旋覆花素抑制Aβ诱导大鼠脑海马组织炎性反映.docx

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旋覆花素抑制Aβ诱导大鼠脑海马组织炎性反映

旋覆花素抑制Aβ诱导大鼠脑海马组织炎性反映

作者：

王英杰柴锡庆王文胜韩梅温进坤

【摘要】目的探讨旋覆花素对Alzheimer病（AD）模型大鼠诱导型一氧化氮合酶（iNOS），核转录因子κB（NFκB）表达的影响及医治作用的机制。

方式30只SD大鼠随机分为对照组、模型组及旋覆花素给药组，Aβ25～35海马内注射制备AD大鼠模型，给药组天天给予旋覆花素26mg·kg-1·d-1，模型组给予等量溶剂，分两次灌胃，共21d。

用Morris水迷宫测定大鼠的学习记忆能力，免疫组化及Western印迹法测定大鼠海马iNOS，NFκB蛋白表达。

结果模型组海马iNOS、NFκB基因表达升高，给药组iNOS、NFκB基因表达下降，与模型组比较统计学不同显著（P＜。

AD大鼠在定位航行实验中，逃避暗藏期延长，单位时间内跨越原平台次数减少，空间记忆力受损，与对照组及给药组大鼠比较有统计学不同（P＜；于实验第二、3、4d给药组与对照组大鼠比较统计学不同不明显（P＞。

结论旋覆花素的抗炎作用可能是改善AD大鼠学习记忆能力的作用机制之一。

【关键词】β淀粉样蛋白；Alzheimer病；诱导型一氧化氮合酶；核转录因子κB；旋覆花素；炎症

旋覆花内酯（loacetylbritannilactone，ABL）是从欧亚旋覆花的氯仿提取物中分离出的一种结构上属于苯并呋喃酮衍生物的单体成份，该化合物能有效抑制RAW巨噬细胞合成炎性介质NO和PGE2，并发现其作用机制与抑制核转录因子κB（NFκB）活化及iNOS和COX2基因表达有关〔1〕。

基于Alzheimer病（AD）是一种慢性炎症性疾病，旋覆花素是旋覆花单体有效成份的特定组合，本研究通过观察旋覆花素对Aβ诱导的AD模型大鼠的干与效应，探讨其作用机制，旨在肯定该有效部位的药用价值和作用途径。

1资料与方式

实验动物健康雄性SD大鼠30只（由河北省实验动物中心提供）鼠龄10～12月龄,体重（±）g，随机分为三组：

对照组、模型组和旋覆花素给药组，每组10只。

试剂与仪器旋覆花素由河北医科大学药学院从欧亚旋覆花的氯仿提取物中分离制备（已获专利授权），含ABLmg/ml；Aβ25～35购自Sigma公司；NFκBp50、iNOS抗体购自SantaCruz公司；免疫组化试剂盒购自北京中杉金桥生物技术公司；脑立体定向仪:

江湾Ⅰ型C,上海川沙花木农机厂制造。

Aβ25～35的孵育用无菌生理盐水将Aβ25～35稀释成10g/L，37℃孵育72h，使其变成聚集状态的Aβ25～35，置于4℃冰箱备用。

药物海马内注射步骤大鼠用质量浓度为20g/L乌拉坦3ml/kg腹腔注射麻醉后,固定于脑立体定向仪上。

参照大鼠脑立体定位图谱〔2〕，以前囟为零点，AP＝mm，ML＝mm，DV＝mm为穿刺点，钻孔穿颅，用微量注射器将Aβ25～35各1μl（10μg）在5min缓慢注入，留针5min，对照组注射等量的生理盐水，退针缝合伤口。

