细菌内毒素检查实用标准操作规程Word文件下载.docx
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1.4在使用新一批号的鲎试剂前，必须进行鲎试剂灵敏度复核实验。
1.5药典中已有规定的品种或有其他毒素检验标准的品种，可直接进行毒素检查，如在检验中出现干扰的情况需再进行干扰实验的验证；
其他未建立毒素检查的品种需
先进行干扰实验，确定不干扰浓度后再进行毒素检查。
1.6细菌毒素检查过程中的阴性对照、阳性对照和供试品对照必须同时进行，否则实验结果无效。
2实验材料及用具
2.1天平
供试品称量用，精度为0.1mg以下。
2.2电热干燥箱
除外源性毒素用，温度应能达到250℃。
2.3恒温水浴箱或适宜的恒温器（37℃±
1℃）。
2.4水银温度计或酒精度计，精度在1℃以下。
2.5旋涡混合器。
2.6鲎试剂，应具有国家主管部门的批准文号。
2.7细菌毒素国家标准品或细菌毒素工作标准品，除另有规定外，应使用由中国药典生物制品检定所统一发放的标准品。
2.8凝胶法细菌毒素检查用水系指毒素含量小于0.015EU/ml的灭菌注射用水。
光度测定用的检查用水，其毒素的含量应小于0.005EU/ml。
2.9实验用具
移液管（或刻度吸管、微量加样器及无热原吸头）、凝集管（10mm×
75mm）、三角瓶、试管试管架、洗耳球、时钟、75%酒精棉、剪刀、砂轮。
所用玻璃器皿
须经250℃干烤至少1小时。
若使用塑料器械，如微孔板和与微量加样器配套的吸头等，应选用标明无毒素并且对实验无干扰的器械。
2.10细菌毒素光度测定仪器
3实验准备
3.1玻璃器皿的洗涤
竟玻璃器皿放入铬酸洗液或其他热原灭活剂或清洗液中充分浸泡，然后取出将洗液空干，用自来水竟残留洗液彻底洗净，再用蒸馏水反复冲洗三遍以上
，空干后放入适宜的密闭金属容器中或用锡箔纸包好后再放入金属容器，放置入烤箱。
3.2除去玻璃器皿表面可能存在的外源性毒素
玻璃器皿置烤箱后，将烤箱调至250℃，待烤箱温度升至设定的温度后开始计时，干烤至少1小时。
达到规定时间后，关断电
源，待烤箱温度自然降至室温。
在不打开包装的情况下，可在两天使用；
如果玻璃器皿用锡箔纸包装，在不打开包装的情况下可在两周使用，否则再次干烤除去可能存在的
外源性毒素。
4凝胶法操作方法
4.1鲎试剂灵敏度复核
鲎试剂灵敏度复核的目的不仅是考察鲎试剂的灵敏度是否正确，也是考察检验人员操作方法是否正确及实验条件是否符合规定。
因此要求每个实验室在使用一批新的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核实验。
4.1.1实验操作
4.1.1.1细菌毒素标准溶液的制备
取细菌毒素国家标准品或工作标准品一支，轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底，然后用砂轮在瓶颈上部轻轻划痕，75%酒精棉球擦拭后启开，开启过程中应防止玻璃屑落入瓶。
按照标准品说明书，加入规定量的细菌毒素检查用水溶解其容物，用封口膜将瓶口封严，置旋涡混合器上混合15分钟。
然后进行稀释，制备成4个浓度的细菌毒素标准溶
液，即2.0λ、0.5λ、0.25λ（λ为所复核的鲎试剂的标示灵敏度），每稀释一步均应在旋涡混合器上混合30秒钟（详细过程参见标准品使用说明书）。
若使用的为细菌毒素国家标准品，可按其使用说明书中的方法将其稀释至规定浓度后分装、保存。
若为细菌毒素工作品，为一次性使用。
4.1.1.2待复核鲎试剂的准备
取0.1ml/支的鲎试剂18支，轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底，用砂轮在瓶颈轻轻划痕，75%酒精棉球擦拭后启开备用，防止玻璃屑落入瓶。
每支加入0.1ml检查用水溶解，轻轻转
动瓶壁，使容物充分溶解，避免产生气泡。
若待复核鲎试剂的规格不是0.1ml/支时，取若干支按其标示量加入检查用水复溶，充分溶解后将鲎试剂溶液混合在一起，然后每
