细胞培养常见问题分析Word文件下载.docx

1、不能。每一细胞株均有其特定使用且已适应之细胞培养基， 若骤然使用和原先提供之培养条件不同之培养基， 细胞大都无法立即适应， 造成细胞无法存活。4、可否使用与原先培养条件不同之血清种类？血清是细胞培养上一个极为重要的营养来源， 所以血清的种类和品质对于细胞的生长会产生极大的影响。来自不同物种的血清， 在一些物质或分子的量或内容物上都有所不同，血清使用错误常会造成细胞无法存活。5、何谓FBS, FCS, CS, HS ?FBS （fetal bovine serum） 和FCS （fetal calf serum） 是相同的意思， 两者都是指胎牛血清， FCS 乃错误的使用字眼， 请不要再使用。C

2、S （calf serum） 则是指小牛血清。HS （horseserum） 则是指马血清。6、培养细胞时应使用5 % 或10% CO2？或根本没有影响？一般培养基中大都使用HCO3-/CO32-/H+ 作为pH 的缓冲系统， 而培养基中NaHCO3 的含量将决定细胞培养时应使用的CO2 浓度。当培养基中NaHCO3 含量为每公升3.7 g 时，细胞培养时应使用10 % CO2；当培养基中NaHCO3 为每公升1.5 g 时， 则应使用5 % CO2 培养细胞。7、何时须更换培养基？视细胞生长密度而定， 或遵照细胞株基本数据上之更换时间，按时更换培养基即可。8、培养基中是否须添加抗生素？除于特

3、殊筛选系统中外， 一般正常培养状态下， 培养基中不应添加任何抗生素。9、附着性细胞继代时所使用之trypsin-EDTA 浓度？应如何处理？一般使用之trypsin-EDTA 浓度为0.05% trypsin-0.53mMEDTA.4 Na。第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中， 保存于20 ，避免反复冷冻解冻造成trypsin 之活性降低， 并可减少污染之机会。10、悬浮性细胞应如何继代处理？一般仅需持续加入新鲜培养基于原培养角瓶中， 稀释细胞浓度即可， 若培养液太多时， 可将培养角瓶口端稍微抬高， 直到无法容纳为止。分瓶时取出一部份含细胞之培养液至另一新的培养角瓶， 加入新鲜培养基稀释至

4、适当浓度， 重复前述步骤即可。11、欲将一般动物细胞离心下来，其离心速率应为多少转速？欲回收动物细胞， 其离心速率一般为300xg （约1,000rpm），5 - 10 分钟， 过高之转速， 将造成细胞死亡。12、细胞之接种密度为何？依照细胞株基本数据上之接种密度或稀释分盘之比例接种即可。细胞数太少或稀释的太多亦是造成细胞无法生长之一重要原因。13、细胞冷冻培养基之成份为何？动物细胞冷冻保存时最常使用的冷冻培养基是含5 - 10 %DMSO （dimethyl sulfoxide） 和90 - 95 % 原来细胞生长用之新鲜培养基均匀混合之。注意：由于DMSO 稀释时会放出大量热能， 故不可将

5、DMSO 直接加入细胞液中， 必须使用前先行配制完成。14、DMSO 之等级和无菌过滤之方式为何？冷冻保存使用之DMSO 等级， 必须为Tissue culture grade之DMSO （如Sigma D2650）， 其本身即为无菌状况， 第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中， 保存于4C， 避免反复冷冻解冻造成DMSO 之裂解而释出有害物质， 并可减少污染之机会。若要过滤DMSO， 则须使用耐DMSO 之Nylon 材质滤膜。15、冷冻保存细胞之方法？冷冻保存方法一: 冷冻管置于4 3060 分钟 （-20 30 分钟*） -80 1618 小时（或隔夜） 液氮槽vaporphase 长

6、期储存。冷冻保存方法二: 冷冻管置于已设定程序之可程序降温机中每分钟降1-3 至80 以下， 再放入液氮槽vapor phase长期储存。*-20 不可超过1 小时， 以防止冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80 冰箱中，惟存活率稍微降低一些。15、细胞欲冷冻保存时， 细胞冷冻管内应有多少细胞浓度？冷冻管内细胞数目一般为1x106 cells/ml vial， 融合瘤细胞则以5x106 cells/ml vial 为宜。16、应如何避免细胞污染？细胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉浆菌。主要的污染原因为无菌操作技术不当、操作室环境不佳、污染之血清和污染之细胞等。严

