戴安P680型高效液相色谱仪使用操作规程Word文档格式.docx
《戴安P680型高效液相色谱仪使用操作规程Word文档格式.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《戴安P680型高效液相色谱仪使用操作规程Word文档格式.docx（48页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。
6.1.3自动进样器的参数设置，每一个参数后面都有一个推荐值，一般不做改动。
6.1.4通道的选择，设定采集一个样时需要采集的时间段（AcquisitionTime），也可以不从0分钟开始采集，也就是前面一段时间不采集信号。
6.1.5紫外信号的具体设置，设定检测波长，波长带宽，参比波长，参比波长带宽。
一般设定带宽为1nm，设定参比波长为600nm，参比波长的带宽为1nm。
6.1.6设定完成后浏览程序参数，编辑、修改不适合处，最后单击工具栏中的“保存”按钮，给新建的这个程序起一个名字，若要新建一个文件夹，可点右上方的新建文件夹，然后将这个程序文件放入其中。
6.2建立方法文件
6.2.1依次点击File/New，选中“MethodFile”后，进入方法编辑向导界面。
方法文件是在进完样后采集到谱图进行处理数据时需要用到的，所以现在不需要做任何改动。
不能够等谱图出来之后再去建方法文件。
最好将它和刚才建的程序文件放在同一个文件夹里。
6.3建立新序列文件
6.3.1依次点击File/New，选中建序列文件“Sequence（usingWizard）”，后进入序列编辑向导界面。
6.3.2设定样品信息
6.3.2.1设定样品名称，如果待测样品溶液名字一样，只是序号是按顺序递加的，可以在方框的空白处输入待测样品溶液名，并通过右边的三角箭头使用“sampleNumber”，让软件自动加上一个序号。
“Numberof”为待测样品溶液的个数。
“Injectionper”为每个待测样品溶液需要进样的次数。
“Start”为第一个待测样品溶液放在自动进样器上的位置，如果所测的待测样品溶液是按顺序放在自动进样器上的，则输入第一个待测样品溶液的位置，软件会自动输入以下各个待测样品溶液的位置。
“Injection”为进样体积。
6.3.2.2设定好后，按左下方的“Apply”后，可将待测样品溶液的信息在右方以列表的方式显示出来。
6.3.3设定对照品信息
6.3.3.1同设定样品信息。
但有时候由于待测样品太多，花的时候较长，为了防止保留时间漂移，峰面积有变化，消除系统的误差等原因，需要采用间隔进样的方式进样。
“Variatiostandardsaftereachunknown”意思为每进几个标准溶液后进几个待测溶液，再进个标准溶液后进几个待测样品溶液。
6.3.3.2设定好后，按左下方的“Apply”后，可将所有样品溶液的信息在右方以列表的方式显示出来，且标准溶液在前，待测样品溶液在后。
6.4点击图标进入浏览器“Browse”界面，找到编辑好的序列。
在此界面可以对序列进行进一步的调整，增加或减少样品；
改变样品名、样品类型、进样位置、进样量、分析程序、积分方法等参数，修改后保存序列。
6.5序列进样
6.5.1如果正在采集基线，则点工具栏中蓝色小圆点，停止采集基线，将跳出如下窗口：
提示您是否保存刚才正在采集的基线谱图。
如果要保存，则在“Savetosequence”前“√”后选择一个保存路径。
通常是不保存的，则按右上方的“YES”键停止基线的采集。
6.5.2加入进样序列：
击工具栏上“Start/stopBatch”（开始/停止批进样）键，将跳出一个窗口，如果方框中有不需要做的序列（如果有，一般为上次未做完的序列），则选中后，点右边的“Remove”键，将其移走。
点右上方的“Add…”将需要进样的序列加入列表中。
点击底下右方的“ReadyCheck”，检查设置好的程序、方法、序列有没有错误或仪器有没有准备好。
如果显示有红色感叹号图标，则说明有错误。