0.1ml分装到10mm×
75mm凝集管中，要求至少分装18管备用。
4.1.1.3加样
将已充分溶解的待复核鲎试剂18支（管）放在试管架上，排成5列，其中4列4支（管），1列2支（管）。
4支（管）4列每列每支分别加入0.1ml的2λ、λ、0.5λ和0.25λ的
毒素标准溶液；
另2支（管）加入0.1ml检查用水。
4.1.1.4加样结束后，将鲎试剂用封口膜封口，轻轻振动混匀，避免产生气泡，连同试管架放入37℃±
1℃水浴或适宜恒温器中，试管架保持水平状态，保温60±
2分钟。
4.1.1.5观察并记录结果。
将试管架从水浴中轻轻取出，避免振动，将每管拿出缓缓倒转180°
观察，管形成凝胶，并且凝胶不变形，不从管壁滑脱者为阳性，记录为（＋）
；
未形成凝胶或凝胶不能保持完整并从管壁滑脱者为阴性，记录为（－）。
4.1.2实验结果计算
如最大浓度2.0λ4管均为阳性，最低浓度0.25λ4管均为阴性，阴性对照为阴性时实验为有效，按下式计算反应终点浓度的几何平均值即为
鲎试剂灵敏度的复核结果（λC）。
λC=lg-1（∑X/4）
式中X为反应终点浓度的对数值（1g）。
反应终点浓度是系列浓度递减的毒素溶液中最后一个呈阳性结果的浓度。
4.1.3结果判断
当λC在0.5λ-2λ（包括0.5λ和2λ）时判定该批鲎试剂灵敏度复核合格，可用于干扰实验和供试品细菌毒素检查，并以λ（标示灵敏度）为该批鲎试剂的灵敏度。
4.1.4举例
设待复核鲎试剂的灵敏度为0.125EU/ml。
实验结果如下：
毒素浓度
（EU/ml）
0.25
0.125
0.0625
0.
Nc
反应终点浓度X
重
1
复
2
管
3
数
4
＋
－
0.125
＋
0.25
0.0625
=lg-1[（lg0.125＋lg0.25＋lg0.0625＋lg0.0625）/4]
=0.105（EU/ml）
λ在0.5λ-2λ围，符合规定。
并且使用该批鲎试剂时，其灵敏度为标示灵敏度0.105（EU/ml）。
4.2干扰实验
4.2.1操作方法
干扰试验的目的是确定供试品在多大的稀释倍数或浓度下对毒素和鲎试剂的反应不存在干扰作用，为能否使用细菌毒素检查法提供依据。
并且验证当供试品的配方和工艺有
变化，鲎试剂来源改变或供试品阳性对照结果呈阴性时供试品是否存在干扰作用。
由于干扰实验检验的是在供试品存在的情况下毒素与鲎试剂的反应是否正常，与所使用鲎试剂的灵敏度无关，因此在干扰实验预实验中原则上可使用任一灵敏度的鲎试剂。
但
建议使用较低灵敏度（如0.5或0.25EU/ml）的鲎试剂，可尽量避免供试品所含的毒素对干扰实验造成的阳性影响。
4.2.2干扰实验预实验
预实验的目的是初步确定供试品的最大不干扰浓度（当限值以EU/mg或EU/U活性单位表示）或最小不干扰稀释倍数（当限值以EU/ml表示），为正式干扰实验提供依据。
4.2.2.1将无可检测到毒素的供试品进行一系列倍数的稀释，但最大的稀释倍数不得超过MVD=CL/λ0.03（0.03EU/ml为现今我国市售鲎试剂的最高灵敏度）。
4.2.2.2使用鲎试剂对每一稀释倍数进行检验。
每一稀释倍数下做2支供试品管和2支供试品阳性对照（即用该浓度的供试品稀释液将毒素标准品制成2λ浓度）。
另取2支加
入细菌毒素检查用水作为阴性对照，2支加入2λ浓度的毒素标准溶液作为阳性对照。
供试品阳性对照制备举例：
制备稀释倍数为4的供试品阳性对照液方法，取0.3ml浓度为4λEU/ml的毒素标准液＋0.3ml的稀释倍数为2的供试品稀释液
制得0.6ml含2λ
EU/ml毒素标准的稀释倍数为4的供试品稀释液。
保温60±
2分钟后，观察并记录结果。
4.2.2.3当阴性对照为阴性，阳性对照为阳性时，实验为有效。
当系列浓度中出现供试品溶液2管为阴性，供试品阳性对照2管为阳性时，认为供试品在该浓度下不干扰实验，
此稀释倍数即为最小不干扰稀释倍数。
即可选择该稀释倍数进行正式干扰实验。