7、格之无菌操作技术、清洁的环境、与品质良好之细胞来源和培养基配制是减低污染之最好方法。17、如果细胞发生微生物污染时，应如何处理？加入相应抗生素。直接灭菌后丢弃之。18、支原体（mycoplasma） 污染的细胞， 是否能以肉眼观察出异状？除极有经验之专家外，大多数遭受支原体污染的细胞株，无法以其外观分辨之。19、支原体污染会对细胞培养有何影响？支原体污染几乎可影响所有细胞之生长参数， 代谢及研究之任一数据。故进行实验前，必须确认细胞为mycoplasma-free，实验结果之数据方有意义。20、CO2 培养箱之水盘如何保持清洁？定期（至少每两周一次） 以无菌蒸馏水或无菌去离子水更换之。21、为

8、何培养基保存于4 冰箱中， 颜色会偏暗红色， 且pH值会越来越偏碱性？培养基保存于4 冰箱中， 培养基内之CO2 会逐渐溢出，造成培养基越来越偏碱性。而培养基中之酸碱指示剂（通常为phenol red） 的颜色也会随碱性增加而更偏暗红。培养基偏碱之结果， 将造成细胞生长停滞或死亡。若培养基偏碱时， 可以通入无菌过滤之CO2， 以调整pH 值。22、各种细胞培养用的dish，flask是否均相同？不同厂牌的dish 或flask， 其所coating 的polymer 不同， 制造程序亦不同， 虽对大部分细胞没有太大之影响， 惟少数细胞则可能因使用厂牌不同之dish 或flask 而有显著之生长

9、差异。23、购买之细胞冷冻管经解冻后，为何会发生细胞数目太少之情形？ 购买之细胞死亡或细胞存活率不佳可能原因？研究人员在细胞培养时出现存活率不佳， 常见原因可归纳为：培养基使用错误或培养基品质不佳。血清使用错误或血清的品质不佳。解冻过程错误。冷冻细胞解冻后， 加以洗涤细胞和离心。悬浮细胞误认为死细胞。培养温度使用错误。细胞置于80太久。24、收到之冷冻管瓶身破裂，瓶盖有裂纹，或瓶盖脱落之原因？冷冻管瓶盖裂纹，或瓶身破裂，可能是因为操作者夹取冷冻管时用力不当，造成冷冻管裂损，建议使用止血钳小心夹取。另冷冻管瓶盖松动或松脱，乃因热胀冷缩之物理现象，冷冻管有可能因此而造成细胞污染，故冷冻管于放入和取

10、出液氮桶时，均应立刻将冷冻管再一次扭紧 。25、如何选用特殊细胞系培养基？培养某一类型细胞没有固定的培养条件。在MEM中培养的细胞，很可能在DMEM或M199中同样很容易生长。总之，首选MEM做粘附细胞培养、RPMI-1640做悬浮细胞培养是一个好的开始，各种目的无血清培养最好首选AIM V（12005）培养基（SFM）。26、L-谷氨酰胺在细胞培养中重要吗？它在溶液中不稳定吗？L-谷氨酰胺在细胞培养时是重要的。脱掉氨基后，L-谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢。L-谷氨酰胺在溶液中经过一段时间后会降解，但是确切的降解率一直没有最终定论。L-谷氨酰胺的降解导致氨的形成

11、，而氨对于一些细胞具有毒性。27、GlutaMAX-I是什么？培养细胞如何利用GlutaMAX-I？这个二肽有多稳定？GlutaMAX-I 二肽是一个L-谷氨酰胺的衍生物，其不稳定的alpha-氨基用L-丙氨酸来保护。一种肽酶逐渐裂解二肽，释放L-谷氨酰胺供利用。 GlutaMAX-I二肽非常稳定，即使在121磅灭菌20分钟，GlutaMAX-I 二肽溶液有最小的降解，如果在相同条件下，L-谷氨酰胺几乎完全降解。28、什么培养基中可以省去加酚红？酚红在培养基中被用来作为PH值的指示剂：中性时为红色，酸性时为黄色，碱性时为紫色。研究表明，酚红可以模拟固醇类激素的作用，（特别是雌激素）。为避免固醇