给药方式术前3d及术后18d，给药组给旋覆花素26mg/kg分2次灌胃，模型组给予等量溶剂。

大鼠空间学习记忆能力测试（Morris水迷宫）参照Morris实验方式进行，用于测量大鼠学习和记忆能力。

本实验所用水迷宫为一直径120cm、高55cm的圆形水池，水池内壁被漆为黑色，水深42cm，距池壁35cm处放置一高40cm，直径8cm圆台。

实验共5d，实验前1d让大鼠自由游泳2min，从第1天起,天天分上、下午两段,每段训练4次。

训练时随机选择一个入水点,将大鼠面向池壁放入水中,记录大鼠寻觅并爬上平台所需时间（即暗藏期），每次训练距离60s。

若是大鼠在120s内未找到平台，须将其引至平台,这时暗藏期记为120s。

在第5天最后一次训练后撤除水下平台,在同一入水点将大鼠面向池壁放入水中，测其在120s内跨过原平台相应位置的次数。

免疫组化染色法检测iNOS和NFκB参照利用说明书进行。

切片常规脱蜡至水,蒸馏水冲洗，PBS浸泡5min，浸入EDTA缓冲液（pH＝）,电炉加热至92℃～98℃20min,冷却后PBS洗涤1～2次。

3%过氧化氢室温孵育5～10min，PBS洗2min×3次。

滴加正常山羊血清封锁液，室温孵育20min，甩去多余液体。

加入用PBS稀释的iNOS抗体（1∶50）或NFκBp50抗体（1∶400），4℃留宿，PBS冲洗3min×3次。

滴加生物素标记二抗，37℃温育15min。

PBS洗2min×3次。

滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃温育10～15min，PBS洗2min×3次。

DAB室温显色,镜下控制反映时间。

苏木素复染20s,自来水洗涤。

常规脱水、透明、封片，镜检。

Western印迹法检测iNOS和NFκB蛋白别离取200μg总蛋白和20μg核蛋白提取物与5×SDS上样缓冲液混合均匀，100℃煮沸5min，冰上冷却，上样于PAGE凝胶加样孔内，120V恒压电泳至溴酚蓝至凝胶底部。

20V恒压别离120min和30min将凝胶上蛋白转移至PVDF膜，质量浓度为50g/L的牛奶于37℃封锁1h。

将膜别离浸入兔多抗iNOS（1∶300）、兔多抗NFκB（1∶400）溶液，4℃结合留宿。

TTBS溶液洗膜，将膜浸入辣根过氧化物酶标记的二抗溶液（1∶10000），37℃反映1h，TTBS溶液洗膜，化学发光法显色。

图像处置及统计学分析采用美国Kodak公司数码成像分析软件对Western印记显色区带的信号强度进行相对定量分析。

数据采用软件进行统计分析，计量资料以x±s表示，组间资料应用单因素方差分析。

2结果

旋覆花素对大鼠海马iNOS表达的影响免疫组化染色阳性反映物为棕黄色，位于细胞膜和胞质，细胞核不着色。

对照组海马组织iNOS阳性染色细胞数量少，且几乎不着色；模型组海马组织iNOS阳性染色细胞数量多，着色深；旋覆花素给药组大鼠iNOS阳性染色细胞数量较模型组海马组织减少，着色较浅，但仍比对照组数量多，着色深（图1）。

Western印迹显示，对照组海马组织iNOS表达量低，模型组海马组织表达量显著增高（P＜）；给予旋覆花素医治后，大鼠脑海马组织iNOS表达量明显下降，与模型组相较不同有统计学意义（P＜）（图2）。

图1大鼠海马组织切片iNOS免疫组化染色（×200）

图2旋复花素抑制大鼠海马iNOS表达

旋覆花素对大鼠海马NFκBp50表达的影响免疫组化染色阳性反映物为棕黄色，胞质与胞核均着色。

结果发现，对照组海马组织NFκBp50阳性染色细胞数量少，着色浅；模型组海马可见大量NFκBp50阳性染色细胞，染色细胞数量多，着色深；旋覆花素给药组大鼠脑海马组织NFκBp50阳性染色细胞数较模型组显著减少，着色浅（图3）。

Western印迹显示，在对照组细胞中NFκBp50主要散布于细胞浆中，细胞核中仅有少量的NFκBp50存在；Aβ诱导的AD模型大鼠脑海马组织细胞核内NFκBp50水平显著升高（P＜）；服用旋覆花素的给药组大鼠脑海马组织细胞核中NFκBp50的表达量与模型组相较显著减少（P＜）。

