生物工程导论复习资料Word格式.docx

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有很高的效率和专一性,酶催化反应的专一性包括底物专一性,基团专一性及立体专一性等.

6.生物工程的服务领域:

人类健康,农业,资源和能源,环境保护.

7.基因工程的诞生和发现:

基因工程诞生于1973年.

三大发现:

①20世纪40年代发现了生物的遗传物质是DNA②20世纪50年代提出了DNA是双螺结构③20世纪60年代确定了遗传信息的传递方式.

8.基因工程技术上的三大发明:

①工具酶；

②载体；

③逆转录酶

9.基因工程:

也称基因克隆或DNA分子克隆.指将外源基因通过体外重组后导入受体内,使这个基因能在受体细胞内自制,转录,翻译表达的操作过程.

10.基因工程的实施至少要四个条件:

①工具酶；

②基因；

③载体；

④受体细胞。

11.基因工程区别于其他遗传育种方法的显著特点：

①跨越天然物种屏障的能力；

②克服了固有的生物种间的限制；

③引入了定向创造新物种的可能性。

11.遗传工程,基因工程,DNA重组之间的差别:

①遗传工程是发生在遗传过程中的自然界原本存在的导致变异的一种现象,即自然出现的不同DNA链断裂并连接成新的DNA分子,新的DNA分子含有不同于亲体的DNA片段；

②DNA重组是人们根据遗传工程原理利用限制性内切酶在体外对DNA进行的人工操作（即采用酶法）；

③基因工程是遗传重组和DNA重组的目的和结果,无论是利用自然的（遗传重组）还是人工的（DNA重组）方法,最终目的都是要实现基因重组.

12.克隆:

（名词）指从同一个祖先通过无性繁殖方式产生的后代,或具有相同遗传性状的DNA分子,细胞或个体所组成的特殊的生命群体.（动词）指从同一祖先生产这类同一的DNA分子群或细胞过程.

13.基因工程的主要内容:

①带有目的基因的DNA片段的分离或人工合成；

②在体外,将带有目的基因的DNA片段连接到载体上,形成重组DNA分子；

③重组DNA分子导入受体细胞（也称宿主细胞或寄主细胞）；

④带有重组DNA分子的细胞培养,获得大量的细胞繁殖群体；

⑤重组体的筛选；

⑥重组体中目的基因的功能表达。

14.基因工程工程的理论基础:

是分子生物学.一方面,分子生物学的快速发展促成了基因工程的建立和发展完善；

另一方面,基因工程的诞生和发展不仅带动了现代生物技术产业化,而且也使整个生命科学的研究产生了革命性的变化,使得生命科学成为当今发展最快的学科之一.

15.DNA的组成:

DNA是由大量的脱氧核糖核苷酸组成的极长的线状或环状大分子.DNA分子的基本单位是脱氧核糖核苷酸,它由碱基,脱氧核糖和磷酸基三部分组成.在核苷酸分子中有4种不同的碱基,即腺嘌噙（A）,鸟嘌呤（G）,胸腺嘧啶（T）,胞嘧啶（C）.※DNA中的嘌呤核和嘧啶碱基携带遗传信息，其中的糖和磷酸基则起了结构作用。

16.1953年Watson和Crick提出了DNA的双螺旋结构模型→阐明了DNA分子的二级结构.这一理论的核心是:

碱基配对互补.碱基配对是DNA分子结构的主要特性.

17.决定DNA双螺旋结构的因素有:

①氢键的形成；

②碱基的堆积力；

③磷酸基之间的静电斥力；

④碱基分子内能的作用等.

18.DNA的复制:

一个DNA分子可以通过半保留复制机制精确地复制成两个完全相同的DNA分子,并分配到两个子细胞中,从而将亲代细胞所含的遗传信息原原本本地传到子代细胞.

19.DNA复制的特点:

①DNA的复制从特定的位点开始,这个特定的位点称为复制起始点,有复制起始点双链DNA解旋,形成复制叉；

②半保留复制；

③DNA复制具有高度的忠实性,其复制的忠实性同DNA聚合酶所具有的自我校正功能密不可分.④虽然DNA聚合酶是是DNA复制的主酶,然而DNA复制是多种酶和蛋白因子协同有序工作的结果.

