分子生物学技术综合实验讲义Word下载.docx

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1．小型高速离心机

2．恒温摇床

3．恒温箱

4．-20℃冰箱

5．恒温水浴器

（二）材料

1．卡那霉素或氨苄霉素

2．大肠杆菌DH5

3．质粒DNA（Kan抗性）

4．1.5l离心管

5．移液枪、枪头

6．试管、培养皿

（三）试剂

1．LB培养液

在950ml去离子水中加入：

胰蛋白胨（tryptone）

10g

酵母提取物（yeastextract）

NaCl

摇动容器直至溶质完全溶解，用Na0H调节pH至7.0，加入去离子水至总体积为1L，121℃湿热灭菌20min。

2．卡那霉素（Kan），用无菌水配制成100mg／ml溶液，置-20℃冰箱保存。

3．CaCl2溶液

100mMCaCl2

4．CaCl2-甘油溶液：

20～25％甘油

[实验步骤]

感受态制备：

1．挑取E.ColiDH5单菌落接种于5ml液体LB培养基中，37℃培养过夜。

2．取500l菌液加到50mlLB液体培养基中，37℃振荡培养2～3h，至O.D.为0.3-0.5，冰浴30min。

3．4,000×

g，4℃离心3min，收集菌体。

4．用预冷的10mlCaCl2溶液悬浮菌体，冰浴20～30min。

5．4,000×

g4℃离心3min收集菌体，用预冷的2mlCaCl2-甘油溶液重悬。

6．置于冰浴中备用（12～24h内转化效率最高），以每管200μl

7．分装于1.5ml离心管中，液氮速冻后，-70℃保存备用。

转化

1．新鲜制备的或-20℃下保存的200l感受态细胞，置于冰上，完全解冰后轻轻地将细胞均匀悬浮。

2．加入1L质粒DNA，轻轻混匀。

3．冰上放置30分钟。

4．42℃水浴热激60秒。

5．冰上放置2分钟。

6．加800lLB培养液，37℃250rpm/分振荡培养30分钟。

7．室温下4000rpm离心5分钟，用枪头吸掉800l上清液。

8．重悬后，吸取50l细菌液涂布在Kan/LB琼脂平板上。

9．平皿在37℃下正向放置1小时，待接种的液体吸收进琼脂后，将平皿倒置，培养过夜。

10．对照的制作：

在上述步骤中不加入质粒DNA，其它步骤操作相同。

[实验结果]

经37℃培养过夜的、在卡那霉素/LB琼脂平板上出现的菌落即为质粒DNA转化的大肠杆菌。

计数菌落总数，计算制备的感受态菌的转化效率，以每g质粒DNA转化的菌落数表示。

实验二质粒DNA的提取

[实验原理]

碱裂解法提取质粒利用的是共价闭合环状质粒DNA与线状的染色体DNA片段在拓扑学上的差异来分离它们。

在pH值介于12.0-12.5这个狭窄的范围内，线状的DNA双螺旋结构解开变性，在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键虽然断裂，但两条互补链彼此依然相互盘绕而紧密地结合在一起。

当加入pH4.8的醋酸钾高盐缓冲液使pH降低后，共价闭合环状的质粒DNA两条互补链迅速而准确地复性，而线状的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，不能迅速而准确地复性，它们缠绕形成网状结构。

