化妆品安全技术规范Word文档下载推荐.docx

化妆品安全技术规范Word文档下载推荐.docx

《化妆品安全技术规范Word文档下载推荐.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《化妆品安全技术规范Word文档下载推荐.docx（25页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

L-色氨酸（MW204）

102mg

加蒸馏水至

1000ml

配制：

将上述成分加热，以溶解生物素，然后在0.068MPa下高压灭菌20min。

贮于4℃冰箱。

若试验中不使用大肠杆菌，则不添加色氨酸。

5.2顶层琼脂培养基

琼脂粉1.2g

氯化钠1.0g

加蒸馏水至200mL

上述成分混合后，于0.103MPa下高压灭菌30min。

实验时，加入0.5mmol/L组氨酸-0.5mmol/L色氨酸-0.5mmol/L生物素溶液20mL。

5.3Vogel-Bonner（V-B）培养基E

枸椽酸（C6H8O7·

H2O）100g

磷酸氢二钾（K2HPO4）500g

磷酸氢铵钠（NaNH4HPO4·

4H2O）175g

硫酸镁（MgSO4·

7H2O）10g

加蒸馏水至1000mL

先将前三种成分加热溶解后，再将溶解的硫酸镁缓缓倒入容量瓶中，加蒸馏水至1000mL。

于0.103MPa下高压灭菌30min。

储于4℃冰箱。

5.420%葡萄糖溶液

葡萄糖200g

加少量蒸馏水加温溶解葡萄糖，再加蒸馏水至1000mL。

于0.068MPa下高压灭菌20min。

5.5底层琼脂培养基

琼脂粉7.5g

蒸馏水480mL

V-B培养基E10mL

20%葡萄糖溶液10mL

首先将前两种成分于0.103MPa下高压灭菌30min后，再加入后两种成分，充分混匀倒底层平板。

按每皿25mL制备平板，冷凝固化后倒置于37℃培养箱中24h，备用。

5.6营养肉汤培养基

牛肉膏2.5g

胰胨5.0g

磷酸氢二钾（K2HPO4）1.0g

加蒸馏水至500mL

将上述成分混合后，于0.103MPa下高压灭菌30min。

5.7盐溶液（1.65mol/LKCl+0.4mol/LMgCl2）

氯化钾（KCl）61.5g

氯化镁（MgCl2·

6H2O）40.7g

在水中溶解上述成分后，于0.103MPa下高压灭菌30min。

5.80.2mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.4）

磷酸二氢钠（NaH2PO4·

2H2O）2.965g

磷酸氢二钠（Na2HPO4·

12H2O）29.015g

溶解上述成分后，于0.103MPa下高压灭菌30min。

5.9S9混合液

成分每毫升S9混合液

肝S9100μl

盐溶液20μl

灭菌蒸馏水380μl

0.2mol/L磷酸盐缓冲液500μl

辅酶II（NADP）4μmol

6-磷酸葡萄糖（G-6-P）5μmol

将辅酶II和6-磷酸葡萄糖置于灭菌三角瓶内称重，然后按上述相反的次序加入各种成分，使肝S9加到已有缓冲液的溶液中。

该混合液必须临用现配，并保存于冰水浴中。

实验结束，剩余S9混合液应该丢弃。

5.10菌株鉴定用和特殊用途试剂

5.10.1组氨酸-色氨酸-生物素平板

琼脂粉15g

蒸馏水934mL

（V-B）培养基E20mL

20%葡萄糖20mL

灭菌盐酸组氨酸水溶液（0.5g/100mL）10mL

灭菌盐酸色氨酸水溶液（0.5g/100mL）10mL

灭菌0.5mmol/L生物素溶液6mL

高压灭菌琼脂和水后，将灭菌20%葡萄糖，V-B培养基、组氨酸溶液，加进热的琼脂溶液中（若试验中不使用大肠杆菌，则不添加色氨酸，同时蒸馏水改为944ml）。

待溶液稍微冷却后，加入灭菌生物素，混匀，浇制平板。

5.10.2氨苄青霉素平板和氨苄青霉素/四环素平板

蒸馏水930mL

（V-B）盐溶液20mL

20%葡萄糖20mL

灭菌盐酸组氨酸溶液（0.5g/100mL）10mL

氨苄青霉素溶液（8mg/mL于0.02mol/LNaOH中）3.15mL

四环素溶液（8mg/mL于0.02mol/LHCl中）0.25mL

琼脂和水高压灭菌20min，将无菌的葡萄糖、VB盐溶液、组氨酸溶液和色氨酸溶液，加进热的琼脂溶液中，混匀（若试验中不使用大肠杆菌，则不添加色氨酸，同时蒸馏水改为加940ml）。