20.DNA作为遗传物质的优点:

①信息量大,可以微缩.②表面互补,电荷互补,双螺旋结构保证了精确复制的机制.③核糖的2′位脱氧,在水溶液中稳定性好.④可以突变,以求进化.⑤有T无U,基因组得以增大.

21.DNA的变性:

在加热或某些试剂的作用下,DNA配对碱基之间的氢键结构受到破坏,双链DNA的多核苷酸链能完全分离的过程,也称熔解.（双链→单链（变性））

22.复性的过程:

当两条链互相碰撞,一条链的某个区域遇到了互补的另一条链的配对时,便在这个区段形成双链核心,然后从核心向两侧对应互补链扩大互补配对,最后完成复性过程.

（复性:

变形后的DNA在一定条件下能够复性，由单链形成双链。

）

23.发生复性必须满足的两个条件:

①盐浓度必须高到足以消除两条链中的磷酸基团的静电斥力；

通常用0.15～0.5mol/LNaCl；

②温度必须升高到足以破坏其随机形成的链内氢键,但温度又不能太高,否则不能形成和维持稳定的链间碱基配对。

24.杂交:

当复性的DNA分子由不同的两条单链分子形成时,称为杂交.

25.遗传信息的传递方向-中心法则:

1958年,Crick提出.DNA通过以自身为模板进行复制而使遗传信息代代相传,并通过RNA最终将遗传信息传递给蛋白质分子,最后蛋白质分子表现出各种性状,即DNA（基因）→RNA→蛋白质（性状）.

26.转录:

利用DNA为模板合成RNA的过程.转录是基因表达的关键一步.

翻译:

以RNA为模板合成蛋白质的过程.就是将以核苷酸形式编码在mRNA中的信息转变成多肽链中特定的氨基酸顺序.

27.mRNA的合成过程:

RNA合成以四种核糖核苷三磷酸为底物,即ATP,GTP,CTP,UTP.①RNA聚合酶结合于DNA分子上的特定位置；

②使DNA双链解旋,起始RNA合成；

③RNA链的延伸；

④RNA合成的终止和释放.

28.基因的表达:

DNA分子把它所承载的遗传信息转变为特定氨基酸顺序构成的多肽或蛋白质分子的过程.

29.基因的分类:

基因根据功能的不同可分为:

结构基因,调节基因和操纵基因.作为一个能转录和翻译的基因必须包括转录启动子,基因编码区和转录终止子.

30.原核生物中基因转录有两种情况:

一种是组成型的,另一种是基因的转录是受到调控的.原核生物中最早开始研究的基因调控体系是大肠杆菌乳糖操纵子.

31.真核生物翻译后修饰主要体现在:

①形成正确的二硫键；

②切割前体；

③蛋白质糖基化；

④对氨基酸的修饰。

32.工具酶:

一般把切割DNA分子,进行DNA片段修饰和DNA片段连接等所需的酶称为工具酶.（名词解释）

33.工具酶按用途分类:

①限制性内切酶：

指识别和切割双链DNA分子内特殊核苷酸顺序的酶的统称.②连接酶,指将两段乃至数段DNA片段拼接起来的酶.

※最常用的连接酶是T4DNA连接酶。

③修饰酶.其它基因工程的工具酶:

DNA聚合酶,逆转录酶,T4多核苷酸酶和碱性磷酸酶等.逆转录酶：

是从mRNA逆转录形成互补DNA（cDNA）的酶，亦称为依赖于RNA的DNA聚合酶。

34.基因工程载体:

外源基因必须先同某种传递者结合后才能进入细菌和动植物受体细胞,这种能承载外源DNA片段并带入受体细胞的传递者称为基因工程载体.目前已构建应用的基因工程载体有:

质粒载体,噬菌体载体,病毒载体以及由它们互相组合或与其他基因级DNA组合成的载体.这些载体可分为克隆载体和表达载体.