通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来，而质粒DNA却留在上清液中。

1．恒温培养箱

3．小型高速离心机

4．高压灭菌锅

1．转化有质粒DNA的大肠杆菌

2．1.5l离心管

3．移液枪、枪头

SolutionI

50mM葡萄糖

25mM三羟甲基氨基甲烷（Tris）Tris·

HCl（pH8.0）

10mM乙二胺四乙酸（EDTA）（pH8.0）

SolutionII

0.4M／LNa0H，2％SDS（十二烷基硫酸钠），用前等体积混合

SolutionIII（钾离子浓度3M，乙酸根离子浓度5M）

5M乙酸钾60ml

冰乙酸11.5ml

水28.5ml

pH4.8

TE缓冲液（pH8.0）

10mMTris·

HCl

1mMEDTA

RNaseA

将RNaseA酶溶于TE缓冲液中，配成10mg／ml的浓度，于100℃加热15min灭活DNA酶活性，缓慢冷却至室温，保存于-20℃。

1．挑单菌于带有适当抗生素的LB液体培养基中，摇菌过夜，至OD值0.6~0.8

2．取1~1.5ml（具体体积视菌体的浓度和质粒的拷贝数而定）菌液于1.5mlependorf管中，12,000g，离心30s，弃尽上清，收集菌丝体

3．加入溶液Ⅰ200l，漩涡振荡器振荡，重悬菌丝体

4．加入溶液Ⅱ200l，轻轻颠倒ependorf管4~5次，使溶液充分混匀，此时可以观察溶液重新变得清亮，置于冰上

5．加入溶液Ⅲ200l，轻轻颠倒ependorf管4~5次，使溶液充分混匀，此时可以观察溶液产生絮状沉淀，置于冰上15min

6．12,000g，4℃,离心15min

7．吸取上清，加入0.6倍体积的异丙醇，轻轻颠倒振荡，充分混匀

8．12,000g，室温，离心15min

9．弃尽上清，加入70%的乙醇洗涤沉淀一次

10．超净工作台吹干沉淀，加入适量（15~20l）TE缓冲液或无菌水,溶解沉淀

11．取适量溶解液（3~5l），0.8或1%的琼脂糖凝胶电泳检测质粒DNA

实验三DNA琼脂糖凝胶电泳

DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。

由于糖—磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量碱基的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。

在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子本身的大小和构型，具有不同分子量的DNA片段迁移速度不一样，迁移速度与DNA分子量的对数值成反比关系。

凝胶电泳不仅可分离不同分子量的DNA，也可以分离分子量相同、但构型不同的DNA分子。

一般提取的质粒有3种构型：

超螺旋的共价闭合环状DNA（covalentlyclosedcircularDNA，简称cccDNA），开环DNA，即共价闭合环状质粒DNA有一条链断裂，（opencircularDNA，简称ocDNA），线状质粒DNA，即质粒DNA在同一处两条链都发生断裂（linearDNA，简称LDNA）。

由于这3种构型的质粒DNA分子在凝胶电泳中的迁移率不同，因此通常抽提的质粒在电泳后往往出现3条带，其中超螺旋质粒DNA泳动最快，其次为线状DNA，最慢的为开环质粒DNA。