下图显示的信息为需要占有多大电脑空间和需要用掉多少流动相，没有其它错误信息。
单击“ok”，完成检查。
6.5.3开始进样：
单击“Start”，仪器将会自动根据软件中设定的先后顺序开始进样，直至所有的样品全部进样。
若软件中相应的位置上并没有放置样品瓶，仪器将会自动识别，并跳过该样品进下一个样品。
当第一个样品进完后，将会等待第二个样品进样，这时候保留时间（RetentionTime）显示为0.00min。
7处理数据
7.1点击控制面板上的“Browser”进入需要处理数据的序列。
7.2选择定量方法点击方法文件“测试方法.qnt”。
7.2.1基本设置“Genernal”含量的单位后面输入最后的计算出来的量的单位，液相样品一般为浓度单位，固体一般要算百分含量。
7.2.2积分参数设定“Detection”“MinimumArea：
”设定最小峰面积，一般设置0.01～10之间。
低于设定值的将不会积分；
“ValleyToValleyOn：
”设置从峰谷到峰的积分；
“InhibitIntegrationOn：
”设定不积分段从什么时候开始不积分，“InhibitIntegrationOff：
”设定不积分段从什么时候结束不积分（ON和OFF是成对使用的。
）；
“FrontingsensitivityFactory：
”前沿峰灵敏度因子，一般设为2～4为宜；
“TailingsensitivityFactory：
”拖尾峰灵敏度因子，一般设为2～4为宜；
“RiderThreshold：
”肩峰值。
设定为100%，两分不开的峰垂直分开单独积分。
7.2.3峰表（PeakTable）设置：
在第一列中输入标样的名字；
在第二列在输入相对应的保留时间；
在第三列中输入一个正负范围，一般在设置值≤保留时间的5%；
第四列为定量标准，一般为外标法（External）；
第五列为定量类型，一般以面积来定量（Area）；
第六列为校正类型：
a）单点校正一般做样都是单点校正，所以选第一项：
过原点的直线（Linear），
b）线性校正如果要做线性的话，就要选第二项：
带截距的直线（LinearwithOffset）。
其它设置都不用改动。
7.2.4定量表（AmountTable）
7.2.4.1编辑列“EditAmountColumn”在表格的下方任何一位置点右键，选中“EditAmountColumn”，在“Assignstandardsonthe”后面的下拉菜单中选择“Name”，右边框中将会显示有几个标样。
点击左边方框下的自动生成列“AutoGenerate”
a）做线性的话就选择第一项（..separate..），表明要生成五个不同的列。
b）做单标定量的话选择第二项（..single..），表明生成一个列。
在“Amount”列中输入标样的浓度。
7.2.5校正（Calibration）如果有一点误差较大（偏离直线较远），不想让它参与校正。
比如说第一个点不想要，则将对应的“√”去掉，按确定即可。
7.2.6保存刚才方法的更改。
8报告输出
在“Browse”界面下，打开序列，双击需要处理的标准样品文件，点击菜单“View/Printer-Layout”，进入需要打印的界面：
类似于Excel电子表格，分好几页显示，第一页为基本谱图和数据（Integration）；
第二页为：
单标的校正曲线（Calibrationcurrentpeak），显示的有：
线性图、相关系数（Corr….）、截距（offset）、斜率（slope）、相对标准偏差（RSD）；
第三页为：
混标的校正曲线（CalibrationBatch）一般用不上；
第四页为：
峰的分析。
包括：
基线噪音（Noise）、分离度（Resol.）、对称性（Asym.）、理论塔板数（Plates）等；
第五页为：
统计表（Summary），一般都需要打印；
第七页为谱图的重叠（Overlayprint）。
选择合适的报告页面，打印输出。
9关机
9.1数据采集完毕后，在控制面板检测器设定中，关灯，然后断开仪器各部件的控制，关闭检测器。
9.2按规定用适当的溶剂冲洗色谱柱、管路、自动进样器、进样针。