35.用于原核生物宿主的载体:

①质粒载体：

质粒→是能自主复制的双链闭合环状DNA分子,它们在细菌中以独立于染色体外的方式存在.质粒广泛存在于细菌中，某些蓝藻、绿藻和真菌细胞中也存在质粒→选择。

两种常用的质粒载体：

A质粒载体pBR322（原核质粒常见）B.pUC19（实验较常用）.

√常用的细菌质粒有F因子、R因子、大肠杆菌素因子等。

（填空）

②噬菌体载体③柯斯质粒→用于真核生物宿主的人工载体大多具有大肠杆菌质粒的耐药性或噬菌体的强感染力，同时还应满足携带真核生物目的基因大片段DNA的要求。

36.用于真核生物宿主的载体:

（真核载体大多是所谓的穿梭载体--填空）

①YIP载体；

②YRP载体；

③YAC载体是酵母人工染色体的缩写④其他载体.BAC是以细菌F因子为基础组建的细菌克隆体系。

①②都是由大肠杆菌质粒和酵母的DNA片段组成.

37.用于植物宿主的载体:

①Ti质粒.（最常用）--Ti质粒是诱发植物肿瘤的质粒。

A.整合型法B.双载体系统法。

②植物DNA病毒和植物转座子.

38.用于动物宿主的载体:

①用于昆虫细胞的载体②用于哺乳动物细胞的载体.

39.基因工程载体的必备条件和简单分类:

条件:

①能够进入宿主细胞；

②载体可以在宿主细胞中独立复制；

③要有筛选标记；

④对多种限制酶有单一的切点,一定是单一切点.

分类:

①克隆载体.是以繁殖DNA片段为目的的载体。

②穿梭载体.用于真核生物DNA片段在原核生物中增殖，然后再转入真核

细胞宿主表达。

③表达载体.用于目的基因的表达。

40.基因：

是具有遗传功能的DNA分子上的片段。

41、基因库：

也叫基因组文库，是指用克隆的方法将一种生物的全部基因组长期以重组体方式保持在适当的宿主中。

42、基因文库：

也叫cDNA文库。

首先获得mRNA，反转录得cDNA，经克隆后形成文库。

cDNA文库和基因库的不同之处在于，cDNA文库在mRNA拼接过程中已经除去了内含子等成分，便于DNA重组时直接使用。

43、基因组文库的筛选：

⑴DNA杂交法。

双链DNA分子可以通过热处理或碱变性的方法变性成单链DNA分子。

加热后缓慢冷却的过程称为退火。

退火后有的DNA分子的两条链分别来自于不同的DNA分子，即形成了杂合DNA分子。

⑵免疫反应法：

若一个目的基因DNA序列可以转录和翻译成蛋白质、那么只要出现这种蛋白质，甚至只需要该蛋白质的一部分，就可以用免疫的方法检测。

⑶酶活性法：

如果目的基因编码一种酶，而这种酶又是宿主细胞所不能编码的，那么就可以通过检查酶活性来筛选目的基因的重组子。

44.基因工程中一般都使用松弛型质粒载体。

两种常用的质粒载体为pBR322和pUC19.在基因组工程研究中，采用的载体是人工染色体。

45.1982年，第一基因工程药物人胰岛素就在美国的Eli-Lilly公司研究成功并投放市场。

第一类基因工程药物主要针对因缺乏天然内源性蛋白所引起的疾病。

第二类基因生物工程药物属于酶类。

第三类基因工程药物属于疫苗。

第四类产物单克隆抗体既能用于疾病诊断，又能用于治疗。

46、1989年我国第一个基因工程药物干扰素-alb上市，标志着我国基因工程制药实现了零的突破。

47、1970年Baltimore等人和Temin等人同时在各自的实验室发现了逆转录酶，打破了中心法则，使真核基因的制备成为可能。

48、1953年Watson和Crick提出了DNA的双螺旋结构模型，阐明了DNA分子的二级结构。

49、决定DNA双螺旋结构因素有：

氢键的形成、碱基的堆积力、磷酸基之间的静电斥力，碱基分子内能的作用力。

50.真核生物目的基因的获得：

①cDNA方法。

②DNA的化学合成法。

③PCR法。

1983年美国Cetus公司的Mullis等人建立起了一套大量快速地扩增特异DNA片段的系统，即聚合酶反应系统。

PCR法要求反应体系具有以下条件:

①要有与被分离的目的基因两条链各一端序列互补DNA引物。

②具有热稳定性的酶，如TaqDNA聚合酶。

③dNTP。

④作为模板的目的DNA序列。

PCR反应过程包括以下三个方面：

①变性，将模板DNA置于95℃的高温下，使双链DNA的双链解开变成单链DNA。

②退火，将反应体系的温度降低到55℃左右，使得一对引物能分别与变性后的两条模板链相配对。

③延伸，将反应体系温度调整到TaqDNA聚合酶作用的最适温度72℃，以目的基因为模板，合成新的DNA链。

51.（名）DNA重排的基本原理：

是首先将同源基因（单一基因或基因家族）切成随机DNA片段，然后进行PCR重聚。

那些带有同源性但核苷酸序列有差异的随机DNA片段，在每一轮PCR循环中互为引物和模板，经多次PCR循环后能迅速产生大量的重组DNA，创造出新基因。

基因组重排技术可以用来改造细菌的基因组，实现表型的改良。

经典杂交育种在每一代只有两个亲本进行重组，而重排技术则具有多亲本杂交的优势。

对细菌群体进行重复的基因组重排可以有效构建新菌株的组合文库。

52.基因组文库筛选的鉴定方法:

一是标记的DNA探针进行DNA杂交,二是用抗体对蛋白质进行免疫杂交.三是对蛋白质的活性进行鉴定.

53.PCR技术具有的特点:

①能够指导DNA序列的合成,因为新合成的DNA链的起点,是由加入在反应混合物中一对寡核苷酸引物,在模板DNA链两端的退火位点决定.②能够使特定的DNA区段得到迅速大量的扩增.

54.目的基因与载体DNA的连接分类:

按是否形成黏性末端可分为:

①黏性末端DNA片段的连接.方法:

插入法（单酶切）和取代式（双酶切）②非互补黏性末端或平端DNA片段的连接（方法:

同聚物加尾法,衔接物连接法及接头连接法）.

55.提高连接反应的效率的方法:

①采用碱性磷酸酶处理,同聚物加尾连接技术或采用柯斯质粒等手段防止未重组载体的再环化减少非重组体克隆的出现②合理正确地配比DNA的总浓度以及载体DNA和外源DNA之间的比例③根据不同的反应类型控制合理的反应温度和时间.可以大幅度提高转化子数量.

56.受体细胞,DNA重组使用的受体细胞,也称宿主细胞或基因表达系统.受体细胞为基因的复制,转录,翻译,后加工及分泌等提供了条件,以便实现目的基因的表达.目前用做基因克隆受体的原核生物主要是大肠杆菌和枯草杆菌.酵母和霉菌等也已经广泛用做基因工程的宿主细胞.

57.受体细胞选择的一般原则:

根据所用的载体体系及各种受体细胞的基因型进行选择,使重组体的转化或转染效率高,能稳定传代,受体细胞基因型与载体所含的选择标记匹配,易于筛选重组体及外源基因可以高效表达和稳定积累等.

58.重组DNA分子导入受体细胞的方法:

①转化,就是一个携带基因的外源DNA分子通过与膜结合进入受体细胞,并在胞内复制和表达的过程.√转化过程包括制备感受态细胞和转化过程。

（填空题）

大肠杆菌是用得最广泛的基因克隆受体。

②转导,指通过噬菌体（病毒）颗粒感染宿主细胞的途径将外源DNA分子转移到受体细胞内的过程.

③显微注射；

④高压电穿孔法；

⑤多聚物介导法；

⑥磷酸钙或DEAE-葡聚糖介导的转染法；

⑦脂质体介导法；

⑧粒子轰击法.

