降烟碱中国烟草标准化Word文件下载.docx
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2.2.3.1.2降烟碱储备液
准确称取约15.0mg降烟碱，置于25mL的棕色容量瓶中，用含0.01%三乙胺的三氯甲烷溶液稀释定容至刻度。
2.2.3.1.3麦斯明储备液
准确称取约10.0mg麦斯明，置于25mL的棕色容量瓶中，用含0.01%三乙胺的三氯甲烷溶液稀释定容至刻度。
2.2.3.1.4麦斯明、假木贼碱和新烟碱混标储备液
准确称取约15.0mg假木贼碱、10.0mg新烟碱置于25mL的棕色容量瓶中，加入约10mL萃取溶液完全溶解后，再准确加入1mL麦斯明储备液，用含0.01%三乙胺的三氯甲烷溶液稀释定容至刻度。
2.2.3.2生物碱标准溶液的配制
2.2.3.2.1烟碱工作标准溶液
分别移取20μL、50μL、100μL、250μL、500μL的烟碱储备液于不同的10mL棕色容量瓶中，再准确加入1mL内标储备液，用含0.01%三乙胺的三氯甲烷溶液稀释定容至刻度，得到五个不同浓度的烟碱系列标准溶液。
2.2.3.2.2降烟碱工作标准溶液
分别移取20μL、50μL、100μL、200μL、500μL、1mL的降烟碱储备液于不同的10mL棕色容量瓶中，再准确加入1mL内标储备液，用含0.01%三乙胺的三氯甲烷溶液稀释定容至刻度，得到六个不同浓度的降烟碱系列标准溶液。
2.2.3.2.3麦斯明、假木贼碱和新烟碱的混和标样工作标准溶液
分别移取20μL、50μL、100μL、200μL、500μL、1mL的麦斯明、假木贼碱和新烟碱混标储备液于不同的10mL棕色容量瓶中，再准确加入1mL内标储备液，用含0.01%三乙胺的三氯甲烷溶液稀释定容至刻度，得到六个不同浓度的麦斯明、假木贼碱和新烟碱的混和标样系列标准溶液。
2.3样品的前处理
称取0.3g烟草或烟草制品粉末于50mL三角锥形瓶内，精确至0.0001g加入2.0mL5%的氢氧化钠溶液于萃取瓶中，轻摇萃取瓶，湿润试样，静置不超过25min，然后加入20.0mL一级内标溶液，加盖密封后置于超声波清洗机内，超声提取15min。
静置过夜使试样和萃取剂分离，取2mL下层溶液经无水硫酸钠过滤后，转移到色谱分析瓶中待进样分析。
2.4气相色谱/质谱联用仪条件
载气：
氦气，载气流速：
1.0mL/min；
进样口温度：
250℃；
烟碱的检测：
进样量1µ
l，分流进样，分流比40:
1；
降烟碱、麦斯明、假木贼碱和新烟碱的检测：
进样量2µ
l，分流进样，分流比10:
1。
程序升温：
初温：
100℃保持3min，以8℃/min速率由100℃升至260℃，保持10min，总运行时间33min。
检测器：
质谱检测器；
溶剂延迟：
8min；
电离电压：
70ev；
离子源温度：
230℃；
传输线温度：
280℃；
扫描离子范围：
33～400amu；
质谱扫描方式：
SIM扫描。
表1质谱检测器检测生物碱的保留时间及定量离子
序号
化合物名称
保留时间（min）
定量离子（m/z）
定性离子（m/z）
1
2-甲基喹啉
10.48
143
128
2
烟碱
10.66
84
133
3
降烟碱
12.59
119
147
4
麦斯明
12.90
146
118
5
假木贼碱
13.48
105
6
新烟碱
14.32
160
54
7
2，4′-二联吡啶
14.90
156
129
2.5标准曲线的制作
分别测定系列工作标准溶液，建立不同生物碱的线性回归方程，R2应不小于0.99。
烟碱的定量采用2-甲基喹啉作为内标，其它生物碱的定量采用2，4′-二联吡啶作为内标。
3结果与讨论
3.1不同萃取溶剂的比较
选用二氯甲烷、三氯甲烷、甲基叔丁基醚、乙酸乙酯四种溶剂进行萃取效率的比较，结果如表2所示。