当系列浓度中所有浓度的供试品管都不为阴性，或供试品阳性对照不为阳性时，说明供试品对毒素与鲎试剂的反应存在干扰，则应对供试品进行更大倍数稀释（不得超过MV
D=CL/λ0.03），或通过气压适宜的方法（如过滤、中和、透析或加热处理等）排除干扰。
当供试品的毒素限值单位为EU/mg或EU/U活性单位时，应将最小不干扰稀释倍数换算成最大不干扰浓度（即该稀释倍数下溶液的浓度），以mg/ml或活性单位/ml表示。
4.2.2.4举例
例：
设某注射液限值为2.5EU/ml，按MVD=CL/λ计算出灵敏度为0.03EU/ml下的MVD为80倍，将供试品溶液稀释一系列检验，用灵敏度为0.25EU/ml的鲎试剂进行预实验。
结
果如下
稀释倍数原液510204080
供试品溶液－－－－－－－－－－－－
供试品阳性对照－－－－－－＋＋＋＋＋＋
如上结果可初步确定该样品的最小不干扰稀释倍数为20倍，可在此浓度下进行正式干扰实验。
4.2.3正式干扰实验
目的是检验在某一浓度下的供试品对于鲎试剂与毒素的反应有无干扰作用。
使用的供试品溶液应为未检验出毒素且不超过所使用的鲎试剂的最大有效稀释倍数的溶液。
4.2.3.1制备毒素标准对照溶液
取1支细菌毒素标准品，用细菌毒素检查用水稀释成4个浓度的标准溶液即2.0λ、λ、0.5λ、0.25λ，（方法同4.1.1.1）。
4.2.3.2制备含毒素的供试品溶液
4.2.3.2.1将供试品稀释至预实验中确定的不干扰稀释倍数，再用此稀释液将4.2.3.1中的同支细菌毒素标准品稀释成4个浓度即2.0λ、1.0λ、0.5λ、0.25λ的含毒素
的供试品溶液。
以注射用头孢哌酮钠（1g/瓶为例：
取10ml检查用水溶解注射用头孢哌酮钠即为100mg/ml，设需将其稀释20倍（5mg/ml）后备用。
（注：
冻干品或无菌粉末用检查用水溶解后
体积有无变化，根据具体情况定）。
取一支细菌毒素标准品，加入1m检查用水溶解，然后取毒素标准溶液0.3ml制备毒素标准对照溶液；
再取毒素标准溶液0.3ml加上2.7ml的5mg/ml头孢哌酮钠溶液，即
为含10倍毒素稀释液的供试品溶液，取0.3ml含10倍毒素稀释液的供试品加上2.7ml的5mg/ml头孢哌酮钠溶液，即为含100倍毒素稀释液的供试品溶液。
其余依次类推。
4.2.3.2.2简化法制备含毒素的供试品溶液：
0.5ml浓度为1.0EU/ml的毒素标准溶液＋0.5ml浓度为10mg/ml的供试品溶液
得到1ml的含0.5EU/ml毒素的浓度为5mg/ml的供试品液。
同理分别用0.5ml浓度为0.5EU/ml、0.25EU/ml、0.125EU/ml的毒素标准溶液制备含0.25EU/ml、0.125EU/ml和0.0625mEU/ml毒素的浓度为5g/ml的供试品系列溶
液。
（其体积的大小视情况而定）。
4.2.3.3鲎试剂的准备
取规格为0.1ml/支的鲎试剂36支，轻弹瓶壁使粉末落入瓶底，用砂轮在瓶颈轻轻划痕，75%酒精棉球擦拭后启开备用，防止玻璃屑落入瓶。
每支加入0.1ml检查用水溶解，轻
轻转动瓶壁，使容物充分溶解，避免产生气泡。
若待复核鲎试剂的规格不是0.1ml/支时，按其标示量加入检查用水复溶，将复溶后的鲎试剂溶液混和在一起，然后每0.1ml分
装到10×
75mm凝集管中，要求至少分装36管备用。
4.2.3.4加样
将准备好的鲎试剂18支（管）放在试管架上，排成5列，4列4支（管），1列2支（管）。
其中的4支4列每列每支分别加入0.1ml的2.0λ、1.0λ、0.5λ、0.25λ的毒素标准
对照液，另一列2支（管）加入0.1ml检查用水作为阴性对照。
将另外18支（管）鲎试剂放在试管架上，排成5列，4列4支（管），1列2支（管）。
其中的4支4列每列每支分别加入0.1ml的2.0λ、1.0λ、0.5λ、0.25λ的毒素的含供试
品溶液；
另一列2支（管）加入0.1ml供试品溶液作为样品阴性对照。
加样结束后，用封口膜封口，轻轻振动混匀，避免产生气泡，两同试管架放入37℃±