59.重组体的筛选的方法:

重组体筛选的方法很多，在核酸水平或蛋白质水平上筛选。

从核酸水平筛选克隆子可以通过核酸交杂的方法。

这类方法根据DNA-DNA、DNA-RNA碱基配对的原理，以使用基因探针技术为核心，发展了原位交杂、Southern交杂、Northern交杂等方法。

从蛋白质水平上筛选克隆子的方法主要有：

检测抗生素抗性及营养缺陷型、观测噬菌斑的形成、检测目标酶的活性、目标蛋白的免疫特性和生物活性等。

①利用抗生素抗性基因②营养缺陷互补法③核酸杂交法④通过免疫反应筛选⑤通过酶活性筛选.

60.目的基因的高效表达：

⑴影响目的基因表达的基本基因：

从基因表达系统构建和目的基因表达过程这两个方面分析，目的基因的表达效率不仅取决于宿主菌体特性和表达载体的构建，而且还取决于重组菌的培养工程。

从表达系统来看，主要表现在转录和翻译两个水平上。

⑵目的基因的不溶性高效表达。

对于不需要翻译后修饰的蛋白质产物，利用生长速度快、培养基简单的大肠杆菌为宿主细胞，采用不溶性融合蛋白表达策略仍是一种提高目的基因表达效率的很好选择。

（通过采用目的蛋白与带纯化标签的细菌蛋白融合的新策略，所得到的融合蛋白不仅能够抵抗蛋白酶的进攻，而且可以利用带纯化标签的蛋白与相应的抗体之间的亲和反应，实现目的蛋白的高效亲和分离。

⑶目的基因的高效可溶性表达。

对于不少目的蛋白，可通过降低启动子强度和减少培养温度的手段成功的实现高水平的可溶性表达。

⑷目的基因的高效分泌型表达。

当采用大肠杆菌作为表达系统时，如果在质粒设计时就加上一段信号肽基因，就有可能实现目的蛋白质的分泌型表达。

构建分泌型、特别是胞外分泌型的表达载体是实现目的基因高效表达的重要发展方向之一。

61.如何减少乙酸等抑制性副产物的形成:

①降低比生长速率②降低培养温度③限制性流加葡萄糖④基因工程菌培养和乙酸分离耦合过程.

62.基因工程制药的基本内容:

第一类基因工程药物主要针对因缺乏天然内源性蛋白所引起的疾病.这类蛋白主要以激素类为代表.第二类基因工程药物属于酶类,第三类基因工程药物属于疫苗,用于防治病毒引起的人或动物的传染性疾病.第四类产物单克隆抗体既能用于疾病诊断,又能用于治疗,单克隆抗体已成为研究和开发的新热点.

63.基因工程与基因组工程的对比:

①操作的基因和载体.两者都是对基因进行工程性的遗传操作.但基因工程常用的载体是质粒和病毒载体,克隆基因的容量有限.面基因组工程研究中,采用的载体是人工染色体,容纳的基因属于基因因群体的表达,

②克隆和扩增的宿主.用于基因工程的研究的克隆和扩增的宿主有细菌,真菌,动植物细胞,但大多是以大肠杆菌为主.用于基因组工程研究的克隆和扩增的宿主也可以是细菌,真菌,动植物细胞,但主要以酵母和哺乳动物细胞为主.

③工程操作手段.重组DNA技术是基因工程研究的基础,它依赖于质粒或病毒载体,限制性内切酶,DNA连接酶和大肠杆菌宿主等,基因导入宿主的手段通常有转化,转导,转染和显微注射等,基因组工程在重组DNA技术应用上,发展人工染色体作为载体,建立遗传同源重组技术作为Mb级的DNA大片段切割和整合的基础,需要完善酵母和培养细胞的转化和融合技术,开拓干细胞和体细胞克隆个体的方法.

