完所有的二抗后,方可继续温育(最多可加50个载片)。
使用连续加样器。
加样前应使用加样器混匀。
为节约时间,可在第一步温育的同时滴加酶结合物至另一个加样板的反应区中。
20µ
60µ
从PBS-Tween清洗缓冲液中取出一张载片,5秒钟内用吸水纸擦一下背面和边缘后,立即将载片覆有生物薄片的一面朝下,盖在加样板的凹槽里。
注意:
为防止破坏基质,不要擦拭反应区的间隙。
检查生物薄片是否与液滴接触良好,然后继续下一张。
从现在开始,注意避免阳光直射载片。
可在每150ml磷酸盐缓冲液中加10滴(150µ
l)伊文氏蓝进行复染。
封片:
在盖玻片上滴加甘油/PBS。
使用聚苯乙烯封片板。
从PBS-Tween清洗缓冲液中取出一张载片,用纸擦干背面和四边,注意不要擦拭反应区间隙。
将载片的生物薄片朝下置于准备好的盖玻片上,立即检查盖玻片是否放入载片的凹槽里,如有必要,需调整位置,正确放置。
然后再进行下一个载片的操作。
封片体积:
结果判断:
荧光显微镜下观察荧光。
具体操作
荧光工作台的布置
清洗
载片的擦拭
封片
ANA的结果
间接免疫荧光法的独特优势
(一种基质–可筛查上百种不同的抗体
)
用HEp-2细胞检测自身抗体
ANA荧光模型
核均质型
核仁型
核颗粒型
胞浆型
ANA确认实验
(1)
IFT:
-HEp-2细胞/灵长类肝脏:
特殊的荧光模型
如着丝点、核膜型、核糖体P蛋白、肌动蛋白
ELISA:
-ANA分项(含ENA谱):
包被高度纯化抗原
斑点法/印迹法
-ENA谱:
采用各种高度纯化的抗原
抗ENA谱
印迹法:
抗ENA谱
抗ENA谱
免疫印迹法
ANA确认实验
(2)
Westernblot:
HEp-2细胞提取物
-
定性
适宜特别需要(如区分靶抗原Ro52或Ro60)
检测目前无法纯化的靶抗原的抗体(如PM-Scl、Ku)
结
论
初筛实验:
免疫荧光技术(HEp-2细胞/灵长类肝脏)
ELISA
(纯化的多种核抗原)
确认实验:
ELISA
印迹法
斑点法
Westernblot
ANA谱与相关疾病
相关疾病的ANA谱
ANA的各种荧光模型、靶抗原及相关性
高滴度的ANA仅出现在自身免疫性疾病中
自身免疫性疾病
ANA阳性率(%)
系统性红斑狼疮
活动期
95-100
非活动期
80-100
药物诱导的红斑狼疮
100
混合性结缔组织病
100
类风湿性关节炎
20-40
进行性系统性硬化症
20-50
多发性肌炎及皮肌炎
85-95
干燥综合征
30-50
慢性活动性肝炎
70-80
溃疡性结肠炎
其它风湿病
26
SLE抗核抗体的检出率
靶抗原
检出率(%)
dsDNA
30-90
Sm
5-30
核糖体P蛋白
5-15
周期蛋白I(PCNA)
3
ssDNA
70-95
组蛋白
40-80
U1-nRNP
15-40
SS-A
20-60
SS-B
10-20
Ku
5-10
心磷脂、b2-GP1
20-40
抗细胞抗体荧光模型(immunofluorescentpattern)
常见的荧光染色模型有6种:
核均质型(homogeneous
pattern,H)
核颗粒型(Granuloguspattern,S)
核仁型(nucleous
pattern,N)
核膜型(membranous
pattern,M)
着丝点型(centromert
pattern,ACA)
胞浆型(cytoplasmic
pattern,ACYA)
HEp-2细胞/灵长类肝脏:
核均质型
ssDNA/dsDNA
靶抗原:
单链、非天然DNA(嘌呤和嘧啶硷基对)
双链、天然DNA(脱氧核糖核酸结构)
相关性:
ssDNA
类风湿
80.8%
SLE
40.0%
44.0%
皮肌炎
12.3%
类风湿性关节炎
51.7%
献血员
6.8%
30%-90%
抗dsDNA:
绿蝇短膜虫
组蛋白
组蛋白H1、H2A、H2B、H3、H4
(主要抗原H1和H2B)
功能:
形成核小体
药物诱导性LE:
100%(唯一的标志抗体)
SLE:
40%-80%
其它风湿性疾病:
少见
HEp-2细胞/灵长类肝脏:
抗RNP/Sm
U1-nRNP
与U1-nRNA连接的3个蛋白分子(70K、A和C蛋白)
切割pre-mRNA
MCTD:
95%-100%
SLE:
15%-40%
抗Sm抗体
与U1-、U2-、U4-、U5-或U6-nRNA
连接的6种不同蛋白分子
(coreproteinsB,B´
D,E,F,G)
SLE:
5%-30%
HEp-2细胞/灵长类肝脏:
抗核糖体P蛋白
抗核糖体P蛋白抗体
抗原:
核糖体的亚单位(60S),3个蛋白分子组成:
P0、P1、P2(38、19、17kDa)。
在碳末端具有相似的免疫反应表位。
蛋白合成易位过程中的辅蛋白
SLE:
5%-15%
原发性干燥综合征的抗体谱
阳性率(%)
40-95
HEp-2细胞/灵长类肝脏:
抗SS-A/SS-B
抗SS-A抗体
与Y1,Y3,Y4或Y5型RNA连接的2个蛋白(52kDa和60kDa)
调节mRNA的转译活性
干燥综合征:
40%-95%
20%-60%
抗SS-B抗体
与小分子RNA(U6-RNA,pre-tRNA)结合的磷脂蛋白(48kDa)
RNA多聚酶III的辅蛋白
40%-95%
10%-20%
进行性系统性硬化征的抗体谱
阳性率(%)
着丝点
80-95
Scl-70
25-75
30-60
原纤维蛋白
RNA聚合酶
4
PM-Scl(重叠综合征)
3
NOR-90(核仁形成区)
少见
Ku(多肌炎型重叠综合征)
1-7
抗着丝点抗体
连接动粒(着丝点)上的4个蛋白分子:
A-、B-、C-、D-蛋白,分子量(17、80、140、50kDa)
主要的靶抗原:
着丝点B蛋白(与IIFT相关性:
100%)
与纺锤体纤维连接
硬皮病:
18%
局限性硬化征(CREST综合征):
80%-95%
抗Scl-70
抗Scl-70抗体
DNA拓扑异构酶I(100kDa)
DNA复制和翻译过程的辅蛋白
25%-75%
HEp-2/灵长类肝脏:
抗PM-Scl
抗PM-Scl抗体
多个蛋白分子的复合物
主要的靶抗原100kDa
(与DNA拓扑异构酶I不同)
未知
2%-5%
肌炎:
8%
重叠综合征:
24%
抗RNA多聚酶
RNA多聚酶I、II和III
多个蛋白亚单位组成的核仁酶复合物
多聚酶I:
转录rRNA基因
多聚酶II:
转录mRNA基因
多聚酶III:
转录tRNA基因
4%
抗原纤维蛋白
抗原纤维蛋白(U3-nRNP)抗体
与基础蛋白(34kDa)连接的U3-nRNA和其它5个蛋白
分离pre-rRNA
皮肌炎:
5%-10%
抗NOR
抗Ku
多肌炎和皮肌炎的抗体谱