1℃水浴或适宜恒温器中，保温60±
4.2.4实验结果计算
如两组最大浓度2.0λ均为阳性，最低浓度0.25λ均为阴性，阴性对照4管均为阴性时，按下式计算用检查用水制成的毒素标准溶液的反应终点浓度的几何平均值（ES）和用
供试品溶液或稀释液制成的毒素溶液的反应终点浓度的几何平均（Et）。
ES=lg-1（∑XS/4）
Et=lg-1（∑Xt/4）
XS,Xt分别为用检查用水和供试品溶液或稀释液制成的毒素溶液的反应终点浓度的对数值（lg）。
4.2.3当ES在0.5λ-2.0λ（包括0.5λ和2.0λ）时，且Et在0.5ES～52.0ES（包括0.5ES和2.0ES）时，则认为供试品在该浓度下不干扰试验，可在该浓度下对此供试品
进行细菌毒素检查。
当ES不在0.5λ-2.0λ（包括0.5λ和2.0λ）时，则认为供试品在该浓度下干扰实验。
应使用适宜的方法排除干扰，如对供试品进行更大倍数稀释，是排除干扰因素的简单有效
方法。
建立新品种细菌毒素检查方法时，每个厂家至少取三个批号（不包括亚批）的供试品，用两个以上鲎试剂生产厂家的鲎试剂进行干扰实验。
4.2.5举例
设供试品为某注射液，预实验中初步确定其最小不干扰稀释倍数为20倍，使用灵敏度为0.125EU/ml的鲎试剂检测供试品是否对毒素检查存在干扰。
毒素浓度（EU/ml）0.25
0.1250.06250.03
Nc反应终点浓度
1毒素标准浓度
2
3
4＋
－
－0.0625
0.0625
1含供试品的
2毒素溶液
4＋
－0.125
0.125
=lg-1[（lg0.0625＋lg0.125＋lg0.0625＋lg0.0625）/4]
=0.125（EU/ml）
Et=lg-1（∑Xt/4）
=lg-1[（lg0.125＋lg0.125＋lg0.125＋lg0.125）/4]
=0.125（EU/ml）
Et在0.5ES～2.0ES围，说明该供试品进行20倍稀释后确已排除干扰作用，在低于或等于此浓度的情况下即可使用细菌毒素检查法。
4.3供试品细菌毒素检查凝胶限度试验
在细菌毒素检查中，每批供试品必须做2支供试品管和2支供试品阳性对照，同时每次实验必须做2支阳性对照和2支阴性对照。
4.3.1操作方法
4.3.1.1供试品溶液的制备
首先计算MVD=C?
L/λ、L的意义同1.3。
λ为所使用鲎试剂的标示灵敏度。
然后将供试品进行稀释，其稀释倍数不得超过MVD。
4.3.1.2阳性对照溶液的制备
用检查用水将毒素标准品稀释制成2λ浓度的毒素标准液。
（方法同4.1.1.1）。
4.3.1.3供试品阳性对照溶液的制备
用待检测的供试品溶液或其稀释液将毒素标准品制成2λ浓度的毒素溶液。
（方法同4.2.1.3.2供试品阳性对照溶液的制备）。
4.3.1.4阴性对照液即细菌毒素检查用水
4.3.1.5鲎试剂的准备
取规格为0.1ml/支的鲎试剂8支，轻弹瓶壁使粉末落入瓶底，用轮在瓶颈轻轻划痕，75%棉球擦拭后启开备用，防止玻璃屑落入瓶。
每支加入0.1ml检查用水溶解、轻轻转动瓶
壁，使溶物充分溶解，避免产生气泡。
若使用的鲎试剂的规格不是0.1ml/支时，取若干支，按其标示量加入检查用水复溶，充分溶解后将鲎试剂溶液混和在一起，然后每
0.1ml分装到10×
75mm凝集管中，要求至少分装8管备用。
4.3.1.6加样
取8支（管）溶解好的鲎试剂，其中2支加入0.1ml供试品溶液或其稀释液（其稀释液不得超过MVD）作为供试品管，2支加入0.1ml阳性对照溶液作为阳性对照
管（PC），2支加入0.1ml检查用水作为阴性对照管，（NC），2支加入0.1ml供试品阳性对照溶液作为供试品阳性对照管（PPC）。
4.3.1.7将试管中溶液轻轻混匀后，用封口膜封闭管口，垂直放入37℃±
保温和取放试管过程应避免受到振动造成假阴性结果。
4.3.2结果判断
当阳性对照都为阳性、供试品阳性对照都为阳性且阴性对照都为阴性时，实验方为有效。
若供试品管2管均为阴性，认为该供试品符合规定；