④产物检测.在基因工程研究中,利用限制性内切酶图谱,Southern印迹,Northern印迹,PCR,序列分析等手段分析基因表达,对表达产物可以用蛋白质分析,酶学分析,抗体或底物结合等手段来研究.在基因组工程研究中,操作的基因数量大,产物非常复杂,除了用深远手段检测基因表达之外,还需用高通量的研究手段来检测基因群体,表达图谱及产物群.

64.基因组工程学的研究展望:

①遗传语文—遗传,发育,分化的操作指令和程序②细胞生命活动的网络（整合生物学）③人类社会21世纪主导产业的希望之星—基因组工程产业.

65.提高工程菌的质粒稳定性:

要从质粒构建和培养方法改进两条途径进行研究.①在质粒构建时,一般都插入了抗生素抗性基因,可以抑制不含质粒细胞的生长,另外加入称为par和cer的位点,能从源头上提高质粒稳定性.②在工程菌的培养过程中,适当降低菌体的生长速率,采用细胞生长期和诱导表达时期分开的分段培养策略,也有人提出采用培养条件循环控制策略,还可以受用固定化细胞培养也有利于提高质粒的稳定性.

66.重组菌的高密度培养:

不仅取决于上游重组系统的构建,而且还取决于重组菌的培养工程策略.①宿主菌和培养菌.②流加发酵实现高密度重组菌培养.

67.目的蛋白表达的质量:

在重组细胞的产物表达后,目的蛋白常常会受到各种修饰,而且经过修饰的蛋白质与目的蛋白质的性质十分接近,所以宿主细胞选择是一个很重要的因素.在培养方法上,通过将菌体生长与蛋白表达时期分开,可以降低目的蛋白的暴露时间,从而减少目的蛋白被修饰的机会.另外,降低培养温度可以降低修饰酶活性,也有利于提高目的蛋白的质量.

68、干细胞及其特点：

干细胞：

即未分化的细胞，是一类具有自我更新和分化发育潜能的原始细胞。

机体的各种细胞、组织和器官、甚至完整的生物都是通过干细胞分化发育而成的。

干细胞分胚胎干细胞和组织干细胞两类。

特点:

是一类极特殊的来自胚胎或成体的未分化细胞，同时具有不断增长繁殖的功能以及向多种功能细胞分化的潜能。

（脱分化增殖和定向分化）

69、原代细胞：

是直接从组织器官中分离得到的，原代细胞培养一般由组织器官解剖分离、解聚和离体细胞培养三个步骤组成。

70、细胞系：

一旦原代细胞进行了传代培养（亦称转种），便被称为细胞系。

71、细胞株：

细胞系中往往存在若干表型相似或相异的细胞世系，若其中一世系，经过选殖克隆、物理性细胞分离，或其他选择技术，而培养的细胞群体中辨识出其特殊表型性质，该细胞系便称为细胞株。

72、植物细胞具有“全能性”，即单一的离体细胞在一定环境下能分化成不同的细胞组织乃至整个植株。

73.植物细胞培养的细胞生理特性：

①植物细胞尺寸较大。

②植物细胞对剪切力非常敏感。

③易沉降。

④植物细胞生长缓慢。

⑤植物细胞生长与次级代谢产物的合成无显著关联。

⑥易染菌。

74.干细胞的研究进展：

①胚胎干细胞②造血干细胞。

造血干细胞分布于骨髓、外周血和脐血中。

尤其脐血中含有丰富的造血干细胞。

造血干细胞是造血细胞的“种子”，体内所有血细胞，包括红细胞、白细胞、血小板等，都由它分化发育而来，也是人们认识最早的干细胞之一。

③间充质干细胞。

间充质干细胞是分化发展成为骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、成肌肉细胞和骨髓基质细胞的干细胞，在成年后主要存在于骨髓下和骨髓腔中，也分布于肌肉、胸腺和皮肤中。

④神经及其他干细胞。

神经干细胞存在于成体神经组织中，具有再生神经元、星形胶质细胞和少突状细胞的潜在能力。

75、胚胎干细胞：

具有形成所有组织和器官的能力，具有“全能性”。

胚胎干细胞逐渐定向分化，朝着特定的组织器官发展，失去全能性而变得比较专一，它们只能发育