冷却至大约50℃，无菌条件下加入四环素溶液和/或氨苄青霉素溶液。

应该在倾注琼脂平板后几天内，制备主平板。

5.10.3营养琼脂平板

营养肉汤培养基500mL

于0.103MPa下高压灭菌30min后倾注平板。

6试验菌株及其生物学特性鉴定

6.1试验菌株

采用以下菌株作为标准组合：

鼠伤寒沙门氏菌TA1535；

鼠伤寒沙门氏菌TA97或TA97a或TA1537；

鼠伤寒沙门氏菌TA98；

鼠伤寒沙门氏菌TA100；

鼠伤寒沙门氏菌TA102或大肠杆菌WP2uvrA或大肠杆菌WP2uvrA（pKM101）；

6.2生物学特性鉴定

新获得的或长期保存的菌种，在试验前必须进行菌株的生物特性鉴定。

菌株鉴定的判断标准，如表1所示。

表1试验菌株鉴定的判断标准

菌株

组氨酸缺陷

色氨酸缺陷

脂多糖屏障缺损

氨苄青霉素抗性

切除修复缺损

四环素

抗性

自发回变菌落参考数*

Ames实验室

Zeiger实验室

TA97

+

/

-

90~180*

75~200*

TA97a

TA98

30~50

20~50

TA100

100~200

75~200

TA102

240~320*

100~400*

TA1535

10~35

5~20

TA1537

3~15

WP2uvrA

WP2uvrA（pKM101）

注

“+”表示需要组氨酸

“+”表示需要色氨酸

“+”表示具有rfa突变

“+”表示具有R因子

“+”表示对于鼠伤寒沙门氏菌具有△uvrB

突变，对于大肠杆菌，具有△uvrA突变

“+”表示具有pAQ1质粒

*在体外代谢活化条件下自发回变菌

落数略增。

对于各菌的自发回变范围，各个实验室在参考其他实验室数据的基础上应建立自己的历史对照数据库，形成适合本实验室条件的适用范围。

同时，实验室背景数据应当与文献报道相符。

6.2.1组氨酸缺陷/色氨酸缺陷

原理：

组氨酸缺陷型试验菌株本身不能合成组氨酸，只能在补充组氨酸的培养基上生长，而在缺乏组氨酸的培养基上，则不能生长。

色氨酸缺陷试验菌株本身不能合成色氨酸，只能在补充色氨酸的培养基上生长，而在缺乏色氨酸的培养基上，则不能生长。

鉴定方法：

将测试菌株增菌液分别于含组氨酸或者色氨酸培养基平板和无组氨酸或者色氨酸平板上划线，于37℃下培养24h后观察结果。

结果判断：

组氨酸缺陷型菌株在含组氨酸平板上生长，而在无组氨酸平板上则不能生长；

色氨酸缺陷型菌株在含色氨酸平板上生长，而在无色氨酸平板上则不能生长。

6.2.2脂多糖屏障缺损

具有深粗糙（rfa）的菌株，其表面一层脂多糖屏障缺损，因此一些大分子物质,如结晶紫能穿透菌膜进入菌体，从而抑制其生长，而野生型菌株则不受其影响。

吸取待测菌株增菌液0.1mL于营养琼脂平板上划线，然后将浸湿的0.1%结晶紫溶液滤纸条与划线处交叉放置。

37℃下培养24h后观察结果。

假若待测菌在滤纸条与划线交叉处出现一透明菌带，说明该待测菌株具有rfa突变。

6.2.3氨苄青霉素抗性

含R因子的试验菌株对氨苄青霉素有抗性。

因为R因子不太稳定，容易丢失，故用氨苄青霉素确定该质粒存在与否。

吸取待测菌株增菌液0.1mL，在氨苄青霉素平板上划线，37℃下培养24h后观察结果。

结果判断；

假若测试菌在氨苄青霉素平板上生长，说明该测试菌具有抗氨苄青霉素作用，表示含R因子，否则，表示测试菌不含R因子或R因子丢失。

6.2.4紫外线敏感性

具有△uvrB/A突变的菌株对紫外线敏感，当受到紫外线照射后，不能生长，而具有野生型切除修复酶的菌株，则能照常生长。

吸取待测菌株增菌液0.1mL于营养琼脂平板上划线，用黑纸盖住平板的一半，置紫外灯下照射（15W，距离33cm）8秒钟。

置37℃下孵育24h后观察结果。

具有△uvrB/A突变的菌株对紫外线敏感，经辐射后细菌不生长，而具有完整的切除修复系统的菌株，则照常生长。

6.2.5四环素抗性

具有pAQI的菌株对四环素有抗性。

吸取待测菌株增菌液0.1mL于氨苄青霉素/四环素平板上划线，置37℃下孵育24h后观察结果。

假若测试菌照常在氨苄青霉素/四环素平板上生长，表明该测试菌株对氨苄青霉素和四环素两者有抗性，具有pAQI质粒，否则，说明测试菌株不含pAQI质粒。

6.2.6自发回变

每种试验菌株都以一定的频率自发地产生回变，称为自发回变。

这种自发回变是每种试验菌株的一项特性。

将待测菌株增菌液0.1mL加到2mL含组氨酸-色氨酸-生物素的顶层琼脂培养基的试管内（若试验中不使用大肠杆菌，则不添加色氨酸），混匀后铺到于底层琼脂平板上，待琼脂固化后，置37℃培养箱中孵育48h后记数每皿回变菌落数。

