细胞培养无菌操作和培养技术.ppt

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第二部分细胞培养技术,林红9-25-2010,一细胞培养无菌操作,常用仪器设备培养器皿培养基血清其他细胞培养试剂,常用仪器设备,超净台或生物安全柜：

细胞操作CO2培养箱：

细胞培养液氮罐：

细胞长期冻存37水浴：

培养溶液预热，细胞复苏倒置显微镜：

观察细胞离心机：

收集细胞，细胞常用300g转速5min冰箱：

细胞培养溶液分装储存负压吸引器：

细胞培养废液吸取,超净工作台,超净台或生物安全柜,垂直风超净台,水平风超净台,生物安全柜（Biologicalsafetycabinets，BSCs）是为操作原代培养物、菌毒株以及诊断性标本等具有感染性的实验材料时，用来保护工作人员、实验室环境以及实验品，使其避免暴露于上述操作过程中可能产生的感染性气溶胶和溅出物而设计的。

超净工作台（超净台，cleanbench）是为了保护试验品或产品而设计的，通过吹过工作区域的垂直或水平层流空气防止试验品或产品受到工作区域外粉尘或细菌的污染。

实验前准备,预热实验用相关试剂（培养基、PBS、D-Hanks液、实验用水）预融实验用液体（血清、胰酶、双抗、实验添加剂）检查离心机、水浴箱、显微镜、超净台、培养箱是否处在正常状态用75%酒精涂手，清洁操作台检查超净台内各种实验器材（离心管、滴管、移液器、酒精灯、镊子、记号笔、培养瓶等）,使用前需打开无菌工作台及净化室的紫外灯，消毒半小时以上。

进入净化室前先关闭紫外灯，打开超净台风机，等待30min以上，以排尽臭氧。

穿好隔离衣，戴好口罩，帽子，换鞋。

风淋1-2min。

75%酒精擦手。

点燃酒精灯，注意酒精液面；超净台内应避免放入过多的物品；使用的吸管，滴管，试管，培养瓶等均事先灭菌。

打开各类瓶盖前先过火，以固定灰尘；打开的瓶口、试管口过火焰，镊子使用前应经火焰烧灼。

水平式风机的超净台，应使瓶口斜置，应尽量避免瓶口敞开直立。

每次从试管或者培养瓶中倾倒培养液的时候，都要使用火焰灼烧瓶或者管的盖子。

当转移培养物时，也应该常规性的灼烧。

灼烧的目的不是消毒，是为了加热试管以产生自瓶口处上升的热对流空气。

这种热的空气“保护伞”能够防止携带有污染性质细菌的尘埃落入试管。

Cultureflask,CulturePlate,培养器皿,移液管和移液器,同一根吸管或滴管不应连续用于几个不同的细胞系；吸取培养基的吸管应离开培养瓶或试管口0.5cm，避免伸入培养瓶口或试管口；以防止细胞系的互相混杂污染。

漏在培养瓶上或台上的液体，立即用酒精棉球擦净。

细胞培养箱,工作原理通过在培养箱箱体内模拟形成一个类似细胞/组织在生物体内的生长环境如恒定的酸碱度（pH值：

7.2-7.4）、稳定的温度（37C）、较高的相对湿度（95%）、稳定的CO2水平（5%），来对细胞/组织进行体外培养的一种装置。

细胞培养基,干粉培养基和液体培养基干粉培养基需使用者自己配制并灭菌，其优点是价格便宜。

缺点是配制过程繁琐，质量不易控制液体培养基是由专业厂家按标准规模化生产，不仅质量得到保证，而且使用十分方便常用的培养基种类RPMI-1640（标准型）、DMEM-高糖（标准型）、DMEM-低糖（标准型）、McCoys5A、M199、F12等,培养基的选择,没有一定的标准，有几点建议可供参考：

建立某种细胞株所用的培养基应该是培养这种细胞首选的培养基。

可以查阅参考文献，或在购买细胞株时咨询。

其它实验室惯用的培养基不妨一试，许多培养基可以适合多种细胞。

用多种培养基培养目的细胞，观察其生长状态，可以用生长曲线、集落形成率等指标判断，根据实验结果选择最佳培养基，这是最客观的方法，但比较繁琐。

血清,血清中含有蛋白质、氨基酸、葡萄糖、激素等，其中蛋白质主要为白蛋白和球蛋白。

氨基酸有多种，是细胞合成蛋白质的基本成分，其中有些氨基酸动物细胞本身不能合成（称为必需氨基酸），必须由培养液提供。

血清激素有胰岛素、生长激素等及多种生长因子（如表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、类胰岛素生长因子等）；血清还含有多种未知的促细胞生长因子、促贴附因子及其他活性物质，能促进细胞的生长、增殖和贴附。

动物血清还可起到酸碱度缓冲液的作用。

因此，细胞培养时，要保证细胞能够顺利生长和增殖，一般需添加10%20%的血清，,血清的种类,何谓FBS,FCS,CS,HS?