（一）仪器：

1．琼脂糖凝胶电泳系统；

2．小型高速离心机；

3．高压灭菌锅；

4．紫外核酸检测仪

（二）材料质粒DNA

1．50×

TAE（50倍体积的TAE贮存液）1000ml

50×

TAE

1×

Tris

242g

40mMTris-冰醋酸

冰醋酸

57.1ml

1mMEDTA

0.5MEDTA

100ml

pH8.0

2．凝胶样品缓冲液（6×

）：

0.25％溴酚蓝-40％蔗糖

3．琼脂糖

4．溴化乙锭母液（EB）10mg/ml

5．DNA分子量标准

（一）制备琼脂糖凝胶

根据被分离DNA的大小，决定凝胶中琼脂糖的百分含量（可参照下表）

不同浓度琼脂糖凝胶的DNA有效分离范围

琼脂糖凝胶浓度％

线性DNA的有效分离范围（kb）

0.3

5.0—60

0.6

1.0—20

0.7

0.8—10

0.9

0.5—7.0

1.2

0.4—6.0

1.5

0.2—3.0

2.0

0.1—2.0

实验用1.0％琼脂糖。

称取1.0g琼脂糖，放入锥形瓶中，加入100ml1×

TAE缓冲液，置微波炉或水浴加热至完全溶化，取出摇匀即可。

（二）胶板的制备

1．取干净的有机玻璃内槽，用透明胶带将有机玻璃内槽的两端边缘封好（一定封严，不能留缝隙）。

2．将有机玻璃内槽放置于一水平位置，并放好样品梳子。

3．将冷到60℃左右的琼脂糖凝胶液，缓缓倒入有机玻璃内槽，加入溴乙锭至终浓度为0.5μg/ml（100ml凝胶液加入0.5μl）。

直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶面（注意不要形成气泡）。

4．待胶凝固后，小心地拔出梳子，撕下透明胶带，然后将有机玻璃内槽放在电泳槽内。

注意：

DNA样品孔应朝向负电极一端。

5．加电泳缓冲液至电泳槽中，加液量要使液面没过胶面1-1.5cm。

（三）加样

1．DNA样品与样品缓冲液按1:

5比例混匀。

2．用移液枪将已加入上样缓冲液的DNA样品加入加样孔（记录点样顺序及点样量）。

（四）电泳

1．接通电泳槽与电泳仪的电源。

DNA的迁移速度与电场强度成正比，一般电场强度不要超过5V/cm。

（50-100V）

2．当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1-2cm处，停止电泳。

（五）染色（第二步没有加溴化乙锭的染色方法）

将电泳后的凝胶浸入溴化乙锭染色液（在200ml1×

TAE缓冲液中加两滴2mg/l的溴化乙锭储存液即可），在脱色摇床上缓慢摇动下染色20-30分钟。

溴化乙锭为致癌物，须戴一次性塑料薄膜手套操作，并小心污染环境。

在紫外灯（360nm或254nm）下观察染色后的电泳凝胶。

DNA存在处应显出桔红色荧光条带（在紫外灯下观察时应戴上防护眼镜，以防紫外线对眼睛的伤害作用）。

根据需要进行拍照，保存实验结果。

实验四、SDS法提取植物总DNA

植物DNA的提取过程中，首先必须破碎细胞壁释放出细胞内容物，然而许多操作在破壁的同时会造成DNA的断裂。

将新鲜植物组织在干冰或液氮中快速冷冻后，用研钵研成粉末后，再加入提取缓冲液，能够地防止DNA的断裂。

也可将植物组织胀水，然后研磨成细粉。

其次，提取DNA的缓冲液当，必须采用含有SDS和CTAB等去污剂，使细胞内源的核酸酶变性，防止同时释放出来DNA降解。

在提取过程中，注意防止剧烈振荡或枪头的快速抽吸，防止DNA的断裂。

[仪器、材料和试剂]

1．离心机

2．水浴锅（37℃，65℃）

3．研钵

4．50ml、2ml、1.5ml　离子管

（二）试剂

1．液氮

2．DNA提取缓冲液

50mMTris-HClpH7.6

100mMNaCl

50mMEDTA

0.5%SDS

10mMβ-巯基乙醇

3．氯仿/异戊醇（24:

1）

4．RNaseA

5．异丙醇

6．70%乙醇

7．TE缓冲液：

10mMTris-HCl,1mMEDTA,pH8.0

（三）材料

植物新鲜叶片组织

SDS法少量提取植物总DNA：

1．植物材料（根、茎、叶片等）0.4~0.6g，加液氮研成粉末后，加入DNA提取Buffer1.5~1.6ml，抽取15min，可以适当加热（60~65℃温育）。

2．分装于两个ependorf管中，每管各抽取液0.7~0.8ml，加入0.5（0.4ml）倍苯酚（Tris饱和酚），轻轻混匀，抽取5~10min，9,000g，离心10min