结果表明，二氯甲烷与三氯甲烷的萃取效率比较接近，甲基叔丁基醚、乙酸乙酯稍低，考虑到二氯甲烷的挥发性较强，而三氯甲烷对含量较少的次级生物碱提取略有优势，因此确定选择三氯甲烷作为萃取溶液。
表2不同萃取溶剂的比较（μg/g）
溶剂
二氯甲烷
19003.6
608.0
6.4
83.8
1357.2
三氯甲烷
18937.6
598.1
8.7
90.8
1430.8
甲基叔丁基醚
18472.7
537.7
8.0
87.1
1271.6
乙酸乙酯
18158.9
519.7
8.9
79.3
1203.9
3.2NaOH溶液的选择
3.2.1NaOH溶液浓度的选择
烟草中的生物碱需要加入一定量的碱性溶剂，将其中结合态的生物碱游离出来。
试验中分别加入2mL1%、2%、5%、10%4种浓度的NaOH溶液进行比较，结果如表3所示。
结果表明，1%和2%2种浓度的NaOH溶液不利于生物碱的游离，尤其是烟碱、降烟碱和麦斯明；
加入10%浓度的NaOH溶液后烟末发黑板结，再加入溶剂超声萃取，乳化较严重，也不利于对生物碱的提取。
选择5%碱浓度可以达到较好的提取效果，既避免了碱浓度过低影响生物碱游离，也杜绝了样品的严重乳化，故确定选用5%浓度的Na0H溶液。
表3加入不同浓度的NaOH溶液的测定结果（μg/g）
NaOH浓度
1%
19062.7
546.9
8.2
90.5
1471.5
2%
19249.5
548.4
92.5
1490.8
5%
19980.4
564.8
8.5
104.1
1511.8
10%
19963.8
544.5
101.9
1530.0
3.2.2加入Na0H溶液的体积选择
选用1mL、2mL以及3mL5%的Na0H溶液进行比较，结果如表4所示。
实验表明加入1mL的Na0H溶液对样品的浸润不完全，加入1mLNa0H溶液的分析结果略低于2mLNa0H溶液的结果；
加入2mL和3mL的Na0H溶液测定结果无明显差异，但加入3mL5%Na0H溶液，再加入萃取溶液超声后，样品乳化现象较严重。
因此，确定加入2mL5%的Na0H对烟草样品进行游离。
表4加入不同NaOH溶液量的测定结果（μg/g）
5%Na0H溶液
加入量
1mL
19352.3
552.8
8.6
100.1
1507.2
2mL
19814.0
103.9
1520.5
3mL
20066.7
584.3
1521.0
3.3加入NaOH溶液后放置时间的比较
选择加入2mL5%的NaOH溶液后，放置5min、10min、15min、20min、25min、30min进行比较，考察生物碱所需要的游离时间，结果如表5所示。
结果表明，除新烟碱外，这5个游离时间所测定的生物碱含量无明显差异，从放置5min到25min内，新烟碱含量无明显差异，但放置30min，新烟碱含量明显降低，因此确定加入碱液后的放置时间不超过25min。
表5加入NaOH溶液后不同放置时间的测定结果（μg/g）
放置时间（min）
19732.9
535.9
8.4
96.7
1441.6
10
20006.3
538.6
98.4
1512.7
15
19926.1
545.5
9.1
94.1
1487.6
20
19817.8
545.8
8.3
95.9
1479.9
25
19878.5
531.0
95.8
1478.8
30
19847.2
531.5
95.2
1357.9
3.4不同超声时间的比较
对超声10min、15min、20min、25min、30min进行比较，结果如表6所示。
表6的结果表明，不同超声时间对生物碱的提取测定结果无明显差异，但超声15min的提取效果相对较高，考虑到在试验中超声水浴温度随着超声时间延长而升高，这可能会导致溶剂以及生物碱挥发，因此最终决定选择超声15min。
表6不同超声时间的测定结果（μg/g）
超声时间（min）
20505.1
595.7
9.2
1504.9
20833.3
