分子生物学技术综合实验讲义Word下载.docx

1、1小型高速离心机2恒温摇床3恒温箱4-20冰箱5恒温水浴器（二） 材料1卡那霉素或氨苄霉素2大肠杆菌DH53质粒DNA （Kan抗性）41.5l 离心管5移液枪、枪头6试管、培养皿（三） 试剂1 LB培养液在950 ml去离子水中加入：胰蛋白胨 （tryptone）10 g酵母提取物 （yeast extract）5 gNaCl摇动容器直至溶质完全溶解，用Na0H调节pH至7.0，加入去离子水至总体积为1 L，121湿热灭菌20 min。2 卡那霉素 （Kan），用无菌水配制成100 mgml 溶液，置-20冰箱保存。3 CaCl2溶液100 mM CaCl24 CaCl2-甘油溶液：2025

2、甘油实验步骤感受态制备：1 挑取E.Coli DH5 单菌落接种于5 ml液体LB培养基中，37培养过夜。2 取500 l菌液加到50 ml LB液体培养基中，37振荡培养23 h，至O.D.为0.3-0.5，冰浴30 min。3 4, 000 g，4离心3 min，收集菌体。4 用预冷的10 ml CaCl2溶液悬浮菌体，冰浴2030 min。5 4, 000 g 4离心3 min收集菌体，用预冷的2 ml CaCl2-甘油溶液重悬。6 置于冰浴中备用（1224 h内转化效率最高），以每管200 l7 分装于1.5 ml离心管中，液氮速冻后，-70保存备用。转化1 新鲜制备的或-20下保存的

3、200 l感受态细胞，置于冰上，完全解冰后轻轻地将细胞均匀悬浮。2 加入1 L质粒DNA，轻轻混匀。3 冰上放置30分钟。4 42水浴热激60秒。5 冰上放置2分钟。6 加800 l LB培养液，37 250 rpm/分振荡培养30分钟。7 室温下4 000 rpm离心5分钟，用枪头吸掉800 l上清液。8 重悬后，吸取50 l细菌液涂布在 Kan/LB琼脂平板上。9 平皿在37下正向放置1小时，待接种的液体吸收进琼脂后，将平皿倒置，培养过夜。10 对照的制作：在上述步骤中不加入质粒DNA，其它步骤操作相同。实验结果经37培养过夜的、在卡那霉素/LB琼脂平板上出现的菌落即为质粒DNA转化的大肠

4、杆菌。计数菌落总数，计算制备的感受态菌的转化效率，以每 g 质粒DNA 转化的菌落数表示。实验二 质粒DNA的提取实验原理碱裂解法提取质粒利用的是共价闭合环状质粒DNA与线状的染色体DNA片段在拓扑学上的差异来分离它们。在pH值介于12.0-12.5这个狭窄的范围内，线状的DNA双螺旋结构解开变性，在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键虽然断裂，但两条互补链彼此依然相互盘绕而紧密地结合在一起。当加入pH 4.8的醋酸钾高盐缓冲液使pH降低后，共价闭合环状的质粒DNA两条互补链迅速而准确地复性，而线状的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，不能迅速而准确地复性，它们缠绕形成网状结构。通过离心

5、，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来，而质粒DNA却留在上清液中。1恒温培养箱3小型高速离心机4高压灭菌锅1转化有质粒DNA的大肠杆菌21.5 l 离心管3移液枪、枪头Solution I50 mM 葡萄糖25 mM 三羟甲基氨基甲烷 （Tris） Tris HCl （pH8.0）10 mM 乙二胺四乙酸 （EDTA） （pH8.0）Solution II0.4 ML Na0H，2 SDS （十二烷基硫酸钠），用前等体积混合Solution III （钾离子浓度3 M，乙酸根离子浓度 5 M） 5 M 乙酸钾 60 ml冰乙酸 11.5 ml水 28.5 m

6、lpH 4.8TE缓冲液 （pH8.0）10 mM TrisHCl1 mM EDTA RNase A将RNase A酶溶于TE缓冲液中，配成10 mgml的浓度，于100加热15 min灭活DNA酶活性，缓慢冷却至室温，保存于-20。1 挑单菌于带有适当抗生素的LB液体培养基中，摇菌过夜，至OD值0.60.82 取11.5 ml （具体体积视菌体的浓度和质粒的拷贝数而定） 菌液于1.5 ml ependorf管中，12, 000 g，离心30 s，弃尽上清，收集菌丝体3 加入溶液 200 l，漩涡振荡器振荡，重悬菌丝体4 加入溶液 200 l，轻轻颠倒ependorf管45次，使溶液充分混匀，