12、类反应，培养细胞，尤其是哺乳类细胞时，用不加酚红的培养基。由于酚红干扰检测，一些研究人员在做流式细胞检测时，不使用加有酚红的培养基。29、培养基中丙酮酸钠的作用是什么？丙酮酸钠可以作为细胞培养中的替代碳源，尽管细胞更倾向于以葡萄糖作为碳源，但是，如果没有葡萄糖的话，细胞也可以代谢丙酮酸钠。30、二价离子抑制胰蛋白酶活性吗？使用胰蛋白酶时加入EDTA的目的是什么？二价离子的确抑制胰蛋白酶活性。EDTA用来螯合游离的镁离子和钙离子，以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建议胰蛋白酶处理细胞前，用EDTA清洗细胞，以消除来自培养基中所有的二价离子。31、书上说，Hanks 平衡盐溶液（HBS）要在空气中使用，

13、不需要CO2培养箱。原因是什么？Hanks 平衡盐溶液（HBS）和Earles平衡盐溶液（EBS）有什么本质的功能差别？HBS和 EBS 的主要差别在于碳酸氢钠的水平,在Eagles （2.2g/L）中比在Hanks （0.35g/L） 中高。碳酸氢钠需用高水平的CO2平衡，以维持溶液的PH值。Eagles液在空气水平的CO2 中，溶液会变碱，Hanks液在CO2培养箱中会变酸。如果希望在CO2培养箱中保存组织，需要用Eagles液，。如果仅仅是清洗将要在细胞培养基中储存的组织，用Hanks液就可以了。血清1、保存血清最好的方法?建议血清应保存在-5至-2O。然而，若存放于4时，请勿超过一个月

14、。若您一次无法用完一瓶，建议您无菌分装血清至恰当的灭菌容器内，再放回冷冻。2、如何解冻血清才不会使产品质量受损?建议您将血清从冷冻箱取出后，先置于28冰箱使之融解，然后在室温下使之全融。但必须注意的是，融解过程中必须规则地摇晃均匀。3、血清解冻后发现有絮状沉淀物出现，该如何处理?血清中沉淀物的出现有许多种原因，但最普遍的原因是由于血清中脂蛋白的变性所造成，而血纤维蛋白（形成凝血的蛋白之一）在血清解冻后，也会存在于血清中，亦是造成沉淀物的主要原因之一。但这些絮状沉淀物，并不影响血清本身的质量。若欲去除这些絮状沉淀物，可以将血清分装至无菌离心管内，以400g稍微离心,上清液即可接着加入培养基内一起

15、过滤。我们不建议您以过滤的方法去除这些絮状沉淀物，因为它可能会阻塞您的过滤膜。4、为什么要热灭活血清?加热可以灭活补体系统。激活的补体参与溶解细胞事件，刺激平滑肌收缩，细胞和血小板释放组胺，激活淋巴细胞和巨噬细胞。在免疫学研究，培养ES细胞，昆虫细胞和平滑肌细胞时，推荐使用热灭活血清。5、有必要做热灭活吗?实验显示，经过正确处理的热灭活血清，对大多数的细胞而言是不需要的。经此处理过的血清对细胞的生长只有微小的促进，或完全没有任何作用，甚至通常因为高温处理影响了血清的质量，而造成细胞生长速率的降低。而经过热处理的血清，沉淀物的形成会显著的增多，这些沉淀物在倒置显微镜下观察，像是“小黑点”，常常会

16、让研究者误以为是血清遭受污染，而把血清放在37环境中，又会使此沉淀物更增多，使研究者误认为是微生物的分裂扩增。6、为什么储存在冰箱中的胎牛血清会出现沉淀?GIBICO的胎牛血清 没有预老化，储存在28时，血清中的各种蛋白和脂蛋白（如冷凝集素、纤维蛋白原、玻粘连蛋白等）可能聚集而形成沉淀或可见的混浊。这应该不会影响血清的质量。推荐在20储存胎牛血清，避免反复冻融。7、如何避免血清里沉淀物的产生?解冻血清时，请按照所建议的逐步解冻法（-20至4至室温），若血清解冻时改变的温度太大（如-20至37），实验显示非常容易产生沉淀物。解冻血清时，请随时将之摇晃均匀，使温度及成分均一，减少沉淀的发生。请勿将血清置于37太久。若在37放置太久，血清会变得混浊，同时血清中许多较不稳定的成分也会因此受到损害，而影响血清的质量。血清的热灭活非常容易造成沉淀物的增多，若非必要，可以无须做此步骤。若必须做血清的热灭活，请遵守56，30分钟的原则，并且随时摇晃均匀。温度过高，时间过久或摇晃不均匀，都会造成沉淀物的增多。