体细胞重编程综述Word文档格式.docx
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1.卵细胞和卵母细胞的核移植
首次证明可以通过实验方法逆转细胞分化状态的证据来自于将一个存活的细胞核移植到去核的蛙卵实验。
Briggs和King首次成功实现通过移植Ranapipiens的囊胚细胞核产生会游动的蝌蚪。
但是，他们发现如果移植的是处于胚胎发育较晚阶段（肠胚）的细胞核的时候，就会导致非正常发育。
于是，他们提出细胞分化可能涉及不可逆转的细胞核转变。
不久之后，有人在南非青蛙Xenopuslaevis上进行相似的实验。
按照同样的实验方法，他们发现即使用于移植的核是来自于完全分化的细胞，在该实验中是供体蛙的小肠上皮，也能得到发育完全正常并且具有生育能力的雄性和雌性青蛙。
这些实验结果告诉人们，细胞分化是可以被完全逆转的，并且不可逆的细胞核变化是非必须的。
这一过程涉及细胞核基因表达的变化，但并不涉及到基因本身。
因此，即使在发育过程中细胞变成彼此不同，具有各自功能但都稳定存在的个体，但是基因组在所有不同的细胞类型内都是一样的（产生抗体的免疫细胞除外），它们因此保持形成其他不同类型细胞的潜力。
这一领域的突破来自于多利羊的实验，这个实验通过将成体羊身上分离出来，并且在体外培养的乳腺细胞的细胞核移植到去了细胞核的羊卵内，从而产生出正常成体山羊。
多利羊以及后来的探索表明，可以利用成体哺乳动物的细胞核来完全逆转细胞分化过程，并且提示，这一个机制可能也适用于人类。
通过移植成体猴细胞核，能够得到了猴胚胎干细胞的实验是迈向证明这一假设的重要的一步。
这些具有完善的生长和分化功能的细胞是从用成体猴的细胞核移植到去核猴卵后发育成的胚泡中分离出来的。
因此，在人类的卵子里面也非常可能包含能逆转成体人类细胞分化进程的因子。
2.效率
实现由卵细胞诱导的完全重编程的金标准公认为是产生这样一个成体个体，其包含任何一种细胞类型（被定义为全能性），并且具有生育能力。
但是，从医学治疗的角度看，我们并不认为得到的细胞否具有全能性，甚至多能性（即具有分化成虽然不是所有，但是大多数细胞类型的能力）是一个必须具备的属性。
例如，在治疗上，为一个脊椎损伤的病人提供能分化成任何一种类型细胞的细胞是不必要的。
在讨论体细胞核移植的时候，知道利用来源于完全不相干的另一种细胞的细胞核来进行移植，并且得到特定类型的细胞的效率是很重要的。
已有实验结果显示，细胞核重编程的效率会随着供体细胞的分化程度加深而降低。
通过一系列的核转移实验（从一个核移植胚胎中将细胞核移植到另一系列的去核卵子中）以及核嫁接实验（从一个核移植胚胎中将细胞核移植到从同一品系受精卵发育而来的受体胚胎中），得出了约30％的小肠上皮细胞核能够产生具有功能的肌肉和神经细胞的结论。
在哺乳动物身上，可以从核移植胚泡的细胞中产生胚胎干细胞，并且可将这些细胞移植到正常的受体胚胎中去测试它们的分化能力。
相对于用胚胎细胞核所能达到的30％效率，用已分化细胞的细胞核得到正常动物的效率通常在1％到2％之间。
到目前为止，还没有从相距甚远的异物种组合，包括将人的细胞核移植到猴卵母细胞的细胞质中，从而得到可以传代的胚胎干细胞的证据。
3.机理
用卵子去进行细胞核重编程的一个值得关注的地方是卵子具有以100％的效率重编程定向分化了的精子细胞核的能力。
另外一个优点是利用这一方法并不需要对移植的细胞核及其产生的重编程细胞进行永久的遗传学改变（即病毒插入、强制打开特定基因等）。
因此，发现包含其中的机理就非常重要了。
我们需要解决的问题是为什么重编程能够被成功的实现？