每种标准测试菌株的自发回变菌落数应符合表1要求。

经体外代谢活化后的自发回变菌落数，要比直接作用下的略高。

6.2.7回变特性-诊断性试验

每种试验菌株对诊断性诱变剂回变作用的性质以及S9混合液的效应不一。

按照平板掺入试验的操作步骤进行。

将受试物换成诊断性诱变剂。

标准菌株对某些诊断性诱变剂特有的回变结果参见表2。

表2测试菌株的回变性

诱变剂

剂量

（μg/皿）

S9

TA100

柔毛霉素

6.0

124

3123

47

592

叠氮化钠

1.5

76

3

3000

188

320（0.5μg）

ICR—191

1.0

1640

63

185

链霉黑素

0.25

inh

inh

2230

丝裂霉素C

0.5

2772

2,4,7-三硝基-9-芴酮

0.20

8377

8244

400

16

4-硝基-O-次苯二胺

20

2160

1599

798

4-硝基喹啉-N-氧化物

528

292

4220

287

610

甲基磺酸甲酯

1.0（μl）

174

23

2730

6586

敌克松

50.0

2688

1198

183

895

9-氨基吖啶

50

337

2-氨基芴

10

1742

6194

3026

261

苯并（a）芘

143

937

255

110（5μg）

2-氨基蒽

/

380（5μg）

300

注：

inh表示抑菌。

7大鼠肝微粒体酶的诱导和S9的制备

7.1诱导

选择健康雄性成年大鼠，体重200g左右。

将多氯联苯（PCB混合物）溶于玉米油中，浓度为200mg/mL，按500mg/kg体重一次腹腔注射，5d后处死动物，处死前禁食12h。

也可采用苯巴比妥钠和β-萘黄酮联合诱导的方法进行制备。

经口或腹腔注射给予80mg/kg苯巴比妥钠和80mg/kgβ-萘黄酮，连续3天，处死前禁食16h。

7.2S9制备

首先，用75%酒精消毒动物皮毛，剖开腹部。

在无菌条件下，取出肝脏，去除肝脏的结缔组织，用冰浴的0.15mol/L氯化钾溶液淋洗肝脏，放入盛有0.15mol/L氯化钾溶液的烧杯里。

按每克肝脏加入0.15mol/L氯化钾溶液3mL。

用电动匀浆器制成肝匀浆，再在低温高速离心机上，在4℃条件下，以9000g离心10min，取其上清液（S9）分装于塑料管中。

每管装2mL-3mL。

储存于液氮生物容器中或-80℃冰箱中备用。

上述全部操作均在冰水浴中和无菌条件下进行。

制备肝S9所用一切手术器械、器皿等，均经灭菌消毒。

S9制备后，其活力需经诊断性诱变剂进行鉴定。

8溶剂的选择

如果受试物为水溶性，可用灭菌蒸馏水作为溶剂；