3．吸取上清，加入0.5（0.4ml）倍氯仿，轻轻混匀，抽取10~15min，12,000g，离心8min

4．收集上清，加入等体积异丙醇（总体积约为1.5ml），混匀，此时可见，白色絮状DNA沉淀，12,000g，室温下离心15min，吸去上清

5．70%乙醇洗涤沉淀一次

6．于37℃烘箱烘干沉淀

7．沉淀溶于适量TE，加入RNase使终浓度为50μg/ml，37℃消化30~60min

8．等体积苯酚-氯仿，氯仿各抽取一次

9．上清加入1/10倍体积的3MNaAc（pH5.2）和2~2.5倍体积预冷无水乙醇，混匀后，于-20℃放置30min，4℃,12,000g,离心15min,弃去上清

10．70%乙醇洗涤沉淀一次，干燥后溶于适量TE或水中

11．0.7~0.8%琼脂糖凝胶上检测植物总DNA；

剩余DNA样品保存于-20℃备用。

SDS法大量提取植物组织总DNA

1．植物材料（根、茎、叶片等）1~2g，加入DNA提取Buffer8ml，抽取15min，可以适当加热（60~65℃温育）。

2．加入0.5倍苯酚（Tris饱和酚），轻轻混匀，抽取5~10min，9,000g，离心10min

3．吸取上清，加入0.5倍氯仿，轻轻混匀，抽取10~15min，12,000g，离心8min

4．吸取上清，加入等体积异丙醇，混匀，此时可见，白色絮状DNA沉淀，用枪尖小心挑出DNA沉淀，放入ependorf管中；

12,000g，室温下离心5min，吸去上清

9．上清加入1/10倍体积的3MNaAc（pH5.2）和2~2.5倍体积预冷无水乙醇，混匀后，于-20℃放置30min，4℃，12,000g，离心15min，弃去上清

10．70%乙醇洗涤沉淀一次，干燥后溶于适量TE或水中

11．0.7~0.8%琼脂糖凝胶上检测植物总DNA；

[注意事项]

如果提取产物出现黄色现象，可能是植物组织含有褐色多酚类化合物，可以在提取缓冲液加入2%聚乙烯吡咯烷酮（PVP，相对分子量10000），以有助于除去多酚类杂质。

实验四蛋白质的诱导表达及SDS-PAGE电泳鉴定

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）是蛋白分析中最经常使用的一种方法。

它是将蛋白样品同离子型去垢剂十二烷基硫酸钠（SDS）以及巯基乙醇一起加热，使蛋白变性，多肽链内部的和肽链之间的二硫键被还原，肽链被打开。

打开的肽链靠疏水作用与SDS结合而带负电荷，电泳时在电场作用下，肽链在凝胶中向正极迁移。

不同的大小的肽链由于在迁移时受到的阻力不同，在迁移过程中逐渐分开，其相对迁移率与分子量的对数间成线形关系。

pET-SOD是将人Cu/Zn-SOD的基因克隆在pET30a（+）上的一种原核表达载体。

携带有pET-SOD的大肠杆菌在卡那霉素和IPTG诱导，可以表达人Cu/Zn-SOD蛋白，比不加IPTG同样的大肠杆菌在SDS-PAGE凝胶上要多出一条明显的条带。