而又是什么因素常常导致这一过程的失败，在即便使用卵子细胞的条件下也是这样？
有人利用卵母细胞（第一次减数分裂早期的雌性生殖细胞，是产生卵子的前体细胞）探索了卵细胞（处于第二次减数分裂中期）的重编程机制。
许多移植进卵母细胞生殖泡的哺乳动物体细胞核被直接重编程而表达干细胞标志基因，包括Oct4,Sox2和Nanog。
在卵母细胞内进行的细胞核重编程不会产生新的细胞，但是与卵子相反的是，这一过程的发生既不需要细胞分裂，也不需要蛋白质的合成。
伴随这个重编程的机理包括：
异染色体的开放；
分化标记，如DNA甲基化的去除，组蛋白修饰以及组蛋白交换等等。
这些事件发生的基础是：
受精卵拥有能引起上述效应的高浓度特定蛋白。
如果卵子的蛋白能够在几秒或几分钟的时间内被交换到移植进来的体细胞核的话，那么完全重编程就应该总会发生。
但是，这个概念却和另一个事实相悖。
那就是卵子常常不能完全重编程植入其中的体细胞核。
如果以上所说的染色体蛋白迅速交换适用于卵子里用来重编程受精卵的细胞核的话，在卵细胞第一次分裂之后，蛙类细胞就会需要一定的时间，并且哺乳动物细胞里应该需要更多的时间去完成彻底的重编程。
但这通常不会发生。
一个可能的原因是移植进来的细胞核携带了供体细胞的表观遗传学记忆。
例如，在肌肉细胞里取出的细胞核，用于重编程后，在重编程的胚胎里发育出来的神经或其他非肌肉细胞里还会强烈的表达肌肉相关的基因。
这可能是由卵子组蛋白里大量存在的H3.3亚型整合到核移植后的供体细胞核里所引起的。
组蛋白H3.3的表达被认为能阻碍重编程的发生，并且会保留以前的基因表达的记忆。
4.细胞融合与细胞提取物
在技术上是有可能让两个细胞发生融合，同时用细胞分裂抑制剂来保证融合后两个细胞核是分离的。
在这些融合体里面，主导细胞，通常是体积较大并且分裂活性较强的那个，会影响另外一个细胞核的基因表达情况。
这方面的例子包括红细胞和体外培养的正在增殖的细胞的融合，以及人类肝脏细胞和肌肉多核细胞的融合。
如果去掉细胞核的一种体细胞的细胞质与另外一种细胞融合的话，它们也会将供体细胞的表达谱强加于受体细胞的细胞核之上。
但是，这些融合细胞生长不佳，因而也没有太大的医学意义。
一些重要的结论可以从上述这些实验中得到。
其一就是细胞核的涨大和染色体的去以染色质化会发生在基因表达谱的重编程之前。
另一个就是新的基因表达谱并不依赖于供体基因表达谱的退去或者细胞分裂。
因此，所以上述这些都不是重编程所必需的。
另一个重要的结论就是，分化的细胞以及胚胎的细胞包含可以改变其他细胞的细胞核基因表达情况的调节分子。
当受体细胞体积非常大的时候，例如卵子或肌肉束（100或更多的肌肉细胞形成的大型细胞），它自身的调节分子大大超过可以让细胞产生出现胚胎干细胞特征的外来调节因子结论就变得可以理解了。
这些分子在正常生理情况下的作用可能是确保这些细胞以及它们的后代不会逃离它们所属的种系或者改变细胞类型。
换据话说，细胞似乎在不停的重编程自我以保持它们自己以及它们的后代保留在原来的品系里面。
5.诱导全能性
这个领域的一个惊人的突破发生在2006年，Takahashi和Yamanaka发现往小鼠成体成纤维细胞里转入四个基因（Oct4,Sox2,c-Myc和Klf4）以后，这些细胞能被诱导成为具有胚胎干细胞特征的细胞。
后来引入Nanog表达的筛选系统后，得到的干细胞移植入具有免疫耐受能力的受体胚胎后，还显示出参与发育的能力。
因此说它们是具有多能性的，所以叫做诱导性多能干细胞，或iPS细胞。
从人的体细胞上获得多能干细胞也需要上述的四个转录因子或者另外一组由Oct4,Sox2,Nanog和Lin28组成的组合。
