前列腺酸性磷酸酶在非前列腺腺癌中的表达Word格式文档下载.docx

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【关键词】酸性磷酸酶；

前列腺；

腺癌

　　【Abstract】AIM:

Tostudytheexpressionofprostaticacidphosphatase（PAP）,aprostaterelatedantigen,innonprostatecancercellsortissues.METHODS:

AvarietyofadenocarcinomacelllineswereexaminedfortheirPAPexpressionatthemRNAandproteinlevelsbyRTPCRandWesternBlotanalysis,respectively.ThePAPexpressionincancertissueswasalsoexaminedbyimmunohistochemicalstaining.RESULTS:

Threekindsofcoloncancercells（colo201,colo205andcolo320）,3kindsofgastriccancercells（MKN7,MKN28andMKN45）,and7kindsofbreastcancercelllines（OCUBF,OCUBM,R27,MCF7,CRL1500,YMB1EandMDAMB231）aswellascancertissueswerefoundtobepositiveforPAPatboththemRNAandproteinlevels.Butiswasnotfoundin5kindsofkidneycancercellsortissues.CONCLUSION:

PAPisanewtargetofnonprostateadenocarcinomas,includingcolon,breastandgastriccancers.

　　【Keywords】acidphosphatase;

prostate;

adenocarcinoma

　　引言

　　前列腺酸性磷酸酶（prostaticacidphosphatase,PAP）最先发觉于1938年［1］，以后它便作为前列腺癌肿瘤标志物.与Gleasonscore和前列腺特异性抗原（PSA）相较，PAP能够更精准指示肿瘤的微转移［2］.另外，PAP仍是转移性非雄性激素依托性前列腺癌特异性免疫医治的靶点［3］.一直以来，PAP的组织散布被以为局限于前列腺和前列腺肿瘤［4-5］.但是，有报导指出PAP也表达于非前列腺组织中［6-7］，如小肠癌［8］，胰腺内分泌瘤［8］，膀胱腺癌［9］等.最近，PAP被以为是血管内大B细胞淋巴瘤（intravascularlargeBcelllymphoma）的肿瘤标志物［10］.Inoue等［11］也曾报导了PAP在食道癌和肺鳞片细胞癌细胞中的表达.本研究拟在此基础上，进一步探讨PAP在其他腺癌中的表达水平，为非前列腺癌的特异性免疫医治提供新的靶点.

　　1材料和方式

　　材料

　　结肠癌细胞系（colo201,colo205,colo320,SW480和SW620），胃癌细胞系（MKN7,MKN28,MKN45和KATOIII）,乳腺癌细胞系（OCUBF,OCUBM,R27,MCF7,CRL1500,YMB1E和MDAMB231），肾细胞癌细胞系（RC3014,Caki1,VMRCRCW,MAMIYA和KUR11），前列腺癌细胞系LNCaP.RNABee试剂（TELTEST），RTPCR试剂盒（Takara），TaqDNA聚合酶（PromegaCorp），胰蛋白酶抑制剂，苯甲磺酰氟（Sigma），PAP抗体（ScyTekLaboratories.），WesternLightningChemiluminescenceReagent（PerkinElmerLifeSciences），羊抗人PAP抗体，CSASYSTEMKIT试剂盒（DAKO）.

　　方式

　　RNA提取及RTPCR依照RNABee说明书提取处于对数生长期细胞的总RNA，其中5μg总RNA用于cDNA的合成.用于PAP表达检测的PAP特异性引物为:

上游引物:

5′CTCCTCAACATGAGAGCTGC3′,下游引物：

5′TATATACTCTCCAAGTTCATA3′.利用TaqDNA聚合酶进行PCR反映，共30个循环（95℃1min,60℃1min,72℃1min）.PCR产物在20g/L琼脂糖凝胶上进行检测.

　　WesternBlot各肿瘤细胞系中PAP蛋白的表达用WesternBlot检测.搜集处于对数生长期的细胞，经PBS清洗弃去培育液后，置于缓冲液中进行裂解.缓冲液成份：

10mmol/LTrisHCl（pH，150mmol/LNaCl，5mL/LTritonX100，mmol/L苯甲磺酰氟，30U/L胰蛋白酶抑制剂.置于冰上30min.然后在4℃，25000g条件下离心20min，搜集上清液于-80℃保留.利用SDSPAGE电泳对上清液进行分离，凝胶中的蛋白质转移到PVDF膜上.在室温用30g/L牛血清白蛋白（BSA）封锁PVDF膜1h后，前后与鼠抗人PAP抗体、辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗鼠抗体孵育，最后用WesternLightningChemiluminescence试剂进行显色.前列腺癌细胞LNCaP和健康人外周血单核细胞（PBMCs）别离作为阳性和阴性对照.