604.9
9.7
105.2
1542.0
20830.0
597.2
9.3
102.8
1517.9
20877.3
593.8
104.8
1519.7
20428.6
563.0
10.0
98.7
1447.9
3.5超声萃取后静置时间的比较
样品经超声萃取后，将样品从超声波清洗机取出，静置使试样和萃取剂分离。
由于样品经超声震荡后，会出现一定的乳化现象，故本实验采用将超声后的样品放置过夜，可分离成澄清的两层。
为比较乳化现象对样品目标化合物分析的影响，实验进行了样品超声后静置1小时和静置过夜的比较，结果见表7。
结果表明，样品静置过夜后的测定值比静置1小时的样品测定值要高。
故选择样品经超声萃取后需要将样品静置过夜才能进样分析。
表7超声萃取后静置时间的比较（μg/g）
超声后静置时间
1小时
20739.3
587.7
9.3
85.5
1399.4
静置过夜
21035.9
667.2
9.8
103.6
1533.8
3.6气相色谱分析方法研究
3.6.1不同色谱柱系统适应性研究
本实验对色谱柱规格均为30m×
0.25μm的DB-5MS、DB-17MS和DB-35MS这3种色谱柱在分离效果上进行了比较分析，图1-3。
结果表明：
采用DB-5MS色谱柱分离生物碱，不能较好地将降烟碱和麦斯明分开；
DB-35MS、DB-17MS色谱柱能将降烟碱和麦斯明明显分开，但是实验过程中发现采用DB-17MS色谱柱分离生物碱，柱效降低较快，其质谱图拖尾较严重，色谱柱使用寿命相对较短，而DB-35MS色谱柱分离生物碱，色谱峰形要好于DB-17MS色谱柱，色谱柱使用寿命长于DB-17MS色谱柱，最后确定选用DB－35MS色谱柱分析目标化合物。
1、降烟碱；
2、麦斯明；
3、假木贼碱；
4、新烟碱
图1DB-5MS色谱柱分离效果
图2DB-17MS色谱柱分离效果
3、假木贼碱；
4、新烟碱
图3DB-35MS色谱柱分离效果
3.6.2气相色谱－质谱分析条件
烟草中烟碱含量通常是几十毫克每克，而麦斯明却是几微克每克到几十微克每克，显然，烟碱与其它生物碱的含量差异较大。
在实验中发现进样量过小，对麦斯明的检测影响较大，进样量过大，烟碱的检测量又超过检测器的相应范围，通过对气相色谱－质谱分析条件进行了研究，最后确定将烟碱的检测与其它生物碱的检测分开进样。
采用的具体条件如下：
采用DB－35MS（30m×
0.25μm）毛细管色谱柱分离，见图4-5所示，载气：
SIM扫描，质谱检测器检测生物碱的保留时间及定量离子见表1。
图4典型烟草样品气相色谱-质谱联用图
1、2-甲基喹啉（IS）；
2、烟碱；
图5典型烟草样品气相色谱-质谱联用图
4、新烟碱；
5、2,4′-二联吡啶（IS）
3.7工作曲线与检测限
将6个不同浓度的混合标样分别进行GC-MS分析，并用各种目标化合物定量离子色谱峰的面积与内标化合物定量离子色谱峰的面积比值与化合物浓度与内标浓度比值进行回归分析，得回归方程及其相关参数。
将最低浓度的标准溶液平行测定5次，所得测定结果标准偏差的3倍即为测定方法的检测限（表8）。
结果表明，在烟草中主要生物碱的含量范围内，质谱检测器响应与5种化合物的浓度呈良好的线性关系。
表8分析方法的线性范围和检测限
化合物
浓度范围（μg/mL）
回归方程
R2
检测限（μg/g）
定量限（μg/g）
30.43-1521.60
y=0.5115x-0.0064
0.9996
14.1
46.8
1.16-58.40
y=0.488x-0.088
0.9992
2.3
7.6
0.028-1.392
y=0.2621x-0.0005
0.9990
0.2
0.5
1.28-64.00
y=0.3614x-0.0468
0.9991
1.5
5.1
0.8-40.00
y=0.1114x-0.0132
2.4
7.9
3.8重复性和回收率