这些程序现在已经得到确认并且发展。
已被证实iPS细胞可以从终末分化的胃和胰脏细胞中得到，并且在去除癌基因c-Myc情况下也能得到。
这些干细胞似乎与胚胎干细胞并没有多大的区别，并将有可能最终应用在产生病人特异性细胞进行细胞治疗，用于提供合适的能分化为各种组织的细胞来源，或者应用于测试潜在的治疗药物。
但是，这些都必需在通过改良方法而去除由于病毒载体引起的基因组插入隐患后才有可能成为现实。
最近的成果表明，稳定的基因组插入并非必不可少，并且有研究报道可以通过使用腺病毒或者质粒来传导外源基因，从而朝这一方向迈出了一步。
通过导入外源因子而使分化的体细胞变成iPS细胞的机理并不清楚。
因为在早期的实验中，这些细胞出现的比例是如此之低（1000到10000份之一的起始细胞），并且这些被感染的细胞一般要在外源因子存在的情况下增殖将近两个星期，这些似乎偶然形成的iPS细胞的来源确实难以分析。
在某些情况下，多能性状态的维持可能需要抑制分化程序，可能涉及的机制已经在其它综述里提及。
6.品系转变
通过外源表达基因来改变细胞的分化类型在很多年前就由Weintraub通过发现“主导基因”MyoD而提出了。
过表达这个在肌肉细胞里特异表达的转录因子就足以将一系列非肌肉细胞转变成为肌肉细胞了。
然而，在其它一些类型的非肌肉细胞里，这种转变只是暂时的，或者干脆无法观察得到。
在观察到肌肉样的细胞出现之前，在好几个细胞世代里对外源MyoD表达的选择是必需的。
一旦转变成为肌肉细胞以后，MyoD就会激活自身的持续表达，外源MyoD的过表达就不再必需了。
细胞类型的转换在其它好几种细胞类型之间，特别是形成血液的细胞品系之间，也可以通过外源表达一些转录因子来实现。
这些转录因子的相互平衡能激活或抑制决定细胞命运的基因表达。
在这些变化当中，在新的类型细胞形成之前，可能涉及一个倒退到分化程度较低的状态，也就是一个去分化过程。
就MyoD而言，培养的细胞经过许多细胞分裂的选择才能最终形成新的细胞类型。
在这个领域的一个最新的进展就是将胰腺的外分泌细胞直接转变成内分泌的beta细胞。
在这个研究当中，用腺病毒转入三个通常为胰岛beta细胞分化所需的转录因子：
Pdx1，Ngn3和MafA后，就能够将20％的转染上的外分泌细胞转变成能产生胰岛素的beta细胞。
携带外源基因的腺病毒不必整合入外分泌细胞的基因组当中，并且对外源基因表达的需求也是暂时的。
另外，这一品系转变并不需要细胞分裂。
这个细胞品系转换和由Yamanaka最早做出的iPS一样，为转变细胞命运提供一条共同的策略，那就是设法找出一系列的转录因子就能够实现细胞类型之间的转变。
7.蛋白－DNA相互作用和飞速逃逸
细胞分化的两个基本特征影响着我们对细胞核重编程的理解。
一个是每种细胞似乎都表达着一些决定它们分化状态的基因。
这一结论从细胞融合实验中看得尤其明显。
因此，肌肉细胞就会通过自激活高水平的例如MyoD这样的基因去维持自身的状态。
这样，细胞越大，或者越像胚胎干细胞，它就会拥有更多“自我重编程”分子。
因此，卵子在没有添加外源因子的情况下也很容易被重编程。
在所有重编程的实验里，第二个基本特征是当细胞的分化程度变得越高，通过外源基因来重塑表达谱就变得越困难。
分化的细胞状态变得越来越牢固，当细胞开始它们的终末分化道路，并且堵上其它不恰当的分化途径。
了解这个理论是这一领域的一个巨大挑战，并且大量的信息化工作已经在DNA和组蛋白层面上展开了。
一个普遍的假设就是“快速逃逸”策略。
我们提出在非活性基因的调控区DNA和组蛋白的结合会变得越来越紧密。
