细胞培养常见问题分析Word文件下载.docx

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不能。

每一细胞株均有其特定使用且已适应之细胞培养基，若骤然使用和原先提供之培养条件不同之培养基，细胞大都无法立即适应，造成细胞无法存活。

4、可否使用与原先培养条件不同之血清种类？

血清是细胞培养上一个极为重要的营养来源，所以血清的种类和品质对于细胞的生长会产生极大的影响。

来自不同物种的血清，在一些物质或分子的量或内容物上都有所不同，血清使用错误常会造成细胞无法存活。

5、何谓FBS,FCS,CS,HS?

FBS（fetalbovineserum）和FCS（fetalcalfserum）是相同的意思，两者都是指胎牛血清，FCS乃错误的使用字眼，请不要再使用。

CS（calfserum）则是指小牛血清。

HS（horseserum）则是指马血清。

6、培养细胞时应使用5%或10%CO2？

或根本没有影响？

一般培养基中大都使用HCO3-/CO32-/H+作为pH的缓冲系统，而培养基中NaHCO3的含量将决定细胞培养时应使用的CO2浓度。

当培养基中NaHCO3含量为每公升3.7g时，细胞培养时应使用10%CO2；

当培养基中NaHCO3为每公升1.5g时，则应使用5%CO2培养细胞。

7、何时须更换培养基？

视细胞生长密度而定，或遵照细胞株基本数据上之更换时间，按时更换培养基即可。

8、培养基中是否须添加抗生素？

除于特殊筛选系统中外，一般正常培养状态下，培养基中不应添加任何抗生素。

9、附着性细胞继代时所使用之trypsin-EDTA浓度？

应如何处理？

一般使用之trypsin-EDTA浓度为0.05%trypsin-0.53mMEDTA.4Na。

第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中，保存于–20℃，避免反复冷冻解冻造成trypsin之活性降低，并可减少污染之机会。

10、悬浮性细胞应如何继代处理？

一般仅需持续加入新鲜培养基于原培养角瓶中，稀释细胞浓度即可，若培养液太多时，可将培养角瓶口端稍微抬高，直到无法容纳为止。

分瓶时取出一部份含细胞之培养液至另一新的培养角瓶，加入新鲜培养基稀释至适当浓度，重复前述步骤即可。

11、欲将一般动物细胞离心下来，其离心速率应为多少转速？

欲回收动物细胞，其离心速率一般为300xg（约1,000rpm），5-10分钟，过高之转速，将造成细胞死亡。

12、细胞之接种密度为何？

依照细胞株基本数据上之接种密度或稀释分盘之比例接种即可。

细胞数太少或稀释的太多亦是造成细胞无法生长之一重要原因。

13、细胞冷冻培养基之成份为何？

动物细胞冷冻保存时最常使用的冷冻培养基是含5-10%DMSO（dimethylsulfoxide）和90-95%原来细胞生长用之新鲜培养基均匀混合之。

注意：

由于DMSO稀释时会放出大量热能，故不可将DMSO直接加入细胞液中，必须使用前先行配制完成。

14、DMSO之等级和无菌过滤之方式为何？

冷冻保存使用之DMSO等级，必须为Tissueculturegrade之DMSO（如SigmaD2650），其本身即为无菌状况，第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中，保存于4°

C，避免反复冷冻解冻造成DMSO之裂解而释出有害物质，并可减少污染之机会。

若要过滤DMSO，则须使用耐DMSO之Nylon材质滤膜。

15、冷冻保存细胞之方法？

冷冻保存方法一:

冷冻管置于4℃30~60分钟→（-20℃30分钟*）→-80℃16~18小时（或隔夜）→液氮槽vaporphase长期储存。

冷冻保存方法二:

冷冻管置于已设定程序之可程序降温机中每分钟降1-3℃至–80℃以下，再放入液氮槽vaporphase长期储存。

*-20℃不可超过1小时，以防止冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。

15、细胞欲冷冻保存时，细胞冷冻管内应有多少细胞浓度？

冷冻管内细胞数目一般为1x106cells/mlvial，融合瘤细胞则以5x106cells/mlvial为宜。

16、应如何避免细胞污染？

细胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉浆菌。

主要的污染原因为无菌操作技术不当、操作室环境不佳、污染之血清和污染之细胞等。

严格之无菌操作技术、清洁的环境、与品质良好之细胞来源和培养基配制是减低污染之最好方法。

17、如果细胞发生微生物污染时，应如何处理？

加入相应抗生素。

直接灭菌后丢弃之。

18、支原体（mycoplasma）污染的细胞，是否能以肉眼观察出异状？

除极有经验之专家外，大多数遭受支原体污染的细胞株，无法以其外观分辨之。

19、支原体污染会对细胞培养有何影响？

支原体污染几乎可影响所有细胞之生长参数，代谢及研究之任一数据。

故进行实验前，必须确认细胞为mycoplasma-free，实验结果之数据方有意义。

20、CO2培养箱之水盘如何保持清洁？

定期（至少每两周一次）以无菌蒸馏水或无菌去离子水更换之。

21、为何培养基保存于4℃冰箱中，颜色会偏暗红色，且pH值会越来越偏碱性？

培养基保存于4℃冰箱中，培养基内之CO2会逐渐溢出，造成培养基越来越偏碱性。

而培养基中之酸碱指示剂（通常为phenolred）的颜色也会随碱性增加而更偏暗红。

培养基偏碱之结果，将造成细胞生长停滞或死亡。

若培养基偏碱时，可以通入无菌过滤之CO2，以调整pH值。

22、各种细胞培养用的dish，flask是否均相同？

不同厂牌的dish或flask，其所coating的polymer不同，制造程序亦不同，虽对大部分细胞没有太大之影响，惟少数细胞则可能因使用厂牌不同之dish或flask而有显著之生长差异。