　　免疫组化甲醛固定、石腊包埋的病理切片经脱石腊后，置于含30mL/LH2O2的甲醇溶液中来封锁内源性过氧化物酶活性，然后在加入第一抗体之前，用血清进行孵育以减少非特性染色.依照说明书，利用CSASYSTEMKIT试剂盒和羊抗人PAP抗体进行免疫组织化学检测.

　　2结果

　　PAPmRNA在非前列腺腺癌细胞中的表达在所检测的5种结肠癌、4种胃癌、7种乳腺癌和5种肾癌细胞中，3种结肠癌细胞（colo201,colo205和colo320）、3种胃癌细胞（MKN7,MKN28和MKN45）和所有的7种乳腺癌细胞中（OCUBF,OCUBM,R27,MCF7,CRL1500,YMB1E和MDAMB231）检测到PAPmRNA的表达；

而在5种肾癌细胞中均未检测到PAPmRNA的表达（图1）.

　　PAP蛋白在非前列腺癌细胞中的表达在3种结肠癌细胞（colo201,colo205和colo320）、2种胃癌细胞（MKN28和MKN45）和4种乳腺癌细胞（OCUBF,OCUBM,CRL1500和MDAMB231）中检测到PAP蛋白的表达.尽管在PCR结果中检测到MKN7,R27,MCF7和YMB1E细胞中有PAPmRNA的表达，可是在WesternBlot结果中没有发觉有PAP蛋白质的表达.在5种肾癌细胞中均未检测到PAP蛋白质的表达（图2）.

　　PAP在非前列腺肿瘤组织中的表达结果显示，PAP在所检测的5个结肠癌病理切片中均为阳性表达，7个胃癌病理切片中有5例为PAP阳性，5个乳腺癌病理切片中有2例为PAP阳性.代表性结果见图3.PAP蛋白质表达于腺癌细胞的细胞质中.

　　3讨论

最近的研究揭露一些没有突变的自身抗原，包括：

黑色素细胞分化抗原（melanocytedifferentiationantigens）能够作为肿瘤患者特异性免疫医治的超级有希望的靶点［12］.其他的一些自身抗原，如HER/2neu和p53也都被用做抗肿瘤免疫医治的靶分子［13］.和这些靶分子相较，由于前列腺相关抗原的表达一样被以为局限于前列腺和前列腺癌，因此前列腺相关抗原显得更具潜力.PAP是一种前列腺相关抗原，有报导提示PAP是一种高效的抗肿瘤疫苗［14］.

　　Small等［15］利用负载有PAP和GMCSF重组融合蛋白的自体树状细胞对非荷尔蒙依托性前列腺癌患者进行了一期临床实验，结果说明这种以PAP为靶点的特异性免疫医治是平安的，疾病进展所需的时刻与抗PAP免疫应答的产生紧密相关.其他研究报导利用具有HLAA2结合位点的PAP多肽对男性健康人的PBMCs进行体外刺激，能够诱导出PAP多肽特异性CTLs，这些PAP多肽特异性CTLs对前列腺肿瘤细胞具有细胞毒性［16］.咱们也曾经报导过PAP213221多肽关于HLAA24+前列腺癌患者具有免疫原性，并能够从他们的PMBCs中诱导出杀伤前列腺肿瘤细胞的CTLs［11］.这些证听说明，尽管PAP是一个无突变的自身抗原，可是PAP能够被宿主的免疫系统所识别，因此能够作为特异性免疫医治的靶分子.　　咱们曾经发此刻食道癌和肺鳞状细胞癌的肿瘤细胞中有PAP的表达，而且这些表达PAP的肿瘤细胞能够被PAP213221多肽特异性CTL所识别［11］.同时也有文献报导在胰腺的神经内分泌肿瘤、小肠癌、后肠源性肿瘤和膀胱腺癌中都发觉有PAP的表达［8-9，17-18］.另外，PAP还被建议作为血管内巨B细胞淋巴细胞瘤的肿瘤标志物［10］.这些报导提示PAP可能作为非前列腺肿瘤特异性免疫医治的靶分子.因此，咱们对一些非前列腺腺癌中的PAP表达水平进行检测，结果说明有相当比例的腺癌细胞和腺癌组织都为PAP阳性.RTPCR结果显示结肠癌、胃癌和乳腺癌细胞中有PAPmRNA的表达；

WesternBlot结果说明结肠癌、胃癌和乳腺癌细胞中有PAP蛋白的表达；

另外，在结肠癌、胃癌和乳腺癌切片中也观测到PAP阳性染色.这一系列证听说明PAP不仅能够作为前列腺癌，还能够作为其他一些腺癌的主动免疫医治的靶点.

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