电化学发光检测技术原理.pptx

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,ElecsysPrinciple,电化学发光检测原理及要点解读,标记免疫技术的发展电化学发光检测原理电化学发光的技术特点校准概念及溯源性校准报警分析常见数据报警分析试剂特性解读检测菜单介绍,主要内容,放免,酶免荧光免疫化学发光,电化学发光,1960S,197080S,2000S,1，抗体技术的革命，从使用多克隆抗体向使用单克隆抗体转变2，从手工操作向全自动分析仪的转变3，从液相放射免疫技术向均相和固相免疫分析技术的转变,标记免疫技术的发展,缺点半衰期短，试剂货架期短标记物不稳定每次需做标准曲线反应时间长，不易自动化检测使用放射性核素，需要一定防护,优点分子量小,免疫损耗小简便、灵敏、特异可自行设计试剂盒应用范围广,标记物:

碘125,标记免疫技术的发展放射免疫测定法（RIA）,底物:

无需底物,优势灵敏度较高试剂稳定较快的速度无污染,缺点包被表面积小（灵敏度和速度）包被均一性不足（精密度）检测技术多为颜色反应（特异性和灵敏度）反应时间不一致,造成结果的偏差（特别在手工操作时）,标记免疫技术的发展酶联免疫测定法（ELISA）,标记物:

HRP辣根过氧化物酶/ALP碱性磷酸酶,底物:

TMB四甲基联苯胺/对硝基苯磷酸酯P-NPP,优势灵敏度较高成本较低荧光检测信号操作简便,缺点传统的微板吸附包被技术均一性差、重复性差批量检测不能实现全自动每次检测需要做定标曲线，浪费成本,样本的前处理技术操作过程完全同ELISA方法,标记免疫技术的发展时间分辨荧光免疫（TRFIA）,标记物：

铕（Eu3+）、钐（Sm3+）等镧系元素底物:

镧系元素螯合物,标记物：

ALP碱性磷酸酶底物：

MUP（4甲基伞形酮酰磷酸）激发物：

光最终检测信号：

荧光强度代表产品：

美国AbbottAXSYM法国bioMrieuxVIDAS,标记免疫技术的发展酶荧光免疫测定法（MEIA）,标记物：

HRP辣根过氧化物酶/ALP碱性磷酸酶发光底物：

鲁米洛、金刚烷激发物：

特定的化学环境最终检测信号：

可见光强度代表产品：

美国J&JOrthoVitrosEci美国BeckmanCoulterAccess,Dxi800,标记免疫技术的发展酶促化学发光免疫（CLIA）,标记物：

吖啶酯,吖啶酯衍生物发光底物：

无需底物,标记物直接发光激发物：

特定的化学环境最终检测信号：

可见光强度代表产品：

德国SIEMENSCentaurXP美国AbbottI2000,标记免疫技术的发展直接化学发光（CLIA）,标记物：

三联吡啶钌发光底物：

三丙胺激发物：

直流电场最终检测信号：

可见光强度代表产品：

罗氏公司e411,E170,e601,e602,标记免疫技术的发展电化学发光（ECLIA）,标记免疫技术的发展电化学发光检测原理电化学发光的技术特点校准概念及溯源性校准报警分析常见数据报警分析试剂特性解读检测菜单介绍,主要内容,电化学发光免疫检测原理-名称的由来,ELECTRO电,CHEMI化学,LUMINESCENCE发光,IMMUNO免疫,ASSAY分析,电化学发光免疫测定系统Elecsys,电化学发光,链霉亲和素-生物素间接包被技术,磁性微粒子固相载体,检测系统,电化学发光免疫检测原理-技术特点,专利的电化学发光技术,标记物：

三联吡啶Ru（bpy）32+递电子体：

三丙胺TPA反应启动方式:

直流电场,电化学发光免疫检测原理-电化学发光,里程碑式的标记物：

三联吡啶钌,水溶性，分子量小结构稳定，免疫损伤小,易于标记应用广泛（激素，DNA等）与三丙胺（Tripropylamine,TPA）共同构成电化学发光系统,三联吡啶钌Ru（bpy）32+NHS（N羟基琥珀酰胺酯）,电化学发光免疫检测原理-标记物,电极表面的电化学发光反应,电化学发光免疫检测原理-电化学发光的反应过程,发光标记物:

三联吡啶钌Ru（bpy）32+,三联吡啶钌“催化”三丙胺发出可见光,反应产物:

三丙胺自由基（TPA*）+620nm的光子,发光底物:

三丙胺（TPA）,电化学发光启动条件:

直流电场,反应特点:

迅速,可控,循环发光,CH3CH2CH2-N-CH2CH2CH3,CH2CH2CH3,CH3CH2CH2-N-CH2CH2CH3,失e-,CH2CH2CH3,CH3CH2CH2-N-C-CH2CH3,CH2CH2CH3,失H+,CH3CH2CH2-N-H,CH2CH2CH3,+CH3CH2CHO,.+,.,H,氧化,Ru（bpy）33+,激发态Ru（bpy）32+,基态Ru（bpy）32+,还原,电化学发光免疫检测原理电化学发光的反应过程,三丙胺,阳离子三丙胺自由基,三丙胺自由基,-e-,电极,电极,失e-,+,丙醛,二丙胺,独特的磁性微粒作为固相载体,直径2.8um表面的凸凹使包被面积放大悬浮于反应体系中，形成均一稳定的液相,大大提高反应效能磁性微珠易于通过磁场磁性吸引和分离,电化学发光免疫检测原理-固相载体,显微镜下的磁微粒,生物素与链霉素特异性亲和作用反应体系中待测抗原可最大限度地与磁珠结合提高检测反应的灵敏度,形成的免疫复合物转移至测量池开始ECL反应,电化学发光免疫检测原理-固相载体,生物素,抗体,抗原,磁珠,链霉亲和素,电化学发光免疫检测原理-链霉亲和素和生物素技术,专利的链霉亲和素生物素系统,电化学发光免疫检测原理-链霉亲和素和生物素技术,+,=,适用于包被各种化合物，如多肽、脂多糖。

SA均匀牢固地包被在磁性微粒上,链霉亲和素-生物素包被技术Streptoavidin,SABiotin，B,B衍生物结合的抗原或抗体与标本进行液相反应,电化学发光免疫检测原理链霉亲和素和生物素技术,抗体,ECLIA反应步骤,氧化还原反应，发射出光子,B,抗体,抗原,三联吡啶钌,生物素,SA,亲和素,磁性颗粒,电化学发光免疫检测原理反应步骤,ECL检测原理ElectroChemiLuminescence（ECL）,电化学发光技术,ECL检测原理免疫复合物的形成,Source:

RocheDiagnosticsResearchandDevelopment,电极,电极,工作电极,磁铁,光电倍增管,TPA,TPA,TPA,TPA,电化学发光免疫检测原理测量室中的反应,1.使用清洗液（CleanCell）清洁测量室,2.移入磁铁,并使用TPA清洁测量室活化电极,3.反应复合物随TPA一起吸入测量室,4.工作电极加电压,6.移开磁铁，TPA冲走所有反应物。

磁微粒被吸附,未结合到固相的游离标记物被冲走,7.使用清洗液（Cleancell）清洁测量室。

5.电极表面反应后发出光子,同时PMT检测光子信号,测量室组成和结构,电化学发光免疫检测原理测量室的结构,流动测量室可升降的磁性分离系统彻底的清洗系统高度自动化,电化学发光免疫检测原理分析类型,夹心法,竞争法,桥联法,电化学发光免疫检测原理夹心法检测原理,1.加入R1-生物素结合的抗体,2.加入R2-Ru（bpy）32+标记的的抗体,3.加入待测样本，温育9min，形成双抗夹心复合物,4.加入M-亲和素包被的磁微粒,温育9min，钌标记物通过待测样本和亲和素生物素连接到磁微粒上。

5.反应复合物被吸入测量室进行磁性分离及其电化学发光测量。

Reagent,sipper,Reagent,夹心法,测定成正比：

信号低=浓度低信号高=浓度高,检测有多个结合位点的抗原如TSH，HCG，HBsAg，AFP等,电化学发光免疫检测原理夹心法检测原理,测定大分子抗原,电化学发光免疫检测原理竞争法检测原理,1.加入R1-Ru（bpy）32+标记的抗体,2.加入待测样本，温育9min，形成抗原抗体复合物。