23、购买之细胞冷冻管经解冻后，为何会发生细胞数目太少之情形？

购买之细胞死亡或细胞存活率不佳可能原因？

研究人员在细胞培养时出现存活率不佳，常见原因可归纳为：

培养基使用错误或培养基品质不佳。

血清使用错误或血清的品质不佳。

解冻过程错误。

冷冻细胞解冻后，加以洗涤细胞和离心。

悬浮细胞误认为死细胞。

培养温度使用错误。

细胞置于–80℃太久。

24、收到之冷冻管瓶身破裂，瓶盖有裂纹，或瓶盖脱落之原因？

冷冻管瓶盖裂纹，或瓶身破裂，可能是因为操作者夹取冷冻管时用力不当，造成冷冻管裂损，建议使用止血钳小心夹取。

另冷冻管瓶盖松动或松脱，乃因热胀冷缩之物理现象，冷冻管有可能因此而造成细胞污染，故冷冻管于放入和取出液氮桶时，均应立刻将冷冻管再一次扭紧。

25、如何选用特殊细胞系培养基？

培养某一类型细胞没有固定的培养条件。

在MEM中培养的细胞，很可能在DMEM或M199中同样很容易生长。

总之，首选MEM做粘附细胞培养、RPMI-1640做悬浮细胞培养是一个好的开始，各种目的无血清培养最好首选AIMV（12005）培养基（SFM）。

26、L-谷氨酰胺在细胞培养中重要吗？

它在溶液中不稳定吗？

L-谷氨酰胺在细胞培养时是重要的。

脱掉氨基后，L-谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢。

L-谷氨酰胺在溶液中经过一段时间后会降解，但是确切的降解率一直没有最终定论。

L-谷氨酰胺的降解导致氨的形成，而氨对于一些细胞具有毒性。

27、GlutaMAX-I是什么？

培养细胞如何利用GlutaMAX-I？

这个二肽有多稳定？

GlutaMAX-I二肽是一个L-谷氨酰胺的衍生物，其不稳定的alpha-氨基用L-丙氨酸来保护。

一种肽酶逐渐裂解二肽，释放L-谷氨酰胺供利用。

GlutaMAX-I二肽非常稳定，即使在121磅灭菌20分钟，GlutaMAX-I二肽溶液有最小的降解，如果在相同条件下，L-谷氨酰胺几乎完全降解。

28、什么培养基中可以省去加酚红？

酚红在培养基中被用来作为PH值的指示剂：

中性时为红色，酸性时为黄色，碱性时为紫色。

研究表明，酚红可以模拟固醇类激素的作用，（特别是雌激素）。

为避免固醇类反应，培养细胞，尤其是哺乳类细胞时，用不加酚红的培养基。

由于酚红干扰检测，一些研究人员在做流式细胞检测时，不使用加有酚红的培养基。

29、培养基中丙酮酸钠的作用是什么？

丙酮酸钠可以作为细胞培养中的替代碳源，尽管细胞更倾向于以葡萄糖作为碳源，但是，如果没有葡萄糖的话，细胞也可以代谢丙酮酸钠。

30、二价离子抑制胰蛋白酶活性吗？

使用胰蛋白酶时加入EDTA的目的是什么？

二价离子的确抑制胰蛋白酶活性。

EDTA用来螯合游离的镁离子和钙离子，以便保持抑制胰蛋白酶的活性。

建议胰蛋白酶处理细胞前，用EDTA清洗细胞，以消除来自培养基中所有的二价离子。

31、书上说，Hank‘s平衡盐溶液（HBS）要在空气中使用，不需要CO2培养箱。

原因是什么？

Hank’s平衡盐溶液（HBS）和Earle‘s平衡盐溶液（EBS）有什么本质的功能差别？

HBS和EBS的主要差别在于碳酸氢钠的水平,在Eagles（2.2g/L）中比在Hanks（0.35g/L）中高。

碳酸氢钠需用高水平的CO2平衡，以维持溶液的PH值。

Eagles液在空气水平的CO2中，溶液会变碱，Hanks液在CO2培养箱中会变酸。

如果希望在CO2培养箱中保存组织，需要用Eagles液，。

如果仅仅是清洗将要在细胞培养基中储存的组织，用Hanks液就可以了。

血清

1、保存血清最好的方法?

建议血清应保存在-5℃至-2O℃。

然而，若存放于4℃时，请勿超过一个月。

若您一次无法用完一瓶，建议您无菌分装血清至恰当的灭菌容器内，再放回冷冻。

2、如何解冻血清才不会使产品质量受损?

建议您将血清从冷冻箱取出后，先置于2～8℃冰箱使之融解，然后在室温下使之全融。

但必须注意的是，融解过程中必须规则地摇晃均匀。

3、血清解冻后发现有絮状沉淀物出现，该如何处理?

血清中沉淀物的出现有许多种原因，但最普遍的原因是由于血清中脂蛋白的变性所造成，而血纤维蛋白（形成凝血的蛋白之一）在血清解冻后，也会存在于血清中，亦是造成沉淀物的主要原因之一。

但这些絮状沉淀物，并不影响血清本身的质量。

若欲去除这些絮状沉淀物，可以将血清分装至无菌离心管内，以400g稍微离心,上清液即可接着加入培养基内一起过滤。

我们不建议您以过滤的方法去除这些絮状沉淀物，因为它可能会阻塞您的过滤膜。

4、为什么要热灭活血清?

加热可以灭活补体系统。

激活的补体参与溶解细胞事件，刺激平滑肌收缩，细胞和血小板释放组胺，激活淋巴细胞和巨噬细胞。

在免疫学研究，培养ES细胞，昆虫细胞和平滑肌细胞时，推荐使用热灭活血清。

5、有必要做热灭活吗?

实验显示，经过正确处理的热灭活血清，对大多数的细胞而言是不需要的。

经此处理过的血清对细胞的生长只有微小的促进，或完全没有任何作用，甚至通常因为高温处理影响了血清的质量，而造成细胞生长速率的降低。

而经过热处理的血清，沉淀物的形成会显著的增多，这些沉淀物在倒置显微镜下观察，像是“小黑点”，常常会让研究者误以为是血清遭受污染，而把血清放在37℃环境中，又会使此沉淀物更增多，使研究者误认为是微生物的分裂扩增。

6、为什么储存在冰箱中的胎牛血清会出现沉淀?

GIBICO的胎牛血清没有预老化，储存在2－8℃时，血清中的各种蛋白和脂蛋白（如冷凝集素、纤维蛋白原、玻粘连蛋白等）可能聚集而形成沉淀或可见的混浊。

这应该不会影响血清的质量。

推荐在－20℃储存胎牛血清，避免反复冻融。

7、如何避免血清里沉淀物的产生?

解冻血清时，请按照所建议的逐步解冻法（-20℃至4℃至室温），若血清解冻时改变的温度太大（如-20℃至37℃），实验显示非常容易产生沉淀物。

解冻血清时，请随时将之摇晃均匀，使温度及成分均一，减少沉淀的发生。

请勿将血清置于37℃太久。

若在37℃放置太久，血清会变得混浊，同时血清中许多较不稳定的成分也会因此受到损害，而影响血清的质量。

血清的热灭活非常容易造成沉淀物的增多，若非必要，可以无须做此步骤。

若必须做血清的热灭活，请遵守56℃，30分钟的原则，并且随时摇晃均匀。

温度过高，时间过久或摇晃不均匀，都会造成沉淀物的增多。