7、此时可以观察溶液重新变得清亮，置于冰上5 加入溶液 200 l，轻轻颠倒ependorf管45次，使溶液充分混匀，此时可以观察溶液产生絮状沉淀，置于冰上15 min6 12, 000 g，4,离心15min7 吸取上清，加入0.6倍体积的异丙醇，轻轻颠倒振荡，充分混匀8 12, 000 g，室温，离心15 min9 弃尽上清，加入70%的乙醇洗涤沉淀一次10 超净工作台吹干沉淀，加入适量（1520 l）TE缓冲液或无菌水,溶解沉淀11 取适量溶解液（35 l），0.8或1%的琼脂糖凝胶电泳检测质粒DNA实验三 DNA琼脂糖凝胶电泳DNA分子在高于等电点的pH 溶液中带负电荷，在电场中向正极移动

8、。由于糖磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量碱基的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子本身的大小和构型，具有不同分子量的DNA片段迁移速度不一样， 迁移速度与DNA分子量的对数值成反比关系。凝胶电泳不仅可分离不同分子量的DNA，也可以分离分子量相同、但构型不同的DNA分子。一般提取的质粒有3种构型：超螺旋的共价闭合环状DNA （covalently closed circular DNA，简称cccDNA），开环DNA，即共价闭合环状质粒DNA有一条链断裂，（open circular DNA，简称ocDNA）

9、，线状质粒DNA， 即质粒DNA 在同一处两条链都发生断裂（linear DNA，简称LDNA）。由于这3种构型的质粒DNA分子在凝胶电泳中的迁移率不同，因此通常抽提的质粒在电泳后往往出现3条带，其中超螺旋质粒DNA泳动最快，其次为线状DNA，最慢的为开环质粒DNA。（一） 仪器：1琼脂糖凝胶电泳系统；2小型高速离心机；3高压灭菌锅；4紫外核酸检测仪（二） 材料 质粒DNA150TAE （50倍体积的TAE贮存液） 1000 ml50TAE1Tris242 g40 mMTris-冰醋酸冰醋酸57.1 ml1 mM EDTA0.5 M EDTA100 mlpH 8.02凝胶样品缓冲液 （6）：0

10、.25溴酚蓝 - 40蔗糖3琼脂糖4溴化乙锭母液 （EB） 10 mg/ml5DNA 分子量标准（一） 制备琼脂糖凝胶根据被分离DNA的大小，决定凝胶中琼脂糖的百分含量 （可参照下表）不同浓度琼脂糖凝胶的DNA有效分离范围琼脂糖凝胶浓度线性DNA的有效分离范围 （kb）0.35.0600.61.0200.70.8100.90.57.01.20.46.01.50.23.02.00.12.0实验用1.0琼脂糖。称取1.0g琼脂糖，放入锥形瓶中，加入100 ml 1TAE缓冲液，置微波炉或水浴加热至完全溶化，取出摇匀即可。（二） 胶板的制备 1 取干净的有机玻璃内槽，用透明胶带将有机玻璃内槽的两端边

11、缘封好 （一定封严，不能留缝隙）。2 将有机玻璃内槽放置于一水平位置，并放好样品梳子。3 将冷到60左右的琼脂糖凝胶液，缓缓倒入有机玻璃内槽，加入溴乙锭至终浓度为0.5 g/ml （100 ml凝胶液加入0.5 l）。 直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶面 （注意不要形成气泡）。4 待胶凝固后，小心地拔出梳子，撕下透明胶带，然后将有机玻璃内槽放在电泳槽内。注意：DNA样品孔应朝向负电极一端。5 加电泳缓冲液至电泳槽中，加液量要使液面没过胶面1-1.5 cm。（三） 加样1 DNA样品与样品缓冲液按1:5比例混匀。2 用移液枪将已加入上样缓冲液的DNA样品加入加样孔 （记录点样顺序及点样量）。（四

12、） 电泳1 接通电泳槽与电泳仪的电源。DNA的迁移速度与电场强度成正比，一般电场强度不要超过5 V/cm。（50 - 100 V）2 当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1 - 2 cm处，停止电泳。（五） 染色 （第二步没有加溴化乙锭的染色方法）将电泳后的凝胶浸入溴化乙锭染色液（在200 ml 1TAE缓冲液中加两滴2 mg/l的溴化乙锭储存液即可），在脱色摇床上缓慢摇动下染色20-30分钟。溴化乙锭为致癌物，须戴一次性塑料薄膜手套操作，并小心污染环境。在紫外灯 （360 nm或254 nm）下观察染色后的电泳凝胶。DNA存在处应显出桔红色荧光条带（在紫外灯下观察时应戴上防护眼镜，以防紫外线对眼睛的