-,3.加入R2-生物素标记的与样本同源的抗体。

4.,加入M-亲和素包被的磁微粒；温育9min。

未与待测抗原结合的钌标记物通过R2结合到磁微粒上,5.反应复合物被吸入测量室进行磁性分离及其电化学发光测量。

eagent,sipper,Reagent,竞争法,测定成反比：

信号低=浓度高信号高=浓度低,检测仅一个结合位点的抗原等如FT3，E2，HBcAb等。

测定小分子抗原,电化学发光免疫检测原理竞争法检测原理,桥联法（BridgingPrinciple）,电化学发光免疫检测原理桥联法检测原理,理论基础：

单位IgG分子具有2个抗原结合位点二聚体分泌型IgA具有4个抗原结合位点五聚体IgM可有10个抗原结合位点,检测相应的IgG和IgM抗体总量。

如HBcAb,测定成正比：

信号低=浓度低信号高=浓度高,双抗原夹心测定抗体,标记免疫技术的发展电化学发光检测原理电化学发光的技术特点校准概念及溯源性校准报警分析常见数据报警分析试剂特性解读检测菜单介绍,主要内容,电化学发光免疫检测原理发光及检测系统,直流电场1.5v电压启动,0.2-0.6秒达到发光峰值,发光光子数,可控迅速放大,稳定的试剂,电化学发光免疫检测原理稳定的试剂,mIU/ml,37,2010.1和2014.9全球客户端FSH病人结果分布,mIU/ml,%,美国FT4项目20个不同批号的的病人结果分布,2010.1-2014.9全球客户端FSH中位值变化,%,pMol/l,电化学发光免疫检测原理优异的结果稳定性,宽广的线性范围,电化学发光免疫检测原理线性范围,光子数范围:

0-10,000,000（1亿）,超宽的线性范围及检测灵敏度,电化学发光免疫检测原理宽线性及灵敏度,电化学发光免疫检测原理简单的试剂管理,多模块通用试剂E170,e411,e601,e602二维条形码自动输入全部信息试剂联体包成分独立稳定好无需配制，即开即用自动开闭试剂瓶盖，有效地防止挥发等,标记免疫技术的发展电化学发光检测原理电化学发光的技术特点校准概念及溯源性校准报警分析常见数据报警分析试剂特性解读检测菜单介绍,主要内容,1.参考系统标准曲线ReferenceStandardCurve（Roche研发部）根据“WHO”的标准化要求使用1012个点与试剂批号无关是制作主校准曲线（mastercalibrator）的基础,电化学发光校准概念校准传递,2.主校准曲线MasterCalibrationCurve（Roche生产部）使用5或6个点（mastercalibrators）使用特定批号的试剂（一级试剂，masterreagent）总曲线的形状是用依照Rodbard功能的4个参数来描绘的主校准曲线数据被编码进了特定批号试剂的2维条形码靶值被编码进了校准试剂盒（CalSet）的条形码中,电化学发光校准概念校准传递,3.客户端的校准测试2个校准品（CalSet1和CalSet2）校准品的测量结果按照数学方法的计算结合到与CalSet或试剂盒上的2维条形码信息上仪器能够自动判断批校准（LotCalibration）和盒校准（RegentPackCalibration）样品结果的计算都是从这条定标曲线上的来的,电化学发光校准概念校准传递,电化学发光校准概念批校准与盒校准,首次注册时间24小时,满足校准通过条件,生成批校准,校准生成之后的所有该批号新上机试剂盒使用此批曲线,首次注册时间24小时,满足校准通过条件,盒校准生成,无法生成批校准,校准曲线仅适用该盒试剂,试剂盒或配套试剂过期,满足校准通过条件,盒校准生成,无法生成批校准,校准曲线仅适用该盒试剂,试剂盒,批校准可以传递给相同批号的其他试剂盒,盒校准只能适用于本试剂盒,点击屏幕左上角图标进入系统概览界面,选择试剂位,点击Detail,点击e601,点击ReagentOverview,电化学发光校准概念试剂首次注册时间,校准频率建议：

按照需要：

例如质控结果超出特定的范围通常每28天进行一次批校准（当使用相同的试剂批号时）每7天进行一次2点校准（当使用同一试剂盒时）如果需要的话更频繁的校准（如ATPO，ATSHR等项目需每日校准）,电化学发光校准概念校准曲线的稳定性,在同一测量通道上，批校准可以传递给相同批号的试剂盒系统会根据试剂的第