确保冲洗干净后，关闭各部分电源。
9.3退出色谱工作站，关闭电脑。
10注意事项
10.1泵
10.1.1如果流动相中没有电解质（即缓冲盐或酸等），最好用50%的甲醇冲洗约20～40分钟后就直接用甲醇或乙腈冲洗流路约20～40分钟。
10.1.2如果流动相中有电解质，需要先用5%的甲醇冲洗色谱柱约60分钟后，最好用50%的甲醇冲洗约20～40分钟后，再用纯甲醇或乙腈冲洗流路约20～40分钟。
10.1.3放置了一天或以上的水相或含水相的流动相如需再用，需用微孔滤膜重新过滤。
10.1.4蠕动泵清洗瓶中的5%的甲醇要求每周至少换二次。
若液相使用频率不高，建议每天使用前更换，以免水长细菌损坏泵中各组件。
10.1.5为了保证P680的安全运行，必须设定高、低压极限（一般安装时已设置好）；
10.1.6流动相禁止使用氯仿、三氯（代）苯、亚甲基氯、四氢呋喃、甲苯等；
慎重使用四氯化碳、乙醚、异丙醚、酮、甲基环己胺等，以免造成对柱塞密封圈的腐蚀。
若需要使用正相系统分析样品，需要另行安装耐腐蚀的正相密封圈。
10.1.7拧松快速清洗阀时，不宜拧得过松。
一般拧松2圈左右即可。
拧得过松流动相容易从清洗阀部位流进泵头中引起报警。
10.1.8使用快速清洗阀时，只能一个一个通道的排气泡，不得将几个通道同时按比例排气泡，比例阀的快速切换易导致损坏。
10.1.9没有配制脱气机的，流动相一定要超声脱气。
有脱气机的，泵电源开启后，等脱气机停止工作后再进行泵的其它操作。
10.2自动进样器
10.2.1自动进样器建议用50%的甲醇洗针。
10.2.2每天使用自动进样器进样前都要按一下控制面板上的“wash”键，仪器会自动排除定量环和针中的残留气泡。
10.2.3每天洗针前要检查一下洗针瓶中是否有洗液（50%甲醇）。
10.3检测器
10.3.1检测器的紫外或可见灯在长期打开的情况下，一定要保证有溶液流经检测池。
若不需要做样，可设置一个较低的流速（如0.05ml/min）或关闭灯的电源。
10.3.2检测器的灯一般是在流通池有溶液连续流动几分钟后才开的。
如果流动池中有气泡，则会提示漂移过大无法通过自检和校正。
10.3.3检测器的氘灯或钨灯不要经常开关，每开关一次灯的寿命约损失30小时。
若仪器经常使用，可几天开关灯一次。
10.4整个系统
10.4.1缓冲溶液与有机溶剂互相转换前一定要用5%甲醇清洗泵，防止盐在有机相中结晶损坏泵中各组件。
10.4.2缓冲溶液的浓度不能高于0.5mol/L，pH范围2～12，Cl-的浓度要小于0.1mol/L（防止腐蚀流路）。
10.4.3仪器长时间不用，每个泵通道和整个流路一定要用甲醇冲洗后保存，以免结晶或造成污染。
10.4.4待测样品或标样在流动相中一定要易溶，否则进样后会结晶造成定量不准确或堵塞色谱柱。
10.5软件
10.5.1不要轻易地在windows窗口下删除软件所在根目录或子目录下的文件，以免造成软件无法正常使用。
10.5.2仪器不使用时，密码钥匙不要经常拆来拆去，容易导致密码钥匙损坏。
10.5.3采集紫外信号时，若分析物质的最大波长已知，则尽量减少采集的通道个数，以免占用电脑的空间。
10.5.4软件系统的配置（ServerConfiguration）在软件安装完成后，不要改动。
戴安P680型高效液相色谱仪（含自动进样器）使用操作规程2
1仪器组成及开机
1.1仪器组成本仪器由p680型输液泵、在线脱气机、手动进样器、tcc-100柱温箱、pda-100二极管阵列检测器、chromeleon色谱工作站和计算机、打印机组成。
1.2开机使用时，依次接通输液泵、柱温箱电源，待各部分自检完毕再接通打印机和计算机的电源，待开启输液泵平衡系统30分钟后再接通检测器电源。
2summit液相色谱系统
2.1流动相管理在p680型输液泵操作面板上选择〔state〕，进入流动相管理界面，设定流速、流动相a、b、c、d的比例及压力上下限。
另外清洗系统的溶剂瓶中溶液（50％甲醇）每周必须更换一次。
流动相需经0.45µ
m滤膜过滤，并用超声脱气15min。