如供试品2管均为阳性，应认为不符
合规定；
如2管中1管为阳性，1管为阴性，按上述方法另取4支供试品管复试，4管中如有1管为阳性，即认为不符合规定。
若第一次实验时供试品的稀释倍数小于MVD而结果出
现2管均为阳性或2管中1管为阳性时，按同样方法复试，复试时要求将其稀释至MVD。
4.3.3举例
供试品为葡萄糖注射液，其毒素限值为0.5EU/ml，设所用鲎试剂的灵敏度为0.125EU/ml，
L/λ=0.5/0.125=4
将样品进行4倍稀释，并做4倍稀释下的供试品阳性对照。
供试品
供试品阳性对照
阳性对照
阴性对照
－－＋＋＋＋－－
结果是否有效有效
结果判断该批葡萄糖注射液的毒素含量小于0.5EU/ml，符合规定
4.4凝胶半定量实验
半定量实验是使用凝胶法估测供试品中毒素含量的方法。
系利用供试品系列与鲎试剂反应的终点浓度计算出供试品中毒素的含量。
4.4.1操作方法
4.4.1.1供试品系列的制备
用检查用水将供试品溶液从已确定的不干扰浓度或稀释倍数下开始进行对倍稀释，制备成2、4、8等N个浓度，但最大稀释倍数不得超过MVD。
N可根据实验设计不同确定。
4.4.1.2毒素标准系列的制备
用检查用水将毒素标准品稀释成4个浓度的标准溶液即2.0λ、1λ、0.5λ、0.25λ，（方法同4.1.1.1）。
4.4.1.3供试品阳性对照溶液的制备
用已确定不干扰浓度或稀释倍数的供试品溶液将毒素标准品制成2λ浓度的毒素溶液。
4.4.1.4阴性对照液即细菌毒素检查用水。
4.4.1.5鲎试剂的准备
取规格为0.1ml/支或分装好的鲎试剂12＋2N支，其他准备按正式干扰实验项下的“鲎试剂准备”。
4.4.1.6将准备好的鲎试剂取其中10支（管）放在试管架上，排成5列，每列2支。
其中4列每列每支分别加入0.1ml的2.0λ、λ、0.5λ、0.25λ的毒素标准溶液，另一列2
支（管）加入0.1ml检查用水作为阴性对照。
将另外2N支（管）鲎试剂放在试管架上，排成N列，每列2支（管）。
每列每支分别加入0.1ml一个浓度的供试品溶液。
另2支（管）加入0.1ml供试品阳性对照溶液作为供试品的阳性对照。
4.4.1.7将试管中溶液轻轻混匀后，用封口膜封闭管口，垂直放入37℃±
4.4.2实验结果计算
如毒素标准系列最大浓度2λ均为阳性，最低浓度0.25λ均为阴性，阴性对照为阴性恭试品阳性对照为阳性时，按下式计算毒素标准溶液的反应终点浓度的几何平均值（λ
t）和供试品系列溶液反应终点浓度的几何平均值（CE）。
λt=lg-1（∑Xt/2）
CE=lg-1（∑X/2）
式中
Xt为毒素溶液的反应终点浓度的对数值（lg）。
X为供试品溶液的反应终点浓度的对数值（lg），反应终点浓度为供试品溶液每一系列平行管的终点，稀释倍数乘以标志灵敏λ。
4.4.3结果判断
当λt在0.5λ～2λ之间，试验方为有效。
供试品的毒素含量即为CE。
如果实验检验的是供试品的稀释液，则计算原始溶液毒素浓度时要将结果乘以稀释倍数。
如果试验中供试品溶液的结果都为阴性，应记为毒素浓度小于λ（如果检验的是稀释过的供试品，则记录为小于λ×
该供试品的最小稀释倍数）。
如果结果都为阳性，应记为
毒素的浓度大于或等于最大的稀释倍数乘以λ。
若毒素浓度小于规定的限值，判供试品符合规定。
若毒素浓度大于或等于规定的限值，判供试品不符合规定。
4.4.4举例
设供试品为某注射液，干扰实验已确定其最小不干扰稀释倍数为20倍，其毒素限值为10EU/ml，现使用灵敏度为0.03EU/ml的鲎试剂检测供试品中的毒素含量。
L/λ=10/0.03≈320倍
将供试品溶液先稀释至20倍后，再进行对倍稀释。
将20倍稀释液稀释2、4、8、16倍，同时制备毒素标准系列。
毒素浓度（EU/ml）0.06250.030.0150.0075
毒素标准溶液
供试品稀释倍数
1
8
16
PPC反应终点稀释倍数
供试品系列
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