高效薄层色谱法鉴别种中药多糖Word文档格式.docx
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DiscriminationofPolysaccharidesfromSixTraditionalChineseMedicinesusingHigh-performanceThin-layerChromatography
YANGCheng,GUANJia,ZHANGJiang-sheng,LIShao-ping*（InstituteofChineseMedicalSciences,UniversityofMacau,MacaoSAR,China）
ABSTRACT:
OBJECTIVETodistinguishthepolysaccharidesfromdifferentTraditionalChinesemedicines（TCMs）.METHODSTheacidhydrolyzatesofpolysaccharideswereanalyzedbyhigh-performancethin-layerchromatography（HPTLC）combinedwithtwocolorationmethodsandthinlayerscanningtechnique.RESULTSThechromatographywasperformedonnanosilicagel60platewithn-butanol-methanol-chloroform-aceticacid-water（12.5:
5:
1.5,v/v/v/v/v）asmobilephase.7monosaccharidesand2glycuronicacidswereusedasreferencecompounds.Theaniline-diphenylaminesolutionandninhydrinsolutionwereemployedfordetectionofsaccharidesandaminoacids,respectively.ThepolysaccharidesfromCordycepssinensis,Ganodermalucidum,Astragalusmemberanaceus,Panaxginseng,PanaxquinquefoliiandPanaxnotogisengwereeasilydiscriminatedbasedontheircharacteristicTLCprofiles.CONCLUSIONAsimple,rapidandeffectiveHPTLCmethodwasdevelopedfordistinguishingthepolysaccharidesfrom6TCMs,whichishelpfultocontrolthequalityofpolysaccharidesfromChinesemedicine.
KEYWORDS:
Polysaccharides;
HPTLC;
Qualitycontrol;
TCMs
多糖是一类由单糖（通常大于10个）通过糖苷键连接而成生物大分子聚合物，是生物体维持生命活动必需物质。
近年来，由传统中药及天然药物中分离得到多糖类成分，因其广泛生物活性，如抗肿瘤，调节免疫，抗病毒等[1-4]已成为多糖研究热点。
然而，如何鉴别不同来源中药多糖一直是个难题，也是多糖质量控制关键问题。
目前多种现代仪器分析方法，如薄层色谱[5]、气相色谱[6]、高效液相色谱[7]、质谱[8]、核磁共振[9]等已应用于多糖结构分析中，其中薄层色谱因其简单、快速、样本量大、成本低等优点已成为单糖、寡糖成分鉴别常用方法[5]。
本文应用高效薄层色谱（HPTLC）法对6种常用中药多糖酸水解产物进行分析，以7种单糖和2种糖醛酸为对照，采用2种不同显色剂对组成糖类成分及结合氨基酸类成分分别显色，获得了可用于鉴别特征薄层色谱。
1仪器和试药
Desga高效薄层系统（含AS30自动点样器，CD60扫描仪，ProQuant扫描软件德国Desga公司）；
双槽展开缸；
高效硅胶60板（德国MACHEREY-NAGEL公司）。
微波提取仪（Multiwave3000,Antonpaar,奥地利）
D-半乳糖，D-葡萄糖，D-核糖，D-木糖，D-甘露糖，L-阿拉伯糖，L-鼠李糖，D-半乳糖醛酸，D-葡萄糖醛酸（美国Sigma公司）;
水（MilliQ纯水）；
其他试剂均为分析纯。
人参（Panaxginseng），西洋参（Panaxquinquefolii），三七（Panaxnotoginseng），冬虫夏草（Cordycepssinesis）购于澳门中侨参茸公司，黄芪（Astragalusmemberanaceus）采自山西，灵芝（Ganodermalucidum）采自安徽金寨，均由通讯作者鉴定。