2.2设定柱温在柱温箱的操作面板上长按〔+〕〔-〕直到显示温度为所需温度。
3chromeleon色谱工作站
3.1启动工作站程序单击桌面上的servermonitor图标，点击start，待变色龙图标变成灰色，关闭servermonitor。
单击桌面上的chromeleon，启动色谱工作站，双击hplc.pan，进入仪器控制面板。
3.2平衡系统单击菜单栏acquistitionon/off图标，选择数据通道和采集参数，采集基线，待基线平衡后，即可停止采集并可开始分析样品。
3.3建立进样序列单击菜单file/new/sequence（usingwizard），依次设置样品及对照品信息（样品名称、样品数、进样针数、进样量）；
采用的程序；
积分方法；
报告模板以及优先数据通道等；
最后对序列命名，保存。
3.4修改程序单击工具栏browser图标，找到编辑好的序列，按需要修改序列样品信息。
双击该序列的程序文件，修改柱温（使用温度，温度上下限）；
泵（流动相梯度、流动相比例、流速等）；
检测器（检测波长、检测波长带宽、参比波长、参比波长带宽等）；
运行时间，最后单击commands检查程序有无错漏。
3.5运行序列将手动进样器搬动到load位置，单击工具栏start/stopbatch图标，运行编辑好的序列，吸取适当样品溶液（先用0.45µ
m滤膜过滤），搬动进样器手柄于inject位置，进样，开始采集。
3.6定量分析在样品序列表中输入相应的取样量和稀释因子，单击任何采集完毕的样品，单击工具栏上的qnt-editor图标，设定最小峰面积和积分时间，主峰名称，主峰保留时间，对照品浓度等，保存。
3.7报告输出单击任意采集完毕的样品，单击工具栏上的printerlayout图标，进入报告编辑界面，按需要适当修改报告格式，并打印输出。
4关机
4.1使用完毕后，在控制面板设定中，关灯，断开检测器连接，待检测器适当冷却后再关闭检测器电源。
4.2按规定用适当的溶剂冲洗色谱柱、手动进样器、进样针等。
4.3处理数据并打印报告后，退出色谱工作站，关闭电脑、打印机电源。
4.4登记仪器使用记录和操作记录。
戴安高效液相泵P680的维护保养：
1、如果流动相中没有电解质（即缓冲盐或酸等），最好用50%的甲醇冲洗约20～40分钟后就直接用甲醇或乙腈冲洗流路约20～40分钟。
2、如果流动相中有电解质，需要先用5%的甲醇冲洗色谱柱约60分钟后，最好用50%的甲醇冲洗约20～40分钟后，再用纯甲醇或乙腈冲洗流路约20～40分钟。
3、放置了一天或以上的水相或含水相的流动相如需再用，需用微孔滤膜重新过滤。
10.1.4蠕动泵清洗瓶中的5%的甲醇要求每周至少换二次。
5、为了保证P680的安全运行，必须设定高、低压极限（一般安装时已设置好）；
6、流动相禁止使用氯仿、三氯（代）苯、亚甲基氯、四氢呋喃、甲苯等；
7、拧松快速清洗阀时，不宜拧得过松。
8、使用快速清洗阀时，只能一个一个通道的排气泡，不得将几个通道同时按比例排气泡，比例阀的快速切换易导致损坏。
9、没有配制脱气机的，流动相一定要超声脱气。
高效液相色谱
我国药典收载高效液相色谱法项目和数量比较表：
方法
项目
数量
1985年版
1990年版
1995年版
2000年版
HPLC法
鉴别
9
34
150
检查
12
40
160
含量测定
7
60
117
387
鉴于HPLC应用在药品分析中越来越多，因此每一个药品分析人员应该掌握并应用HPLC。
I．概论2
一、液相色谱理论发展简况2
二、HPLC的特点和优点2
三、色谱法分类3
四、色谱分离原理3
II．基本概念和理论5
一、基本概念和术语5
二、塔板理论8
三、速率理论（又称随机模型理论）9
III．HPLC系统10
一、输液泵11
二、进样器13
三、色谱柱14
四、检测器17
五、数据处理和计算机控制系统20
六、恒温装置20
IV．固定相和流动相20
一、基质（担体）20
二、化学键合固定相22
三、流动相23
1．流动相的性质要求23
2．流动相的选择24
3．流动相的pH值24