如为脂溶性，应选择对试验菌株毒性低且无致突变性的有机溶剂，常用的有二甲基亚砜（DMSO）、丙酮、95%乙醇。

一般操作中，为了减少误差和溶剂的影响，常按每皿使用剂量用同一溶剂配成不同的浓度，固定加入量为100μl。

9剂量的设计

决定受试物最高剂量的标准是对细菌的毒性及其溶解度。

自发回变数的减少，背景菌变得清晰或被处理的培养物细菌存活数减少，都是毒性的标志。

对原料而言，一般最高剂量组可为5mg/皿或5µ

l/皿。

对产品而言，有杀菌作用的受试物，最高剂量可为最低抑菌浓度，无杀菌作用的受试物，最高剂量可为原液。

受试物至少应设四个剂量组。

每个剂量均做三个平行平板。

10试验操作步骤

10.1增菌培养

取营养肉汤培养基5mL，加入无菌试管中，将主平板或冷冻保存的菌株培养物接种于营养肉汤培养基内，37℃振荡（100次/min）培养10h。

该菌株培养物应每毫升不少于1-2×

109活菌数。

10.2平板掺入法

实验时，将含0.5mmol/L组氨酸-0.5mmol/L色氨酸-0.5mmol/L生物素溶液（若试验中不使用大肠杆菌，则不添加色氨酸）的顶层琼脂培养基2.0mL分装于试管中，45℃水浴中保温，然后每管依次加入试验菌株增菌液0.1mL，受试物溶液0.1mL和磷酸盐缓冲液0.5ml或者S9混合液0.5mL（需代谢活化时），充分混匀，迅速倾入底层琼脂平板上，转动平板，使之分布均匀。

水平放置待冷凝固化后，倒置于37℃培养箱里孵育48h。

记数每皿回变菌落数。

实验中，除设受试物各剂量组外，还应同时设空白对照、溶剂对照、阳性诱变剂对照和无菌对照。

11数据处理和结果判断

记录受试物各剂量组、空白对照（自发回变）、溶剂对照以及阳性诱变剂对照的每皿回变菌落数，并求平均值和标准差。

如果受试物TA1535、TA1537、WP2uvrA的回变菌落数是溶剂对照回变菌落数的三倍或三倍以上，受试物TA97、TA97a、TA98、TA100、TA102、WP2uvrA（pKM101）的回变菌落数是溶剂对照回变菌落数的二倍或二倍以上，并出现以下情形之一，则该受试物判定为致突变阳性，

（1）呈剂量-反应关系

（2）任何一个剂量条件下，出现阳性反应并有可重复性

受试物经上述五个试验菌株测定后，只要有一个试验菌株，无论在加S9或未加S9条件下为阳性，均可报告该受试物细菌回复突变试验为致突变阳性。

如果受试物经五个试验菌株检测后，无论加S9和未加S9均为阴性，则可报告该受试物为致突变阴性。

《鼠伤寒沙门氏菌/回复突变试验》修订说明

为进一步完善化妆品安全技术规范，针对规范实施中出现的问题，结合化妆品原料及产品安全性评价的要求，参考其他相关标准对《化妆品安全技术规范》（2015年版）中鼠伤寒沙门氏菌/回复突变试验相关内容进行修订。