FBS（fetalbovineserum）和FCS（fetalcalfserum）是相同的意思，两者都是指胎牛血清，FCS乃错误的使用字眼，请不要再使用。

CS（calfserum）则是指小牛血清。

HS（horseserum）则是指马血清。

血清使用注意事项,血清必须贮存于20-70，若存放于4，请勿超过一个月。

如果一次无法用完一瓶，可将4045ml分装于无菌50ml离心管中，由于血清结冻时体积会增加约10%，必须预留此膨胀体积之空间，否则易发生污染或容器冻裂之情形。

血清解冻步骤（逐步解冻法）:

-20或70至4冰箱溶解一天，至室温下全溶后再分装。

在溶解过程中须规则摇晃均匀（小心勿造成气泡），使温度与成分均一，减少沉淀的发生。

勿直接由20直接至37解冻，因温度改变太大，容易造成蛋白质凝结而发生沉淀。

热灭活（heat-inactivation）是指56,30分钟加热已完全解冻之血清。

此热处理之目的是使血清中之补体成份（complement）去活化。

除非必须，一般不建议作此热处理，因为会造成沉淀物之显著增多，且会影响血清之品质。

勿将血清置于37太久，若在37放置太久，血清会变得混浊，同时血清中许多较不稳定之成份亦会因此受到破坏，而影响血清之品质,凝絮物：

发生之原因有许多种，但普遍之原因是血清中之脂蛋白（lipoprotein）变性及解冻后血清中存在之血纤维蛋白（fibrin）造成，这些凝絮沉淀物不会影响血清本身之品质。

若欲减少这些凝絮沉淀物，可用离心3000rpm,5min去除，或离心后上清液可以加入培养基中一起过滤。

不建议用过滤步骤去除这些凝絮沉淀物，因为会阻塞过滤膜。

显微镜下观察之“小黑点”：

通常经过热处理之血清，沉淀物的形成会显著的增多。

有些沉淀物在显微镜下观察像是“小黑点”，常会误认为血清遭受污染，而将血清放在37中欲培养此“微生物“，但在37环境下，又会使此沉淀物增多，更会误认为微生物之增殖，但以培养细菌之培养基检测，又没有污染。

一般而言，此小黑点应不会影响细胞之生长，但若怀疑此血清之品质，应立即停用，更换另一批号的血清。

血清沉淀物,谷氨酰胺,谷氨酰胺在细胞代谢过程中起重要作用，合成培养基中都要添加，由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定容易降解，4下放置7天即可分解约50%，所以都是在使用前添加配制好的培养液（含谷氨酰胺）在4放置2周以上时，要重新加入原来量的谷氨酰胺，故需单独配制谷氨酰胺，以便临时加入培养液内使用终浓度为1-4mM一般配制为100倍浓缩液，即浓度为200mM（29.22g/L）配制方法为：

谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水加至100ml即配成200mM的溶液，充分搅拌溶解后（应加温30），过滤除菌，分装小瓶，-20保存，使用时可向100ml培养液中加入0.5-2ml谷氨酰胺浓缩液，终浓度为1-4mM,酚红,大多数培养液中使用酚红作为pH指示红色表示中性pH黄色代表酸性pH紫色表示碱性pH培养基保存于4C冰箱中，培养基内之CO2会逐渐溢出，造成培养基越来越偏碱性。

而培养基中之酸碱指示剂（通常为phenolred）的颜色也会随碱性增加而更偏暗红。

培养基偏碱之结果，将造成细胞生长停滞或死亡。

若培养基偏碱时，可以通入无菌过滤之CO2，以调整pH值。

在一些特殊培养液中不含酚红因为已有一些研究表明：

酚红能模拟类固醇激素（尤其是雌激素）样作用,细胞消化液,分离组织和分散细胞常用的有胰蛋白酶和乙二胺四乙酸二钠（EDTA）两种溶液，单独或混合使用胰蛋白酶溶液主要作用：

使细胞间的蛋白质水解，使细胞相互离散消化细胞时，加入一些血清或含血清的培养液，能终止消化作用EDTA4Na溶液一种化学螯合剂，对细胞有一定的离散作用，而且毒性小，价格低廉，使用方便常用工作液浓度为0.02%。