1．垂直板电泳槽及配套的玻璃板，梳子

2．电泳仪

3．干式恒温培养器

4．微波炉

转化有pET-SOD的大肠杆菌。

1.30%丙烯酰胺溶液：

丙烯酰胺29.2g，甲叉双丙烯酰胺0.8g，加水至100ml，过滤，棕色瓶4℃保存。

2.分离胶缓冲液pH8.8（4×

1.5MTris-HCl，取18.15gTris，用1MHCl调pH至8.8，加水至100ml，4℃保存。

3.浓缩胶缓冲液pH6.8（4×

0.5MTris-HCl，：

取5.98gTris，用1MHCl调至pH6.8，加水至100ml，4℃保存。

4.电极缓冲液（pH8.3,5×

取94g甘氨酸，15.1gTris，加50ml10%SDS，加水至1L，4℃保存，使用时稀释5倍使用。

（1×

电极缓冲液为：

25mMTris-HCl、250mM甘氨酸、0.1%SDS）

5.10%SDS：

取10gSDS，加水至100ml，完全溶解后室温保存。

6.10%过硫酸铵溶液（AP）：

临用前现配（-20℃可存放1个半月）

7.TEMED（四甲基乙二胺）

8.染色液（0.25%考马斯亮蓝R-250、50%乙醇、7%乙酸）：

考马斯亮蓝R-2502.5g、乙醇500ml、70ml冰乙酸，溶解后用蒸馏水定容至1000ml。

9.脱色液（30%乙醇、7%乙酸）：

乙醇300ml，冰乙酸70ml，蒸馏水定容至1000ml。

10.2×

样品缓冲液

组份（20ml）

原液

加入量

100mMTris-HClpH6.8

0.5MTris-HClpH6.8

4ml

20％甘油

甘油

4％SDS

20％SDS

0.2％溴酚蓝

溴酚蓝

40mg

10mM-巯基乙醇

-巯基乙醇

0.2ml

H2O

8ml

[实验步骤]

1．蛋白质的诱导表达

将重组载体pET-SOD转入大肠杆菌BL21（DE3），挑单菌，接种于含有50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养过夜，取过夜培养物按1/50的比例扩大培养至OD600为0.5~0.6，吸取1ml培养物，收集菌体备用；

加入IPTG至终浓度为0.25mmol/L，37℃继续摇菌4h，收集菌体，进行SDS-PAGE凝胶电泳检测融合蛋白表达情况。

2．蛋白质的SDS-PAGE凝胶电泳

（1）装配好灌胶用的玻璃板“三明治”，注意检查，勿使玻璃板“三明治”的夹缝是否漏水。

（2）配制浓度为12％的分离胶（凝胶浓度应根据被分离蛋白的分子量进行选择），不同分离胶配方参见如下表：

组分

分离胶

7.5%

10%

12%

15%

分离胶缓冲液

（pH8.8）（μl）

2500

1250

H2O（μl）

4900

2450

4100

2050

3300

1650

2400

1200

Acr/Bis（μl）

4000

2000

5000

10%SDS（μl）

100

10%AP（μl）

TEMED（μl）

总体积（ml）

混匀后加入两玻璃夹缝中，并小心在胶面上加入1cm蒸馏水（在胶面上加蒸馏水称水封，目的是保持胶面平整，并防止胶与空气接触，影响胶的聚合），室温放置，等胶自然凝聚后（此时在胶面与水封之间可见清晰的界限），将水封倾去。

（4）配制4％的浓缩胶，不同浓缩胶配方参见如下表：

浓缩胶（pH8.8）

浓缩胶缓冲液（μl）

625

3200

1600

3050

1500

2700

1350

500

250

650

375

1000

2.5

混匀后加入到"

三明治"

玻璃板的夹缝中，然后在把1mm的梳子插进浓缩胶中，注意在梳子和浓缩胶之间不要留有气泡。

如果发现有较大的气泡，一定要想法去掉（可以插拔梳子或指弹气泡处的玻璃等），否则会影响电泳结果。

待浓缩胶凝固后，小心拔出梳子。

如果发现拔出梳子后形成的加样孔之间的间隔发生扭曲，用注射器的针头小心加以整理，使之齐整。

（5）细菌培养物SDS-PAGE样品的制作：

取细菌培养物0.3ml加到1.5ml小离心管中，12000r/m离心30s去上清。

在离心沉淀中加0.3ml蒸馏水，用枪头小心地吹打，使细菌充分悬浮，直到没有明显的小团块，然后加入等体积的2×

样品缓冲液，在100℃沸水浴（或干式培养器）中保温5min。

此时如用枪头吸取样品，会发现非常粘稠，呈鼻涕状，这是因为有样品中含有大量DNA的结果。

要用胰岛素注射器将样品从极细的针头中打出，反复多次才能将DNA分子打断，使样品变得不再粘稠为止。

将样品14000r/m离心5min，使不溶物沉淀下来，小心吸取上清加样。

电

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