对同一烟草样品进行5次日内和日间平行测定（表9-10），考察了方法的重复性，并在高、中、低三个含量水平上进行了回收率的测定（样品加标法，表11）。
结果表明5种挥发性有机化合物日内、日间测定结果的变异系数分别在1.1％-3.9％、1.7％-5.8％之间、，平均回收率的结果在91.1%～103.6%之间，因此该方法重复性较好，回收率较高。
表9方法的日内重复性测定结果（μg/g）
次数
22675.5
491.1
6.5
105.5
1542.7
22966.8
499.4
106.3
1476.6
22266.5
496.8
101.5
1581.3
22622.7
509.9
6.8
111.6
1587.6
22513.3
526.0
6.3
111.0
1591.6
平均值
22609.0
504.6
107.2
1555.9
RSD（%）
1.1
2.7
3.3
3.9
3.1
表10方法的日间重复性测定结果（μg/g）
天数
第1天
22598.9
509.4
111.5
1649.2
第2天
23159.6
493.1
第3天
22967.2
515.1
6.2
1577.6
第4天
22559.8
458.0
7.1
116.7
1633.4
第5天
23488.9
536.4
6.6
102.9
1517.8
22954.9
502.4
109.2
1593.9
1.7
5.8
5.5
5.3
3.2
表11方法的回收率（%）
生物碱
低浓度
中浓度
高浓度
平均回收率
106.1
104.3
100.6
103.6
90.2
93.9
101.6
88.8
96.5
99.5
94.9
91.8
97.1
101.8
96.9
87.2
91.0
91.1
3.9本方法与行标YC/T246-2008的比较
针对烟碱的测定，进行了本方法与现行行业标准YC/T246-2008《烟草及烟草制品烟碱的测定气相色谱法》方法的比对试验，试验数据如表12所示。
结果表明，两个方法的测定结果的相对标准偏差在4%以内，说明两个方法的测定结果具有良好的一致性，表明本方法具有可靠的准确性。
表12烟草样品烟碱测定值（mg/g）
烟草样品
YC/T246-2008方法
本方法
相对标准偏差（%）
烤烟
23.1
21.8
4.0
白肋烟
42.3
40.4
香料烟
9.5
卷烟烟丝
18.8
17.9
3.7
3.10样品测定结果
采用该方法对18个烟草和烟草制品进行了测定，其中烤烟样品4个，白肋烟样品4个，香料烟样品2个，烤烟型卷烟烟丝4个，混合型卷烟烟丝4个。
测定结果见表13。
表13样品测定结果（μg/g）
烤烟1#
24008.8
544.3
9.0
95.7
1924.6
烤烟2#
16386.9
507.4
9.4
80.2
1998.9
烤烟3#
20569.1
628.3
16.7
78.3
1431.8
烤烟4#
21063.8
898.7
13.6
150.6
2297.4
白肋烟1#
63567.5
9885.7
188.0
346.0
8510.4
白肋烟2#
53090.8
5905.2
162.5
286.8
5766.0
白肋烟3#
41634.4
6073.0
118.7
319.3
4095.3
白肋烟4#
42647.3
2588.3
72.9
185.8
3874.7
香料烟1#
5453.4
257.6
17.3
177.1
香料烟2#
16146.5
538.7
18.3
41.4
677.3
烤烟型卷烟烟丝1#
22794.1
745.8
11.8
133.0
2045.3
烤烟型卷烟烟丝2#
23108.7
706.3
8.8
127.9
2099.6
烤烟型卷烟烟丝3#
23636.2
639.0
121.7
1898.4
烤烟型卷烟
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