一、修订的必要性

1.作为《化妆品安全技术规范》的重要参考文献食品安全国家标准GB15193.4-2014《细菌回复突变试验》已参考国际最新指导原则进行了修订。

2.《化妆品安全技术规范》规定试验用菌株标准组合为TA97、TA98、TA100和TA102。

OECDGuidelinesforTestingofChemicals：

Bacterialreversemutationtest（No.471,21stJuly1997）中推荐的菌株组合为：

（1）S.typhimuriumTA1535，and

（2）S.typhimuriumTA1537orTA97orTA97a，and

（3）S.typhimuriumTA98，and

（4）S.typhimuriumTA100，and

（5）E.coliWP2uvrA，orE.coliWP2uvrA（pKM101），orS.typhimuriumTA102.

由于菌株TA1535对某些特殊的致突变物敏感，且TA1535（无质粒pKM101）可以与其R因子的衍生物TA100（有质粒pKM101）相互补充，故在《化妆品安全技术规范》规定试验用菌株标准组合中需加入菌株TA1535。

TA1537、TA97和TA97a均含有胞嘧啶的重复序列，其位于相应的组氨酸靶位点内的突变敏感部位，它们对导致这些移码位点中碱基缺失的移码诱变剂的敏感性相似，因此该三种菌株在试验中可相互代替。

鼠伤寒沙门氏菌TA102或大肠杆菌WP2uvrA或大肠杆菌WP2uvrA（pKM101）在试验中可以相互替代。

ICH颁布的ICHS2（R1）、FDA颁布的Redbook2000和《药物遗传毒性研究技术指导原则》（2007年）中也遵循了OECD指导原则中对于菌株组合的要求，即TA1537、TA97和TA97a可以相互替代。

TA97a是TA97的纯化形式，1991年文献报道TA97菌株在应用上存在以下缺点：

过夜培养的菌液活性较低、背景菌落不明显，平皿上回复突变产生的菌落较细小。

其原因与该菌株的uvrB基因缺失有关。

因此，Ames实验室对TA97菌株进行了改进,改进后的重组菌株命名TA97a以代替原来的TA97。

改进后的TA97a生长特性较TA97好。

目前TA97市场上已很难获得，考虑到实际情况，且完善菌株组合使其更充分的反映出受试物的致突变性，需要对化妆品安全技术规范进行修改，增加TA1535、TA97a和TA1537作为试验中菌株组合的选择，制定更符合国情的化妆品安全技术规范。

3.对于Ames试验中使用的TA97，TA98，TA100和TA102菌株，《化妆品安全技术规范》给出了明确的自发回变菌落数。

我国最新的食品安全国家标准细菌回复突变试验（GB15193.4-2014）给出了Ames实验室和Zeiger实验室两个实验室的自发回复突变数的范围供参考，并且同时指出：

对于各菌株的自发回变范围，各个实验室在参考其他实验室数据的基础上应建立自己的历史对照数据库，形成适合本实验室的实用范围。

另外，国内相关检验规范及其他实验室的背景数据都表明不同实验室的菌株自发回复突变数是不同的。

因此目前国际上的指导原则包括OECD471、ICHS2（R1）和FDARedbook，均没有规定菌株自发回复突变数的范围。

每个实验室都应在参考其他实验室数据的基础上建立自己的历史对照数据库。

就以上原因，需要对《化妆品安全技术规范》进行修改，要求各个实验室建立自己的历史对照数据库，使其更具有科学性。

4.《化妆品安全技术规范》中表2给出了不同菌株的阳性对照物作为参考，但未给出敌克松的相关参考数据。

敌克松已经作为一种常用的阳性对照物用于Ames试验，国内很多实验室用敌克松作为菌株的阳性对照，因此，需要对规范进行修改，增加敌克松的相关参考数据，使规范更加完整。

5.修改了数据处理和结果判断的内容，使表达更加清楚、明确。

二、修订依