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结论：
本优化工艺制备HM-SLN包封率较高，稳定性好，方法可靠。
关键词：
去氢骆驼蓬碱；
固体脂质纳米粒；
正交试验；
两次高剪切-超声法
StudiesonthePreparationConditionsandPharmaceuticsCharacteristicsofHarminesolidlipidnanoparticles
Abstract:
Objective:
ToprepareHarminesolidlipidnanoparticles（HM-SLN）.Methods:
HM-SLNwaspreparedusingorthogonaldesignforoptimizationofformulationandtechnology,whichwasbasedontheencapsulateefficiency（EE%）,drugloading（DL%）andstability.ThequalityoftheobtainedHM-SLNwasevaluated.Results:
TheobtainedHM-SLNhadevenwithameandiameterof121nm,theencapsulateefficiencyratioof（88.11±
0.585）%,anddrugloadingof（2.03±
0.005）%.Conclusion:
TheentrapmentratioofHM-SLNishighandthestabilityisgoodforHM-SLNpreparedbytwicehighshearultrasoundmethod,andthemethodisreliablb.
Keywords:
Harmine；
Solidlipidnanoparticles；
Orthogonaldesign；
Twicehighshearultrasoundmethod
去氢骆驼蓬碱（Harmine,HM）系蒺黎科（Zygophyllaceae）植物骆驼蓬（PeganumharmalaL.）种子中的主要化学成分——β-咔波林类生物碱。
HM药理作用比较广泛，国外对它的研究主要集中在对中枢神经系统[1]和单胺氧化酶的抑制作用[2方面。
国内80年代在新疆首次将骆驼蓬总碱制剂用于治疗消化道肿瘤，随后国内对骆驼蓬总碱的抗肿瘤活性做了系统的研究，其体内体外研究结果表明骆驼蓬总碱对人肝癌、人胃癌、人鼻咽癌（CNE2）等均有显著抑制作用[1-4]。
固体脂质纳米粒作为一种新型胶粒给药体系，生物相容性好，具有被动靶向的特定，可以将药物载送到病变部位，从而提高HM的疗效，减少其不良反应。
本实验以硬脂酸作为载体材料，制备HM固体脂质纳米粒，以“归一值”为评价指标，正交设计对其制备工艺进行优化。
一、实验药品与仪器
1仪器：
UV-2201分光光度计（日本岛津）；
AE-200万分之一分析天平（上海梅特勒-托利多仪器有限公司）；
高剪切分散乳化机（上海Fluko流体机械制造有限公司）；
JY92-Ⅱ型超声波细胞粉碎机（宁波新芝科器研究所）；
电热恒温水浴锅（北京市光明医疗仪器厂）；
透析袋（进口分装，截留分子量8000-14000）、MicrotracS3500激光粒度分析仪（美国麦奇克）。
2药品：
去氢骆驼蓬碱对照品（HM,SigmaCo26C-0186）；
硬脂酸（天津市福晨化学试剂厂）；
poloxamer-188（F68，北京风礼精求商贸有限责任公司）；
注射用大豆卵磷脂（上海太伟药业股份有限公司，批号080320）；
无水乙醇（分析纯）。
二、方法与结果
1HM-SLN的制备：
称取处方量的HM，硬脂酸和大豆卵磷脂，在（80±
5℃）水浴下，溶于适量的无水乙醇中，挥尽溶剂。
取处方量的poloxamer188溶于同温的蒸馏水中，形成均匀的水相。
将有机相注入到水相中进行高剪切和超声，得初步混悬液，再将此混悬液进行第二次高剪切和第二次超声，然后冷却至室温既得HM-SLN水分散体。
2含量测定方法精密称取HM1.2mg溶于10mL无水乙醇中，做为储备液。
分别移取0.10、0.30、0.50、0.70、0.90mL储备液于10mL容量瓶中无水乙醇定容，用紫外分光光度计在300nm处分别测定其吸光度A，以吸光度对浓度绘制标准曲线，得标准曲线方程A=0.0919C+0.007（r=0.9995）。
表明在1.2～10.8µ
g·
mL-1范围内吸光度与浓度线性关系良好。
在此紫外条件下，低、中、高浓度（3.6、6.0和8.4μg／mL）样品的日内和日间RSD分别为0.67﹪、0.61﹪、0.66﹪和0.35﹪、0.71﹪、0.63﹪。
