细胞染色专题之一台盼蓝.docx

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细胞染色专题之一台盼蓝

细胞染色专题之一：

台盼蓝

台盼蓝（TrypanBlue，也称Directblue14）：

一种死细胞染色用色素

化学名：

3,3'-{[3,3'-Dimethyl（1,1'-biphenyl）-4,4'-diyl]bis（azo）}bis（5-amino-4-hydroxy-2,7-naphthalenedisulfonicacid）,tetrasodiumsalt3,3’-{[3,3’-二甲基-（1,1’-二苯基）-4,4’-二基]双（偶氮）}-双（5-氨基-4-羟基-2,7-萘二磺酸），四钠盐分子式：

C34H24N6Na4O14S4

分子量：

960.81

CASNumber：

72-57-1

外观：

黑褐色结晶粉末

摩尔吸光度：

>69,000（在606nm附近）

染色原理：

细胞损伤或死亡时，台盼蓝可穿透变性的细胞膜，与解体的DNA结合，使其着色。

而活细胞能阻止染料进入细胞内。

故可以鉴别死细胞与活细胞。

严格来说，台盼蓝染色检测的是细胞膜的完整性，通常认为细胞膜丧失完整性，即可认为细胞已经死亡。

这被称为染料排除测试（dyeexclusion），ErythrosinB（红色）、negrosine、eosinY、AO和EB也用于此目的。

通过显微镜很容易就能识别出死亡的被台盼蓝染色的细胞，并可使用细胞计数器进行计数。

溶于水，可以配制成10mg/ml的水溶液，水溶液呈深蓝色。

台盼蓝主要用来鉴定原代培养细胞时,细胞分离后的存活情况，用0.4%台盼蓝直接染色5-10分钟，在显微镜下观察即可。

应用于细胞凋亡：

如果细胞膜不完整、破裂，台盼蓝染料进入细胞，细胞变蓝，即为坏死。

如果细胞膜完整，细胞不为台盼蓝染色，则为正常细胞或凋亡细胞。

尽管在凋亡的早期到中期检测是很困难的，此方法对反映细胞膜的完整性，区别坏死细胞有一定的帮助。

储存条件：

常温保存

注意事项：

1.台盼蓝对人体有毒

2.台盼蓝染细胞时，时间不宜过长。

否则，部分活细胞也会着色，会干扰计数。

3.台盼蓝染色法对于悬浮细胞来说，还比较方便，对贴壁细胞来说，较为繁琐。

因为要消化，有时，96孔板不一定能消化干净。

而且，该法是测定细胞浓度的方法，与细胞悬液的体积有关，加入的胰蛋白酶或1640要计入终体积。

可以说，该法相对准确，可能有一些人为因素的干扰。

细胞染色专题之二：

美蓝

美蓝

英文名：

Methyleneblue，Swissblue

中文名：

亚甲基蓝、次甲基蓝、品蓝、美蓝、亚甲蓝、四甲基蓝、盐基湖蓝、碱性亚甲天蓝等。

分子式：

C16H18ClN3S

分子量：

319.85g/mol

CASNumber：

61-73-4

EINECSNumber：

200-515-2

熔点：

100℃

沸点：

分解

吸收峰：

668nm和609nm。

染色原理：

美蓝是一种无毒性的染料，它的氧化型呈蓝色，还原型无色。

用美蓝对酵母活细胞染色时，由于细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝由蓝色的氧化型变为无色的还原型，而对代谢作用微弱或死细胞，无此还原能力或还原能力极弱，而被美蓝染成蓝色或淡蓝色。

因此，不仅用此法可观察酵母细胞形态，也可用来鉴别酵母菌的死细胞和活细胞。

细胞染色专题之三：

吖啶橙

吖啶橙：

N,N,N',N'-tetramethylacridine-3,6-diamine

中文名：

3,6-双（二甲基氨基）吖啶

英文名：

AcridineOrange（AO），Euchrysine，3,6-Acridinediamine，WaxolineOrangeA，AcridineOrangeBase，SolventOrange15，RhodulineOrange，RhodulineOrangeN，AcridineOrangeNO，RhodulineOrangeNO，BasicOrange分子式：