4．流动相的脱气25
5．流动相的滤过25
6．流动相的贮存26
7．卤代有机溶剂应特别注意的问题26
8．HPLC用水26
V．HPLC应用27
一、样品测定27
二、方法研究27
附件：
高效液相色谱法（HPLC）复核细则28
一、对起草单位的要求：
28
二、对复核单位的要求：
I．概论
一、液相色谱理论发展简况
色谱法的分离原理是：
溶于流动相（mobilephase）中的各组分经过固定相时，由于与固定相（stationaryphase）发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。
又称为色层法、层析法。
色谱法最早是由俄国植物学家茨维特（Tswett）在1906年研究用碳酸钙分离植物色素时发现的，色谱法（Chromatography）因之得名。
后来在此基础上发展出纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法。
液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下用液位差输送流动相，称为经典液相色谱法，此方法柱效低、时间长（常有几个小时）。
高效液相色谱法（HighperformanceLiquidChromatography，HPLC）是在经典液相色谱法的基础上，于60年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。
它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需用高压输送流动相，故又称高压液相色谱法（HighPressureLiquidChromatography，HPLC）。
又因分析速度快而称为高速液相色谱法（HighSpeedLiquidChromatography，HSLP）。
也称现代液相色谱。
二、HPLC的特点和优点
HPLC有以下特点：
高压——压力可达150~300Kg/cm2。
色谱柱每米降压为75Kg/cm2以上。
高速——流速为0.1~10.0ml/min。
高效——可达5000塔板每米。
在一根柱中同时分离成份可达100种。
高灵敏度——紫外检测器灵敏度可达0.01ng。
同时消耗样品少。
HPLC与经典液相色谱相比有以下优点：
速度快——通常分析一个样品在15~30min，有些样品甚至在5min内即可完成。
分辨率高——可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果。
灵敏度高——紫外检测器可达0.01ng，荧光和电化学检测器可达0.1pg。
柱子可反复使用——用一根色谱柱可分离不同的化合物。
样品量少，容易回收——样品经过色谱柱后不被破坏，可以收集单一组分或做制备。
三、色谱法分类
按两相的物理状态可分为：
气相色谱法（GC）和液相色谱法（LC）。
气相色谱法适用于分离挥发性化合物。
GC根据固定相不同又可分为气固色谱法（GSC）和气液色谱法（GLC），其中以GLC应用最广。
液相色谱法适用于分离低挥发性或非挥发性、热稳定性差的物质。
LC同样可分为液固色谱法（LSC）和液液色谱法（LLC）。
此外还有超临界流体色谱法（SFC），它以超临界流体（界于气体和液体之间的一种物相）为流动相（常用CO2），因其扩散系数大，能很快达到平衡，故分析时间短，特别适用于手性化合物的拆分。
按原理分为吸附色谱法（AC）、分配色谱法（DC）、离子交换色谱法（IEC）、排阻色谱法（EC，又称分子筛、凝胶过滤（GFC）、凝胶渗透色谱法（GPC）和亲和色谱法。
（此外还有电泳。
按操作形式可分为纸色谱法（PC）、薄层色谱法（TLC）、柱色谱法。
四、色谱分离原理
高效液相色谱法按分离机制的不同分为液固吸附色谱法、液液分配色谱法（正相与反相）、离子交换色谱法、离子对色谱法及分子排阻色谱法。
1．液固色谱法 使用固体吸附剂，被分离组分在色谱柱上分离原理是根据固定相对组分吸附力大小不同而分离。
分离过程是一个吸附－解吸附
升级会员 