13、伤害作用）。根据需要进行拍照，保存实验结果。实验四、SDS法提取植物总DNA植物DNA的提取过程中，首先必须破碎细胞壁释放出细胞内容物，然而许多操作在破壁的同时会造成DNA的断裂。将新鲜植物组织在干冰或液氮中快速冷冻后，用研钵研成粉末后，再加入提取缓冲液，能够地防止DNA的断裂。也可将植物组织胀水，然后研磨成细粉。其次，提取DNA的缓冲液当，必须采用含有SDS和CTAB等去污剂，使细胞内源的核酸酶变性，防止同时释放出来DNA降解。在提取过程中，注意防止剧烈振荡或枪头的快速抽吸，防止DNA的断裂。仪器、材料和试剂1离心机2水浴锅 （37，65）3研钵450 ml、2 ml、1.5 ml离子管（二

14、） 试剂1液氮2DNA提取缓冲液50 mM Tris-HCl pH 7.6100 mM NaCl50 mM EDTA0.5% SDS10 mM -巯基乙醇3氯仿/异戊醇 （24:1）4RNase A5异丙醇670%乙醇7TE缓冲液：10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0（三） 材料植物新鲜叶片组织SDS法少量提取植物总DNA：1 植物材料（根、茎、叶片等）0.40.6 g，加液氮研成粉末后，加入DNA提取Buffer 1.51.6 ml，抽取15 min，可以适当加热 （6065温育）。2 分装于两个ependorf管中，每管各抽取液0.70.8 ml，加入0.5

15、（0.4 ml） 倍苯酚（Tris饱和酚），轻轻混匀，抽取510 min，9, 000 g，离心10 min3 吸取上清，加入0.5 （0.4 ml） 倍氯仿，轻轻混匀，抽取1015 min，12, 000 g，离心8min4 收集上清，加入等体积异丙醇（总体积约为1.5 ml），混匀，此时可见，白色絮状DNA沉淀，12, 000 g，室温下离心15 min，吸去上清5 70%乙醇洗涤沉淀一次6 于37烘箱烘干沉淀7 沉淀溶于适量TE，加入RNase使终浓度为50 g/ml，37消化3060 min8 等体积苯酚-氯仿，氯仿各抽取一次9 上清加入1/10倍体积的3 M NaAc（pH 5.2）

16、和22.5倍体积预冷无水乙醇，混匀后，于-20 放置30 min，4,12, 000 g,离心15 min,弃去上清10 70% 乙醇洗涤沉淀一次，干燥后溶于适量TE或水中11 0.70.8% 琼脂糖凝胶上检测植物总DNA；剩余DNA样品保存于-20备用。SDS法大量提取植物组织总DNA1 植物材料（根、茎、叶片等）12 g，加入DNA提取Buffer 8 ml，抽取15 min，可以适当加热 （6065温育）。2 加入0.5倍苯酚（Tris饱和酚），轻轻混匀，抽取510 min，9, 000g，离心10 min3 吸取上清，加入0.5倍氯仿，轻轻混匀，抽取1015 min，12, 000g，

17、离心8 min4 吸取上清，加入等体积异丙醇，混匀，此时可见，白色絮状DNA沉淀，用枪尖小心挑出DNA沉淀，放入ependorf管中；12, 000g，室温下离心5 min，吸去上清9 上清加入1/10倍体积的3 M NaAc（pH 5.2）和22.5倍体积预冷无水乙醇，混匀后，于-20放置30 min，4，12, 000 g，离心15 min，弃去上清10 70%乙醇洗涤沉淀一次，干燥后溶于适量TE或水中11 0.70.8%琼脂糖凝胶上检测植物总DNA；注意事项如果提取产物出现黄色现象，可能是植物组织含有褐色多酚类化合物，可以在提取缓冲液加入2%聚乙烯吡咯烷酮 （PVP，相对分子量10 00

18、0），以有助于除去多酚类杂质。实验四 蛋白质的诱导表达及SDS-PAGE电泳鉴定SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）是蛋白分析中最经常使用的一种方法。它是将蛋白样品同离子型去垢剂十二烷基硫酸钠（SDS）以及巯基乙醇一起加热，使蛋白变性，多肽链内部的和肽链之间的二硫键被还原，肽链被打开。打开的肽链靠疏水作用与SDS结合而带负电荷，电泳时在电场作用下，肽链在凝胶中向正极迁移。不同的大小的肽链由于在迁移时受到的阻力不同，在迁移过程中逐渐分开，其相对迁移率与分子量的对数间成线形关系。pET-SOD是将人Cu/Zn-SOD的基因克隆在pET30a（+）上的一种原核表达载体。携带有pET-SOD