虽然大多数的蛋白会以几秒钟或几分钟一次的频率解离与之结合的DNA，并且在一些特殊情况还需要更长的时间，一个由多组分组成的蛋白复合物则可能会在DNA上拥有很长的逗留时间。
因此，一个蛋白复合物的所有组分都刚好解离DNA，并且让重编程因子结合上去的几率是非常小的。
在胚胎干细胞里，大多数基因（这些基因在分化的细胞里是具有活性的基因）就会处于一个去浓缩的状态，对大蛋白复合物具有较短的逗留时间。
根据这个假说，无论是通过核移植、细胞融合、iPS还是转分化来实现的重编程发生的几率就依赖于统计学上DNA调控区域的可进入程度、作用时间、转录本的浓度和其它调控因子。
体积大并且拥有大量调节因子的细胞，如卵子和肌肉管，就会像其它通过实验增强转录因子浓度的细胞一样容易被重编程。
在未来，一个重要的突破将会是了解为何分化后的细胞的细胞核比胚胎细胞的细胞核更难以重编程。
这可能需要涉及组蛋白去浓缩化的解释。
8.展望未来
核移植、iPS技术以及转分化之间的机理会不会是一样的呢？
或许不会。
快速逃逸的概念可能都适用于上述几种情况，不过实际上起重编程作用的因子会不尽相同。
我们已经知道卵细胞具有非常高浓度的某些分子，如nucleoplasmin和组蛋白B4以及组蛋白H3.3等。
最终识别出卵细胞重编程因子，可能会有助于改善iPS的效率和找到更多成体细胞之间品系转换的途径。
在未来，具有价值的重编程细胞应该主要集中在一下两类：
一类是从某种遗传病病人身上获得的能够长期培养的细胞系，用以测试潜在的治疗药物或者用于治疗。
另一类是能够提供给用于细胞替换治疗（即再生治疗）的细胞。
作为治疗用途的细胞可能具有的特性包括：
1.能够提供足够的数量；
2.能够在通常情况下不整合入受体组织而发挥它们的作用；
3.能够产生恰到好处数量的产物。
一个人拥有1015个细胞，而一个肝脏包含1014个细胞。
为了达到这个数目，一个以10－4的效率从皮肤产生出来的iPS细胞需要经过大量的细胞分裂周期才可达到。
尽管如此，人体的某些组织需要相当少量的细胞就能改善功能了。
一个例子就是视网膜，仅仅是105的细胞就能具有治疗效应。
要是导入的细胞没有“整合”到受体里面的话，这些细胞还还有利用价值吗？
大部分的组织是由许多不同类型的细胞组成的。
以胰脏为例，包含了外分泌细胞、管道细胞以及胰岛细胞在内至少四种能分泌激素的内分泌细胞。
内分泌细胞的替代治疗具有巨大的治疗价值即使它们并没有整合到胰脏复杂的结构当中。
在某些情况下，导入的细胞即使是以间接的形式也能提供功能上的有利作用。
到目前还不清楚导入的细胞是否能提供适当量度的产物。
展望未来，更多的细胞替代治疗的途径或许会出现，其中一个可能就是找到能够进入细胞内的小分子来取代外源基因导入细胞内，又或许能在成体器官内找到越来越多的自然分裂的细胞群体，并且这些细胞能在体外被培养与扩增，然后用于移植。
未来的研究方向，至少在我们的观点来看，应该锁定在“单一多能性”或者“寡多能性”（只能产生一种多几种细胞类型）的研究，而不是多能性（能分化成三胚层的细胞的能力），也绝不应该是全能性（能分化成所有胚胎和胚胎外细胞类型的能力）。
以此类推，我们更愿意做到通过转换与所需细胞类型相近的一种正常细胞来产生所需的细胞类型，而不是将细胞先转变成全能性的状态再慢慢的从一个很大的范围通过缩小它们分化的道路。
如果仅是为了达到细胞替换治疗的目的，全能性或者生殖系传递能力都不是必需的标准或者目标。
如果仅从治疗的角度看，一个具有一定分化能力，但是这种分化能力并非无限制的状态可能更为安全和有用。
文献来源：
Science
图一：