注意：

使用EDTA处理细胞后，要用平衡盐液冲洗干净，因残留的EDTA会影响细胞生长,trypsin,细胞冻存液,保护剂：

甘油或二甲基亚砜（DMSO）能提高细胞膜对水的通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。

配制：

20%血清培养基+10%DMSO（或甘油）,细胞污染,主要的污染原因为无菌操作技术不当、操作室环境不佳、污染之血清和污染之细胞等。

一旦发现细胞污染，应直接灭菌后丢弃之。

严格的无菌操作技术、清洁的环境、与品质良好之细胞来源和培养基配制是减低污染之最好方法。

细胞污染的种类,细菌污染真菌污染细菌和真菌的清除支原体污染支原体的清除,细菌污染,细胞培养常见的污染最常见的有革兰氏阳性菌，如枯草杆菌以及大肠杆菌、假单胞菌等革兰氏阴性菌，其中又以白色葡萄球菌较常见。

培养细胞受细菌污染后，会出现培养液变混浊，pH改变。

污染后细胞发生病理改变，胞内颗粒增多、增粗，最后变圆脱落死亡。

球菌污染,真菌污染,真菌污染后，细胞生长变慢，但最后由于营养耗尽及毒性作用而使细胞脱落死亡。

细菌和真菌的清除,使用抗生素抗生素对杀灭细菌较有效。

联合用药比单独用药效果好。

预防用药比污染后再用药效果好，一般用双抗生素（青霉素和链霉素，简称P/S）。

污染后清除用药需采用大于常用量510倍药物冲洗法，于加药后作用2448小时，再换常规培养液。

此法在污染早期有效。

支原体污染,支原体（mycoplasma）污染的细胞，不能以肉眼观察出异状。

除极有经验之专家外，大多数遭受支原体污染的细胞株，无法以其外观分辨之。

支原体污染几乎可影响所有细胞之生长参数，代谢及研究之任一数据。

危害：

世界性问题，平均发生率达到11%能改变细胞的DNA,RNA及蛋白表达不能通过可视法对其进行检测对细胞的生长率影响较小，不易引起注意污染培养细胞受支原体污染后，部分敏感细胞可见细胞生长增殖变慢，部分细胞变圆，从瓶壁脱落。

但多数细胞污染后无明显变化，或略有变化，若不及时处理，还会产生交叉污染。

来源：

操作环境不良操作人员的疏失实验器具不洁等已受污染的细胞已受污染的培养基、血清,支原体污染,阳性阴性,、用MRA处理用MRA（MycoplasmaRemovalAgent）处理细胞，每4天换一次液,连续处理15天以确保细胞纯洁健康效果好2、用清洗纯化法清除支原体污染的方法细胞营养驯化优质细胞群的筛选细胞清洗反复离心洗涤其原理是利用离心力、细胞、微生物质量和悬液的浮力差达到清除支原体的目的。

由于支原体个体小且除发酵支原体外多为细胞外寄生，所以通过反复洗涤细胞和低速离心换液使其中潜在的支原体数量降低至极限.如结合敏感抗生素的抑杀作用，可达到更好的效果。

3、药物辅助加温处理先用药物处理后，再将污染的组织培养物放在41培养18小时，可杀死支原体，但对细胞有不良影响。

支原体的清除,预防是防止细胞培养过程中发生污染的最好办法。

只有预防工作做在前，才能将发生污染的可能性降到最小程度。

一般预防可从以下几方面着手：

1、添加抗生素2、从物品、用品消毒灭菌着手细胞培养所用物品清洗、消毒要彻底，各种溶液灭菌除菌要仔细，并在无菌试验阴性后才能使用。

操作室及剩余的无菌器材要定期清洁消毒灭菌。

污染的预防,3、从操作者做起

（1）进无菌室前要用肥皂洗手，按规定穿隔离衣。

工作开始要先用75%酒精棉球擦手、擦瓶口和烧灼瓶口。

（2）操作者动作要轻，必须在火焰周围无菌区内打开瓶口，并将瓶口转动烧灼。

操作时尽量不要谈话，若打喷嚏或咳嗽应转向背面。

（3）操作时要常更换吸管，一旦发现吸管口接触了手和其他污染物品应弃去。

实验完毕用消毒水浸泡的纱布擦台面。

4、防止细胞交叉污染在进行多种细胞培养操作时，所用器具要严格区分。

在进行换液或传代操作时，注射器和滴管不要触及细胞培养瓶瓶口，以免把细胞带到培养液中污染其他细胞。

细胞一旦购置或从别处引入，均应及早