19、的大肠杆菌在卡那霉素和IPTG诱导，可以表达人Cu/Zn-SOD蛋白，比不加IPTG同样的大肠杆菌在SDS-PAGE凝胶上要多出一条明显的条带。1垂直板电泳槽及配套的玻璃板，梳子2电泳仪3干式恒温培养器4微波炉转化有pET-SOD的大肠杆菌。1. 30% 丙烯酰胺溶液：丙烯酰胺 29.2 g，甲叉双丙烯酰胺 0.8 g，加水至100 ml，过滤，棕色瓶4保存。2. 分离胶缓冲液 pH 8.8 （41.5 M Tris-HCl，取18.15 g Tris，用1 M HCl 调pH 至8.8，加水至100 ml，4保存。3. 浓缩胶缓冲液 pH 6.8 （40.5 M Tris-HCl，：取5.9

20、8 g Tris，用1 M HCl调至pH 6.8，加水至100 ml，4保存。4. 电极缓冲液 （pH 8.3, 5取94 g 甘氨酸，15.1 g Tris，加50 ml 10% SDS，加水至1 L，4保存，使用时稀释5倍使用。（1电极缓冲液为：25 mM Tris-HCl、250 mM甘氨酸、0.1% SDS）5. 10% SDS：取10 g SDS，加水至100 ml，完全溶解后室温保存。6. 10% 过硫酸铵溶液（AP）：临用前现配 （-20可存放1个半月）7. TEMED（四甲基乙二胺）8. 染色液 （0.25% 考马斯亮蓝R-250、50%乙醇、7%乙酸）：考马斯亮蓝R-250

21、 2.5 g、乙醇500 ml、70 ml 冰乙酸，溶解后用蒸馏水定容至1000 ml。9. 脱色液（30%乙醇、7%乙酸）：乙醇 300 ml，冰乙酸 70 ml，蒸馏水定容至1000 ml。10. 2样品缓冲液 组份 （20 ml）原液加入量100 mM Tris-HCl pH 6.80.5 M Tris-HCl pH 6.84 ml20甘油甘油4SDS20SDS0.2溴酚蓝溴酚蓝40 mg10 mM -巯基乙醇-巯基乙醇0.2 mlH2O8 ml 实验步骤1蛋白质的诱导表达将重组载体pET-SOD转入大肠杆菌BL21（DE3），挑单菌，接种于含有50 g/ml卡那霉素的LB液体培养基中，

22、37培养过夜，取过夜培养物按1/50的比例扩大培养至OD600为0.50.6，吸取1 ml培养物，收集菌体备用；加入IPTG至终浓度为0.25 mmol/L，37继续摇菌4 h，收集菌体，进行SDS-PAGE凝胶电泳检测融合蛋白表达情况。2蛋白质的SDS-PAGE凝胶电泳（1）装配好灌胶用的玻璃板“三明治”，注意检查，勿使玻璃板“三明治”的夹缝是否漏水。（2）配制浓度为12的分离胶 （凝胶浓度应根据被分离蛋白的分子量进行选择），不同分离胶配方参见如下表：组分分离胶 7.5%10%12%15%分离胶缓冲液（pH 8.8） （l）25001250H2O （l）4900245041002050330

23、0165024001200Acr/Bis （l）40002000500010%SDS （l）100503010%AP （l）60TEMED （l）128总体积 （ml）10 510混匀后加入两玻璃夹缝中，并小心在胶面上加入1cm蒸馏水（在胶面上加蒸馏水称水封，目的是保持胶面平整，并防止胶与空气接触，影响胶的聚合），室温放置，等胶自然凝聚后（此时在胶面与水封之间可见清晰的界限），将水封倾去。（4）配制4的浓缩胶，不同浓缩胶配方参见如下表：浓缩胶 （pH 8.8） 3%4%6%浓缩胶缓冲液 （l）625320016003050150027001350500250650375100025152.5混

24、匀后加入到三明治玻璃板的夹缝中，然后在把1mm的梳子插进浓缩胶中，注意在梳子和浓缩胶之间不要留有气泡。如果发现有较大的气泡，一定要想法去掉（可以插拔梳子或指弹气泡处的玻璃等），否则会影响电泳结果。待浓缩胶凝固后，小心拔出梳子。如果发现拔出梳子后形成的加样孔之间的间隔发生扭曲，用注射器的针头小心加以整理，使之齐整。（5）细菌培养物SDS-PAGE样品的制作：取细菌培养物0.3 ml 加到1.5 ml小离心管中，12000 r/m离心30 s去上清。在离心沉淀中加0.3 ml蒸馏水，用枪头小心地吹打，使细菌充分悬浮，直到没有明显的小团块，然后加入等体积的2样品缓冲液，在100沸水浴 （或干式培养器） 中保温5 min。此时如用枪头吸取样品，会发现非常粘稠，呈鼻涕状，这是因为有样品中含有大量DNA的结果。要用胰岛素注射器将样品从极细的针头中打出，反复多次才能将DNA分子打断，使样品变得不再粘稠为止。将样品14000 r/m离心5 min，使不溶物沉淀下来，小心吸取上清加样。电