3包封率和载药量的测定：
取1mLHM-SLN水分散体于活化好的透析袋中，两端扎紧，放入15mL的水合介质中于恒温振荡仪中37±
0.5℃振摇6h，然后取适量透析介质0.45μm微孔滤膜过滤进行紫外测定游离药物量（Wf）。
取适量HM-SLN混悬液用无水乙醇消解，离心（10000r/min）10min，取上清液紫外测定得药物总量Wt。
另设制备时所取载体材料的总量为Ws，按下式计算包封率和载药量。
包封率%=（Wt-Wf）/Wt×
100%
载药量%=（Wt-Wf）/（Wt+Ws）×
3优化实验
3.1剪切速度及时间对粒径的影响
采用浊度法[5-7]，于550nm处测定透光率（T）作为粒径大小的判断依据，透光率越大粒径越小，反之粒径越大。
考察剪切速度及时间对纳米粒粒径的影响。
结果见图1和图2。
图1剪切速度对粒径的影响
由图一可知剪切速度为10000rpm和13000rpm所制得的纳米混悬液透光率基本相同，而剪切速度为16000rpm时透光率明显增加。
在相同的处方条件下，要使纳米粒均一分散在分散介质中就需要更多的能量输入，高速搅拌不能显著改变粒子大小，但能够改变多分散指数[8]。
因此，为了获得较窄的粒径分布，且由于剪切速度太高，在搅拌过程中会产生大量泡沫，不利于搅拌，故最终选定剪切速度为16000rpm。
图2剪切时间对粒径的影响
由图2可知随着剪切时间的延长，透光率却随着降低，而3min后透光率几乎不变。
这一现象的可能原因可能是随着剪切时间的延长，粒径随着变小，表面积不断增加，由△G=σ△A（△G-表面自由能的增加，σ-表面张力，△A-表面积的增加）可知表面积增加，可使表面自由能大大增加。
根据热力学第二定律的能量最小原理，为了降低表面积、降低表面自由能，微粒分散体系中的微粒具有强烈的聚结趋势，而且微粒越小，聚结趋势越大，结果就使粒径变大，透光率降低。
此外，一般地说，分子量越大，高分子稳定剂在微粒表面上形成的吸附层越厚，稳定效果越好。
吸附的高分子要能盖住微粒表面才能起到保护作用，即需要在微粒表面上形成一个包围层，再多的高分子并不能增加它的保护作用，但若高分子的浓度不够，微粒表面不能被完全覆盖，这使吸附在微粒表面上的高分子长链可能同时吸附在另一微粒表面上，通过被吸附的聚合物的袢上或尾端上的锚基于另一微粒的裸露部分相接触，并吸附在上面形成分子桥，从而促使微粒聚集下沉。
同时根据DLVO理论，一般认为胶体系统纳米粒的稳定性是由于其表面包裹表面活性剂后，形成质点间排斥势能增加，相应提高了体系的稳定性，而裸露的微粒表面，在分子间范德华引力作用下，相互间易发生絮凝[9]。
因此，在乳化剂的量一定时，随着剪切时间的延长，粒径随着变小，表面积不断增加，使得新生成的表面，不能即时覆盖裸露的新生成表面，致使微粒聚集，粒径变大，透光率降低。
所以，本实验最终确定剪切时间为1分钟。
3.2投料比对包封率的影响
在制备HM-SLN时，HM与脂质的比例对纳米粒的包封率具有重要影响，二者配比时与药物性质和药物与脂质之间的相互作用有关。
因此以包封率为指标，考察投料比对包封率的影响，结果见表一。
表一投料比对包封率的影响
投药量（mg）
2.8
8.4
14
EE%
79.5
82.04
76.56
由表一可知，随着投料比的增加，包封率是下降的，以此可知，过高的投药量并不能获得更高的包封率，只是增加了体系中游离药物量，可能是由于一定质量的载体材料，在其乳化时生成的缺陷结构是有限的，因此只能够容纳一定的外来药物分子，即载药量一定，所以投药量过多的部分将不能被包载在纳米载体中。
当投药量增加到一定时，可以获得最大包封率，对于本系统就是去请骆驼蓬碱的量为8.4mg时，最高包封率可达到82.04%。
据报道[7]，随着投药量的增加，体系的平均粒径和Zeta电位呈增大的趋势。
在处方中乳化剂的量一定的情况下，体系中游离药物越多，消耗的乳化剂的量也越多，这使乳化载体的乳化剂量就少，从而影响了乳化效果，使得平均粒径增加。
3.3正交试验[6,7,9-14]
在预实验和参考文献的基础上，采用L9（34）正交设计表进行正交试验，实验固定投药量为8.4mg，水相的量为10mL，考察影响HM-SLN性质的四个因素：
硬脂酸浓度（A）、大豆磷脂浓度（B）、泊洛沙姆浓度（C）与超声功率（D）对包封率、载药量以及纳米粒在一定时间内的变化量Ke的影响来评价各个处方。
测定波长550nm，测定时间t=72h，用公式“Ke=100-（T0-Tt）／T0×
100”所计算的值代表纳米分散液的稳定性[15]。
由于在本实验中优化的指标较多，根据每个指标优选的条件可能会相互矛盾，对某一指标的有利条件可能对其他指标不利，因此，本实验用综合指标（OD），来综合考察指标的综合效果。