C17H19N3

分子量：

265.35g/mol

CASnumber：

10127-02-3

外观：

橙色、红棕色粉末

染色原理：

吖啶橙（AO）与双链DNA形成发绿色荧光的复合物。

AO还可与单链DAN或RNA形成发红色荧光的复合物。

一个AO分子嵌入双链DNA的三个碱基对并发出最大波长为526nm（激发502nm）的绿色荧光。

一个AO分子与单链DNA或RNA的一个磷酸基相互作用形成聚集或堆叠的结构，此结构发出最大波长为650nm（激发460nm）的红色荧光。

因此，AO用于被利用来检测双链DNA和单链DNA或RNA。

它使得用氩激光激发器或流式细胞仪同时测定DNA和RNA成为可能。

光谱数据：

与DNA作用时和荧光素相似，激发最大波长502nm，发射最大525nm（绿光）。

于RNA作用时，激发最大波长移动到460nm（蓝光），发射最大移动到650nm（红光）。

染色程序：

1.用PBS或合适缓冲液制备10-50μMAO溶液。

a）

2.将1/10细胞培养基体积的AO溶液加入细胞培养基中。

b）

3.37℃下孵育细胞10-20分钟。

4.用PBS或合适缓冲液洗涤细胞2次。

5.用带有500nm激发和530nm发射滤光片的荧光显微镜观察细胞。

a）由于AO可能具有致癌性，因此操作过程中须格外小心。

b）可以用1/10浓度的AO缓冲液代替培养基。

储存条件：

避光,冷藏保存

细胞染色专题之四：

碘化丙啶

碘化丙啶

英文名：

　Propidiumiodide,Propidiumdiiodide;PI

分子式：

C27H34I2N4

分子量：

668.39

外观：

红棕色粉末

应用：

DNA染色

染色原理：

碘化丙啶（PI）是一种溴化乙啶的类似物，它在嵌入双链DNA后释放红色荧光。

尽管PI不能通过活细胞膜，但却能穿过破损的细胞膜而对核染色。

PI经常被用来与Calcein-AM或者FDA等荧光化合物一起使用，能同时对活细胞和死细胞染色。

光谱性质：

PI-DNA复合物的激发和发射波长分别为535nm和615nm。

染色过程：

1．用PBS或适当的缓冲液制备10～50μM的PI溶液。

a）

2．将1/10培养基体积的PI溶液加入到细胞培养基中。

b）

3．在37℃培养细胞10-20分钟。

4．用PBS或合适的缓冲液洗涤细胞两次。

5．用535nm激发波长，615nm发射波长的滤光器的荧光显微镜观察细胞。

a）由于PI可能具有致癌性，请小心操作。

b）也可以用1/10浓度的PI缓冲液代替培养基。

保存条件：

4℃避光保存

对人体有刺激性，请注意适当防护

细胞染色专题之五：

罗丹明123

罗丹明123：

Rhodamine123

分子式：

C21H17ClN2O3

分子量：

381

外观：

橙红色、红棕色固体/粉末

溶解性：

可溶于DMSO

CASNumber：

62669-70-9

染色原理：

Rh123是一种细胞通透性的、阳离子的荧光探针，容易被有活性的线粒体摄取，没有细胞毒性。

Rh123透过细胞膜在活细胞的线粒体内聚集，发出黄绿色荧光，可用于对许多种细胞进行染色，包括植物细胞和细菌。

由于细胞内ATP的量与Rh123的荧光强度之间有相关性，此化合物被应用于检测细胞内的ATP。

Rh123还用于癌症研究。

光谱性质：

lex\lem（MeOH）=505nm\534nm.e（505nm,MeOH）=97,000.