2方法
2.1对照品溶液制备
取D-葡萄糖0.5mg，D-核糖1.5mg，D-木糖1.5mg，D-甘露糖0.5mg，L-阿拉伯糖1.0mg，L-鼠李糖0.5mg，D-半乳糖醛酸1.0mg，D-葡萄糖醛酸1.0mg，精确称定，溶于1mL95%乙醇制成混合对照品溶液。
2.2供试品溶液制备
取干燥药材粉末1g，加入10mL水，置微波提取仪中于120◦C下提取15min，提取液于4500rpm下离心10min后取上清液，加入40mL95%乙醇后于4◦C冰箱内醇沉过夜。
混悬液再次离心，弃去上清液，沉淀以5mL95%乙醇洗涤2次后冷冻干燥得粗多糖。
取粗多糖10mg溶于5mL三氟醋酸（TFA），置于氮气保护密封试管内100◦C水解2h。
水解液低压旋干，残渣溶于1mL50%乙醇得供试品溶液。
2.3展开剂和显色剂
以正丁醇：
1.5（v/v）展开，苯胺-二苯胺溶液（二苯胺4g、苯胺4mL、85%磷酸20mL混合溶解于200mL丙酮溶液中）和茚三酮溶液（0.2g茚三酮溶解于100mL丙酮中）为显色剂。
2.4薄层层析
高效薄层板（20cm×
10cm），点样量10μL，混合对照品点样1μL，样品条带宽10mm，间隔15mm，起始点样高度10mm。
点样后薄层板放入已预先饱和30min双槽层析缸中展开，展开距离9cm，取出吹干，喷显色剂苯胺-二苯胺显色后，130◦C加热显色至斑点清晰；
或喷茚三酮后，105◦C加热显色至斑点清晰，覆盖同样大小玻璃板，四周用胶布封固后作薄层扫描。
3结果
3.1多糖水解条件优化
3.1.1酸选择
参考文献[10]方法，以人参多糖为样品分别使用硫酸、盐酸和三氟醋酸进行完全酸水解考察。
硫酸水解：
10mg样品加入5mL1mol•L-1硫酸，密封试管100◦C下水解4h，水解液冷却后加入足量碳酸钡中和，4500rpm下离心10min后收集上清液，沉淀以5mL50%乙醇洗涤后再离心，合并上清液。
上清液于40◦C下低压蒸干，残渣溶于1mL50%乙醇备用。
盐酸水解：
10mg样品加入5mL2mol•L-1盐酸，100◦C水解4h，水解液冷却后加入NaOH溶液中和，溶液于40◦C下低压蒸干，残渣溶于1mL50%乙醇备用。
三氟醋酸水解：
水解方法同2.2，水解时间为4h。
结果见图1，由图可见，盐酸水解后因中和步骤产生大量NaCl，干扰了展开条带；
硫酸水解产物可得清晰条带，但因中和步骤繁琐而导致产物损失；
采用TFA水解，操作简单，条带多且清晰，产物损失较小，故选用TFA进行多糖水解。
图1多糖水解用酸选择
L1－TFA水解；
L2－硫酸水解；
L3－盐酸水解；
L4－混合对照品；
1，D-半乳糖醛酸；
2，D-葡萄糖醛酸；
3，D-半乳糖；
4，D-葡萄糖；
5，D-甘露糖；
6，D-阿拉伯糖；
7，D-木糖；
8，D-核糖；
9，L-鼠李糖
Fig1Selectionoftheacidforhydrolysisofpolysaccharides
L1－TFAhydrolysate;
L2－H2SO4hydrolysate;
L3－HClhydrolysate;
L4－Mixedstandards;
1,D-Galacturonicacid;
2,D-Glucuronicacid;
3,D-Galactose;
4,D-Glucose;
5,D-Mannose;
6L-Arabinose;
7,D-Xylose;
8,D-Ribose;
9,L-Rhamnose
3.1.2酸浓度优化
以3.1.1中TFA水解条件，分别使用2、1.5、1mol•L-1TFA进行水解，考察不同浓度TFA对多糖水解影响。
结果如图2，由图可见，随酸浓度降低，水解不完全，释放出半乳糖醛酸（条带1）减少，且条带3下方条带（可能是未水解寡糖）增多，干扰糖醛酸检测，因此酸浓度选用2mol•L-1。
图2三氟乙酸浓度优化
L1－2mol•L-1；
L2－1.5mol•L-1；
L3－1mol•L-1；
1－9，同图1
Fig2OptimizationofTFAconcentrationforthehydrolysis
L1－2mol•L-1;
L2－1.5mol•L-1;
L3－1mol•L-1;
1－9，sameasinFig1
3.1.3水解时间优化
以3.1.2中确定TFA水解条件，分别考察4h、2h、1h等不同水解时间。
结果如图3，由图可见，1h时水解不完全，条带3下方可见明显未水解寡糖条带，干扰糖醛酸检测，2h和4h水解效果相近，因此选择水解2h。