各指标“归一值”求算几何平均数，得总评“归一值”[16]。
公式如下：
OD=（d1d2…dk）1/kk为指标数
对于取值越大越好的指标和取值越小越好的指标采用Hassan方法分别进行数学转换求“归一值”dmax和dmin，公式如下：
dimax=（Yi-Ymin）/（Ymax-Ymin）
dimin=（Ymax-Yi）/（Ymax-Ymin）
其中Yi为实测值，Ymax和Ymin分别为各指标可以接受的最大值和最小值。
对于dimax，当Yi超过或等于Ymax时，将di设为1，反之，Yi低于Ymin时，将di设为0；
而对于dimin而言，当Yi超过或等于Ymax时，将di设为0，反之，Yi小于或等于Ymin时，将di设为1。
因素水平见表二，设定可接受的指标最大值和最小值见表三，正交试验结果表见表四。
表二因素水平表
水平
因素
1
2
3
A（g/mL）
0.2%
0.6%
1%
B（g/mL）
1.0%
2.0%
3.0%
C（g/mL）
D（w）
200
400
600
表三设定指标的最大值和最小值
指标
Ymax
Ymin
100
80
DL%
5
0.5
Ke
60
表四正交设计及结果
所在列
4
因素
A
B
C
D
OD
实验1
80.39
4.51
81.56
0.212
实验2
80.42
2.75
90.63
0.200
实验3
81.02
2.11
89.56
0.238
实验4
88.61
4.43
75.68
0.528
实验5
87.25
2.72
76.00
0.415
实验6
91.46
2.15
77.26
0.449
实验7
85.60
3.42
62.17
0.214
实验8
93.68
2.95
62.75
0.295
实验9
89.69
1.75
78.70
0.397
OD1
0.217
0.318
0.319
0.341
OD2
0.464
0.303
0.375
0.288
OD3
0.302
0.361
0.289
0.354
极差
0.247
0.121
0.086
0.066
表五方差分析结果
EE
DL
df
F
P
77.439
<
0.05
2.204
>
33.232
5.774
45.65
6.266
11.487
2.083
6.383
3.878
1.527
0.589
极差反应各因素对OD值影响的程度，极差越大，影响程度越大，由表四可知，本实验四个因素极差值排列为A>
B>
C>
D，各因素水平分析结果为：
A因素：
2>
3>
1；
B因素：
1>
2；
C因素：
3；
D因素：
2，所以最佳处方与工艺组成为A2B3C2D3。
由表五可知硬脂酸、卵磷脂、Poloxamer的用量对包封率和Ke均有显著性差异，且卵磷脂的用量对载药量亦有显著性差异，而超声功率对评价指标均无显著性差异。
4正交设计基础上进一步优化
采用正交试验优化的最佳处方，考察超声的时间对粒径的影响。
结果见图3。
图3超声时间对粒径的影响
由图3可知，随着超声时间的增加，透光率并不是随着其增加，而是到了4min后透光率基本不变，即超声4min后并不能明显改变粒子的大小，为了提高制备效率，本实验确定超声时间为4min。
按照最佳处方及工艺，制备去氢骆驼蓬碱固体脂质纳米粒，包封率为（88.11±
5HM-SLN平均粒径及粒度分布测定
采用优化工艺制备固体脂质纳米粒混悬液，稀释到适当浓度，用激光粒度分析仪分别测定新鲜制备的HM-SLN和冷藏30天后HM-SLN的平均粒径及其分布。
图四新鲜制备的HM-SLN粒径分布
图五30天后HM-SLN粒径分布
由图4可知此方法制备的HM-SLN平均粒径为121nm、粒径分布窄且呈单模分布。
由图五可知HM-SLN水分散体在4℃冷藏30天后平均粒径为144nm，与新鲜制备的HM-SLN相比，平均粒径只有轻微增加，且在储藏期间无明显的粒子聚集现象，由此表明HM-SLN水分散体具有长期稳定性。
6讨论
在本实验研究中，用这种方法将去氢骆驼蓬碱制成固体脂质纳米，证明此种方法是一种简单、易行、有效的制备较小粒径、高包封率以及稳定的固体脂质纳米粒的方法。
然而，用此种方法制备固体脂质纳米粒，在超声的过程中易带来金属污染，但用微孔滤膜过滤可以有效的解决探头超声带来的金属污染问题[20]。
正交试验设计由于试验次数少，数据处理和操作方便，因此，国内研究者多用此方法进行制备工艺的优化。
然而正交试验存在无法精确找到最佳点，且模型预测性不高，不能精确考察各因素间的交互作用的不足。
因此，在本实验优化的基础之上进一步优化，有望提高HM-SLN的包封率和载药量。
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