染色步骤：

1.将0.4mgRh123溶解到1mlDMSO中制备成1mMRh123-DMSO溶液。

2.用载玻片准备细胞。

细胞数目应为5×10e4-5×10e5个/ml。

3.孵育该载玻片，用PBS或Hank’s液洗涤细胞。

4.用培养基稀释1mMRh123溶液以制备1-20μMRh123缓冲液。

5.将Rh123缓冲液a）加入载玻片并在37℃下孵育30分钟至1小时。

6.去除Rh123缓冲液并用培养基洗涤细胞。

b）

7.用带有荧光素滤光片的荧光显微镜观察细胞。

a）加入细胞前将Rh123缓冲液放在37℃下孵育。

b）洗涤细胞后为了固定，加入10％福尔马林缓冲液并孵育15-20分钟，接着用PBS洗涤。

储存条件：

避光冷藏保存

细胞染色专题之六：

溴乙锭

溴乙锭：

Ethidiumbromide

化学名：

溴化3,8-二氨基-5-乙基-6-苯基啡啶

英文名：

2,7-Diamino-10-ethyl-6-phenylphenanthridiniumbromide，2,7-Diamino-10-ethyl-9-phenylphenanthridiniumbromide，3,8-Diamino-1-ethyl-6-phenylphenantridiniumbromide，3,8-Diamino-5-ethyl-6-phenylphenanthridiniumbromide，Homidiumbromide，EB，EtBr

别名：

胡溴胺;溴乙胺菲啶;溴乙菲啶

分子式：

C21H20BrN3

分子量：

394.31g/mol

CASnumber：

1239-45-8

熔点：

260-262℃（fromwiki）

性质：

从酒精中结晶的是具苦味的深红晶体，熔点238～240℃；20℃时溶于20份水和750份氯仿。

染色原理：

EB不能穿过活细胞的细胞膜，然而可以通过死细胞破损的细胞膜而对细胞核DNA染色。

EB含有一个可以嵌入的堆积碱基之间的一个平面基团，这个基团的固定位置及其与碱基的密切接近，导致染料与DNA结合并呈现荧光，由于EB-DNA复合物的荧光产率远大于未结合染料的荧光产率，所以当电泳凝胶中含有游离EB时，也可检测出少量DNA。

它是一种高灵敏的荧光试剂，也是一种重要的荧光染料，常用于检测DNA和RNA。

EB与DNA结合后抑制DNA的复制和转录。

光谱性质：

EB-DNA复合物的激发波长和发射波长分别为518nm和605nm。

染色过程：

1.用PBS或合适的缓冲液制备10-50μMEB溶液。

a）

2.将1/10培养基体积的EB溶液加入细胞培养基中。

b）

3.37℃下孵育细胞10-20分钟。

4.用PBS或合适的缓冲液洗涤细胞两次。

5.用带有515nm激发波长和600nm发射波长的滤光片的荧光显微镜观察细胞。

a）由于EB可能有致癌性，操作时须十分小心。

b）可以用1/10浓度的EB缓冲液代替培养基。

储存条件：

避光,冷冻保存

细胞染色专题之七：

曙红Y

曙红：

EosinY

中文名：

水溶伊红；四溴荧光黄；朝红；四溴荧光素钠；曙红钠盐；曙红,水溶性；黄光曙红

英文名：

EosineYellowish，Bromoeosine，Tetrabromofluorescein

C.I.name：

Acidred87

分子式：

C20H6O5Br4Na2

分子量：

691.9

性质：

以AgNO3滴定Br-，I-，SCN-等时用作吸附指示剂。

CASNumber:

17372-87-1

MDLnumber：

MFCD00005040

ColourIndexNumber：

45380

光谱性质：

最大吸收524.8nm；最大激发490nm

染色原理：

EosinY为酸性染料，将胞质染成粉红色（嗜酸性），是组织和细胞化学常用染色试剂之一，常与苏木精（hematoxylin，为碱性染料，将核染成紫蓝色（嗜碱性））联合使用（HE染色法）。

在免疫组织化学实验中，常作为衬染试剂以便于组织和细胞结构的观察。

存储条件：

室温避光保存

细胞染色专题之八：

苏木精

苏木精Hematoxylin

中文名：

苏木色精，苏木色素，苏木精，苏木素，洋苏木素

英文名：

He