三组海马组织细胞浆中NFκBp50的含量无明显不同（图4）。

旋覆花素对大鼠学习记忆行为的影响随着训练时段的增加，所有动物寻觅站台的暗藏期愈来愈短，表明三组大鼠通过学习，都可对水下的站台产生空间定位记忆。

训练第1天，模型组大鼠和给药组大鼠不同不具有统计学意义（P＞，对照组大鼠与其他两组大鼠比较，不同有统计学意义（P＜；训练第二、3、4天，模型组大鼠平均暗藏期明显延长与其他两组比较不同具有统计学意义（P＜，而给药组与对照组比较，二者之间的不同不具有统计学意义（P＞；于训练第5天，三组大鼠达稳定水平，不同均无统计学意义（P＞（图5）。

模型组大鼠最后一次跨平台次数±，较对照组（±）及给药组（±）减少（P＜，提示ABL对Aβ25～35所致AD大鼠模型空间学习记忆能力障碍有明显的改善作用。

图3大鼠海马组织切片NFκB免疫组化染色（×400）

3讨论

AD的病因至今尚未明了，其发病机制有多种学说,其中以β淀粉样蛋白学说,但均不能完整地解释AD的发生。

最近几年熟悉到脑内慢性炎症反映可能是其重要病理特征之一,从而提出了AD的炎症机制。

神经元细胞外Aβ聚集形成老年斑是AD的典型病理特征，在小胶质细胞存在的情况下，Aβ1～42对培育的中脑神经元的毒性作用可明显增加〔3〕。

在AD脑内，激活的小胶质细胞增进iNOS的表达持续产生大量NO，还可产生α干扰素以增加NO的产量。

NO除作为自由基和与超氧阴离子结合形成超氧亚硝酸盐（ONOO）具有直接毒性外，还可通过激活COX2，进一步激活炎症前阶段，产生花生四烯酸的级联放大反映而参与炎症反映。

体外实验证明，Aβ能诱导胶质细胞表达iNOS，产生大量NO致使神经元死亡〔4〕。

在体研究进一步表明，脑内Aβ注射可致使局部胶质细胞增生伴iNOS大量表达〔5〕，特异性iNOS抑制剂可完全阻断在体条件下的NO合成〔6〕。

本实验发现，在体条件下对照组大鼠海马iNOS表达很少，Aβ海马内注射可刺激海马组织iNOS的表达增多，服用旋覆花素后，给药组大鼠脑海马组织iNOS表达较模型组大鼠显著降低。

表明旋覆花素可以抑制Aβ诱导的AD模型大鼠脑海马组织的iNOS表达。

Aβ是NFκB的有效激活剂〔7〕，NFκB在神经细胞中适度表达可保护其免受氧化应激损伤，但它也是一种壮大介导COX二、iNOS等多种促炎因子表达的重要转录因子〔8〕，在胶质细胞中过度激活又可致使炎症级联反映，研究显示AD脑中NFκB的表达增高，伴随Aβ的沉积增加〔9,10〕。

抑制NFκB活性可以减少Aβ的产生，减弱Aβ的神经毒性〔11,12〕。

本实验结果发现，旋覆花素给药组大鼠脑海马组织NFκB的表达量与模型组相较明显减少，但胞浆蛋白NFκB的表达量则与模型组大体相同。

说明旋覆花素的抗炎机制与抑制NFκB活化，下调其下游基因iNOS表达有关。

海马切片HE染色显示给药组的神经元胶质细胞浸润、空泡变性、坏死等改变较模型组明显减轻，提示旋覆花素抑制炎症反映的同时可以减弱Aβ对神经元的毒性作用。

痴呆组大鼠的学习记忆能力明显下降，应用旋覆花素处置后，经水迷宫测试给药组大鼠平均暗藏期较痴呆组大鼠明显减少，单位时间内跨越原平台次数增多，表明旋覆花素具有改善痴呆大鼠学习记忆的作用，其作用部份可能是由于旋覆花素的抗炎效应引发的。

【参考文献】

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（1）:

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