核移植实验设计。
（A）移植到未受精的蛙或哺乳动物卵（二次减数分裂期）；
（B）移植到第一次减数分裂的蛙卵母细胞；
（C）细胞融合实验设计
图二：
核移植成功率随着分化程度的加深而下降。
图三：
核重编程中发生的核增大以及染色质的去浓缩化。
（A）鸡红血球细胞和人类HeLa细胞融合后一小时（左），两小时（右）。
虚线表示融合细胞的外轮廓。
较小的核是属于鸡红血球细胞的。
（B）小鼠胚胎干细胞核注射到一个两栖类卵母细胞囊中，左图示刚移植时的图像，右图为注射后2天。
这些细胞核在体积上增大了30倍。
图四：
当一个正常细胞（左）的细胞核移植到一个卵或卵母细胞（右），其染色体蛋白发生了交换。
黄色代表供体细胞的核蛋白，维持了其作为体细胞的基因表达，蓝色代表了卵的核蛋白，通过稀释后取代了体细胞核中的蛋白，并诱发了新的基因表达模式。
图五：
核重编程的四个实验方式。
蓝色物质代表从受精卵分化到成体组织细胞的正常途径。
红色箭头表示核重编程。
（A）核移植到卵细胞；
（B）诱导为多能干细胞；
（C）品系转换到分化上游并选择另外一个方向；
（D）直接转换为另一细胞类型。
图的下部表示通过重编程产生ES细胞，这些ES细胞可以形成拟胚体（EB），直接分化（Diff），或者移植到囊胚中，通过这三种方法可以产生不同类型的成体细胞。
二、iPS细胞增殖的原种和随机模型
iPS细胞为疾病研究，药物筛选，毒理学和再生医学提供了史无前例的前景。
然而，重编程的效率很低，并且许多细胞重编程不完全。
下文将对iPS细胞增殖瓶颈的原因提出一些假说，同时提出大多数或是所有细胞有潜能成为多能性细胞的模型。
从2000年开始，Yamanaka实验室开始尝试用维持胚胎干细胞多能性的因子来诱导体细胞成为多能干细胞。
基于这些因子在小鼠胚胎干细胞中的重要性和表达特异性，Yamanaka实验室选出24个因子作为最初的候选。
为了评定这些因子的作用，Yamanaka实验室用逆转录病毒将这些基因导入到小鼠胚胎成纤维细胞（mouseembryonicfibroblast,MEF）中。
这些细胞具有抗性基因，只有当Fbxo15（鼠胚胎干细胞中一种维持多能性的基因）表达时，抗性基因才会表达。
Yamanaka推测，当重组的24个基因表达，并诱导了细胞回到多能状态时，Fbxo15也将被开启1。
当这24个候选基因被逐一导入成纤维细胞时并用药物筛选，没有克隆能够出现。
而Yamanaka实验室用含有所有24个基因的逆转录病毒进行试验，便出现了若干克隆。
令Yamanaka实验室更加惊奇的是，这24个基因中只有4个是形成少量干细胞样克隆所必需的。
这4个基因都是转录因子，它们是：
Oct3/4（也称Pou5f1），Sox2，Klf4和c-Myc，Yamanaka实验室发现，他们可以重编程来自胚胎和成年老鼠的成纤维细胞2。
这些被Yamanaka实验室称为“诱导多能性干细胞（iPS）”的重编程细胞，在形态上和胚胎干细胞相似，它们可以表达重要的胚胎干细胞标志基因，并且将它们注入小鼠可以形成畸胎瘤（包含不同组织型的瘤）。
然而，最初的iPS细胞与胚胎干具有不同的全基因表达模式，而且当把它们注入早期小鼠胚胎中，它们并没有形成嵌合体的能力。
这些性质表明，这些iPS细胞没有完全的重编程。
后来，最终通过改进诱导方法，Yamanaka实验室团队获得了能够产生嵌合体并能进入生殖细胞传代的小鼠iPS细胞3-5。
在2007年，用重组了相同或是有稍微改变的基因的逆转录病毒或慢病毒，人的成纤维细胞也可以被重编程到多能性状态6-9。
虽然通过病毒转导这些确定的因子，可以重复形成iPS细胞，但是只有少部分的被转导细胞能够在最后具有多能性。