图3多糖酸水解时间优化
L1－4
h；
L2－2h；
L3－1h；
Fig3OptimizationofTFAhydrolysistime
L1－4h;
L2－2h;
L3－1h;
3.1.4重复性考察
以3.1.3中所确定TFA水解条件，取3份人参多糖样品平行水解，考察重复性，结果如图4，表明本水解条件重复性良好。
图4水解重复性考察
L1－L3，3份平行水解样品；
Fig4Repeatabilityforacidhydrolysisofpolysaccharidesfromginseng
L1－L3，3hydrolyzates;
3.2多糖薄层色谱鉴别
3.2.1组成糖类成分特征色谱
6种中药多糖经完全酸水解后，以苯胺－二苯胺试剂显色，可得组成糖类成分特征色谱，如图5。
由图可见，6种多糖主要组成单糖均有葡萄糖，半乳糖，甘露糖，其中黄芪多糖、人参多糖、西洋参多糖及三七多糖中还含有少量阿拉伯糖和鼠李糖，并伴有少量半乳糖醛酸。
灵芝多糖中呈现一条特殊黄绿色条带（图中箭头所示），可和其他多糖区分。
冬虫夏草多糖中没有检测到糖醛酸。
综上，通过糖类成分特征图谱，冬虫夏草多糖及灵芝多糖可明显区别和其他四种植物多糖。
图56种中药多糖酸水解产物苯胺－二苯胺显色薄层色谱图
L1，黄芪；
L2，冬虫夏草；
L3，灵芝；
L4，西洋参；
L5，人参；
L6三七；
L7－混合对照品；
Fig5HPTLCphotographsofacidhydrolyzatesofpolysaccharidesfromsixTCMscolorizedbyaniline-diphenylaminesolution
LI，Astragalusmemberanaceus；
L2，Cordycepssinesis；
L3，Ganodermalucidum；
L4，Panaxquinquefolii；
L5，Panaxginseng；
L6，Panaxnotoginseng；
L7－Mixedstandards;
3.2.2氨基酸类成分特征色谱
6种多糖经完全酸水解后，以茚三酮试剂显色，可得多糖中氨基酸类成分特征色谱，如图6。
图66种中药多糖水解产物茚三酮显色薄层色谱图
L1－L6，同图5；
A－K，特征条带
Fig6HPTLCphotographsofacidhydrolyzatesofpolysaccharidesfromsixTCMscolorizedbyninhydrinsolution
LI－L6，sameasinFig5；
A－K，characteristicbands
另对灵芝中5个特征条带（A，B，K，D和J）做光谱扫描，发现该类显色成分在550nm处有最大吸收，故以550nm为扫描波长，背景吸收较弱700nm为参比波长，对所有样品进行透射模式扫描，狭缝宽度为6.00nm×
0.02nm。
结果如图7。
图76种中药多糖水解产物茚三酮显色光谱扫描图（λ=550nm）
A－K，图6中特征条带对应色谱峰
Fig7HPTLCscanningprofilesofacidhydrolyzatesofpolysaccharidesfromsixTCMscolorizedbyninhydrinsolution
A－K，peaksofcharacteristicbandsinFig6.
由图可见，黄芪、灵芝、冬虫夏草多糖水解产物中含有较多可使茚三酮显色物质，而人参、三七和西洋参多糖中则较少。
冬虫夏草多糖（L2）可见H、I两个特征条带；
而灵芝多糖（L3）亦含有一特征条带K；
黄芪多糖（L1）则含有一特征条带C，另外黄芪中含有条带F而灵芝和虫草中几乎没有，且虫草和灵芝中有J带而黄芪则没有，由此可区分黄芪多糖。
西洋参多糖（L4）有明显D条带，而三七和人参中不含有；
三七和人参多糖（L5和L6）结果较为相似，但L5中A条带颜色明显深于L6。
综上，通过氨基酸类成分特征图谱，6种中药多糖基本可以明确区分。
4讨论
4.1本研究通过优化酸水解条件，以获得多糖完全酸水解产物，保证结果重现及特征图谱稳定。
另本文应用薄层色谱成功分离分析了七种单糖及两种糖醛酸，可用于多糖组成分析。
4.2多糖经完全酸水解后可释放出组成单糖及其他结合物质，应用苯胺－二苯胺试剂可对糖类成分显色，检测组成单糖种类；
而水解产生氨基酸类成分，则可由茚三酮试剂显色。
所获得两类成分特征图谱，较全面反映了多糖组分信息，增强了谱图特征性。
4.3本文所建立高效薄层色谱法简单快速，操作简便，结果直观，可有效鉴别不同来源中药多糖，为其质量控制提供了一条新思路。
REFERENCES
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