在最初报道的具有克隆形成能力的iPS细胞，效率只有大约0.05%——这就意味着，平均在2000个成纤维细胞中，只有一个可以形成多能细胞4。
而且有些小组报道，那些看起来像具有多能性的细胞，实际上只有部分的重编程，它们的自Yamanaka更新依赖转基因的外源因子持续表达2,10,11。
低效率和部分重编程，对人的iPS在基础研究，药物筛选，毒理学，及再生医学等方面的应用是个巨大障碍。
这里提出了2种模型——原种和随机模型，来解释iPS形成的低效率和部分性质（图1）。
原种模型假设：
直接重编程的只能在在一小部分被转导细胞中发生；
随机模型假设：
大多数或是全部的被转导细胞具有重编程的能力。
Yamanaka在这篇文章中的观点支持随机模型。
1原种模型
这个模型假设只有少数细胞有重编程的能力。
此模型可以被进一步分成两种：
“假定原种”和“诱导原种”模型（图1）。
1.1假定原种模型
在假定模型中，一小部分的细胞在未经过逆转录病毒转导四个因子之前，就已经具有了重编程能力。
组织干细胞和其它具有再生能力的组织中的未分化细胞，是“原种”的良好候选者，它们有能力可以进行重编程。
通过核转移（体细胞核转移，或SCNT）进行重编程，用分化较少的原始细胞的细胞核——如神经干细胞或是胚胎干细胞得到的重编程效率要比用来自末端分化细胞，如淋巴细胞高的多。
同样的，用确定的因子诱导多能性，越原始的干细胞越是优先被重编程。
多能干细胞也存在与如皮肤的成体器官和组织中。
在皮肤中，干细胞约占总体的0.067%13，这个数字与Yamanaka实验室最初报道的的iPS形成效率十分相似。
然而，有4点证据反对假定原种模型。
第一，目前iPS的诱导效率比最初的报道要高很多。
通过简单的延长使Nanog表达的药物选择时间，就可使效率提高10倍——0.5%的MEF可以变为iPS细胞14。
而且，在Yamanaka的实验室逆转录病毒感染MEF通常可以达到2%的重编程效率。
通过使用特殊的化学药物，这个效率可以被进一步提高。
据报道，使用丙戊酸这种小分子物质结合4个因子，可以使10%的MEF重编程5。
但在最初的成纤维细胞中，并不存在2-10%的组织干细胞或是未分化细胞。
虽然重编程因子或是化学处理可能优先提高组织干细胞或是原始细胞的的增殖，但似乎更多的体细胞也被重编程，形成iPS细胞。
另一个支持随机模型的独立的证据来自遗传谱系痕量分析。
除了成纤维细胞，iPS细胞已经从来自包括肝脏16和胰脏17的多种组织中形成。
利用Cre-loxP系统得到的iPS进行遗传谱系痕量分析表明：
大多数从肝组织中得来的iPS来源于表达白蛋白的细胞。
同样的，很多来自于胰脏的iPS来源于表达胰岛素的细胞。
这些数据并没有证明终末分化细胞可以形成iPS，因为白蛋白和胰岛素在原始细胞，成熟的肝细胞及胰脏β细胞中都有表达。
尽管如此，这些发现还是明确的证明了那四个因子可以重编程已经分化的，能表达白蛋白或是胰岛素的谱系定型细胞。
更加直接的证据是Hanna等人获得了来自B淋巴细胞的iPS细胞18。
他们通过展示球蛋白位点的遗传重组，证实了终末分化细胞的起始。
尽管需要骨髓转录因子（CCAAT/enhancerbindingproteinalpha，CEBPα）的异位表达，或者是B细胞转录因子Pax5的特异敲除，并且需要4个重组因子的诱导，他们的数据还是证明了种系定型的细胞还是可以通过确定的因子重编程。
这些证据说明，如果
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