发酵教学大纲2Word格式.docx
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六、实验内容：
1．Act0988出发菌株活化培养、加富培养基培养
斜面菌种先接种于新鲜的高氏一号培养斜面28℃培养6d，然后将培养的斜面的菌丝体接种于加富高氏一号培养基，加富高氏一号培养基除高氏一号基础成分外添加牛肉膏2g/L、酵母膏2/L及甘油2mL/L℃培养6d。
2．单孢子悬液的制备
诱变育种要求所处理的细胞必须是处于对数生长期同步生长的细胞，并且是均匀状态的单细胞悬液。
首先是细胞的生理状态对诱变处理也会产生很大的影响，如细菌在对数期诱变处理效果较好；
霉菌或放线菌的分生孢子一般都处于休眠状态，所以培养时间的长短对孢子影响不大，但稍加萌发后的孢子则可提高诱变效率。
其次是分散状态的细胞可以均匀地接触诱变剂，又可避免长出不纯菌落。
由于在许多微生物的细胞内同时含有几个核，所以即使用单细胞悬浮液处理，还是容易出现不纯的菌落。
若诱变剂产生的突变只在DNA双链中的某一条单链，故该突变无法反映在当代的表型上。
只经过DNA的复制和细胞分裂，表型才会发生变异，出现不纯菌落，这就叫表型延迟（phenotypiclag）。
不纯菌落的存在，也是诱变育种工作中初分离的菌株经传代后很快出现生产性状“衰退”的主要原因。
无菌室以生理盐水（0.85%NaCl）洗下斜面孢子收集于装有近20粒无菌玻璃珠三角瓶内（内装玻璃珠，装量以大致铺满瓶底为宜），涡旋器上打散未分离的孢子，然后用垫有脱脂棉的灭菌漏斗过滤，制成孢子悬浮液，再用0.1mol/L磷酸缓冲液稀释调整孢子浓度至106～108个/mL，冷冻保藏备用。
3．诱变处理
1）紫外线诱变
打开紫外灯（30W）预热20min。
取5mL菌悬液放在无菌的培养皿（9cm）中，同时制作5份。
逐一操作，将培养皿平放在离紫外灯30cm（垂直距离）处的磁力搅拌器上，照射lmin后打开培养皿盖，开始照射，与照射处理开始的同时打开磁力搅拌器进行搅拌，即时计算时间，照射时间分别为15s、30s、lmin、2min、5min。
处理后，诱变菌液在红灯下稀释，取0.2mL处理菌液均匀涂布于20mL加富高氏一号平板上。
将10-8、10-9、10-10稀释液每处理涂平板5个以上。
28℃培养48h，将指示菌孢子悬浮液喷于平板表面，再28℃培养48h后选40~50个抑菌圈直径与单菌落直径比值（H/C）较大的突变株转接到加富高氏一号斜面培养。
2）紫外线+氯化锂
菌液同前方法分别进行紫外诱变处理1、3、5、7min后，用磷酸缓冲液稀释，将10-8、10-9、10-10稀释液涂布于含有0.02%的氯化锂诱变培养基上，28℃培养48h，将指示菌孢子悬浮液喷于平板表面，再28℃培养48h后选40~50个抑菌圈直径与单菌落直径比值（H/C）较大的突变株转接到加富高氏一号斜面培养。
3）NTG
菌种孢子悬浮液洗入三角瓶（内放玻璃珠），涡漩品振荡5分钟，以无菌脱脂棉过滤，得孢子悬浮液。
NTG配制NTG结晶10mg，加助溶剂甲酸胺0.05ml，加pH6的磷酸盐缓冲液，配成4000µ
g/ml原液。
诱变处理取0.5m1菌液，分别加人不同浓度的NTG0.5ml，使最终浓度为2000、1000和500µ
g/ml，对照只加缓冲液。
28℃静置处理1h、2h，用生理盐水稀释以终止反应。
用磷酸缓冲液稀释，将10-8、10-9、10-10稀释液涂布于含有0.02%的氯化锂诱变培养基上，28℃培养48h，将指示菌孢子悬浮液喷于平板表面，再28℃培养48h后选40~50个抑菌圈直径与单菌落直径比值（H/C）较大的突变株转接到加富高氏一号斜面培养。
4）NTG+紫外线
如前先进行亚硝基胍（NTG）诱变，用1000µ
g/ml亚硝基胍处理1.5h后，将稀释10-8及10-9液涂平板，再以紫外线分别处理1、2、3min（各5个以上）进行诱变筛选。
5）硫酸二乙酯（DES）诱变
用PBS（pH值为7.0的磷酸缓冲液）配制浓度108个孢子/mL，pH7.0磷酸缓冲液稀释孢子混悬液，加入DES使其浓度分别为0.5、1.5、2.5、3.5%，28℃培养处理60min，按照2.5倍的DES溶液体积加入质量分数为25%硫代硫酸钠溶液终止反应。
取稀释液各100µ
L分别涂布于加富高氏一号平板上，同时将未经诱变处理的孢子悬液分别涂布在相应培养基上作对照,28℃培养2d，将指示菌孢子悬浮液喷于平板表面，再28℃培养48h后选40~50个抑菌圈直径与单菌落直径比值（H/C）较大的突变株转接到加富高氏一号斜面培养。
4、正突变菌株筛选
死亡率测定将平板于28℃恒量培养48h，计数不同处理时间与对照的5个平板菌落数，根据计数结果计算死亡率。
初选将平板于28℃恒量培养48h，指示菌浓度108个/mL的孢子悬浮液均匀喷于平板表面，再28℃恒量培养48h后观察在菌落周围出现的抑菌圈大小，测量其菌落直径与抑菌圈直径，抑圈直径与单菌落直径比值（H/C）较大的突变株转接到加富高氏一号斜面培养40～50个接到加富高氏一号斜面，作为复筛菌株。
平板复筛将斜面菌种制备孢子悬浮液，以划线法将菌液在加富高氏一号培养基20mL平板划线，28℃恒量培养48h。
然后再将指示菌菌液喷于平板表面，若出现明显的透明圈，即可按初筛方法检测选出40～50个菌落，获得数株二次优良菌株，进入三角瓶复筛。
三角瓶复筛将平板复选筛选出的菌株，接入液体培养基内（玉米淀粉30、大豆饼粉40、酵母膏2，pH=8，在500mL三角瓶内装培养基100mL），28℃、200r/min培养7d，每菌株3次重复。
并以出发菌株为对照，同样接3瓶。
抑菌效果测定测定发酵液的抗菌活性，发酵结束后进行平板抑菌试验，以青霉菌为指示菌，取离心清液20µ
L滴于2层滤纸片上，每瓶做一个平板，每平板上放置3点，28℃培养48h，十字交叉法测抑菌圈直径，与对照比较抑菌效果。
七、注意事项
1.紫外线照射时注意保护眼睛和皮肤。
2.诱变过程及诱变后的稀释操作均在红灯下进行，并在黑暗中培养。
八、实验报告
1.试列表说明Act0988抗菌活性物质高产突变菌株的筛选过程和结果。
2.你认为以上的筛选方法有什么优缺点，如何改进？
九、问题和思考
1．试述紫外线诱变的作用机理及其在具体操作中应注意的问题。
2．为什么在诱变前要把菌悬液打散和培养一段时间？
注：
筛选菌株数的计算若按突变率为0.01计算，则一次筛选可取250—300个菌落，第一次筛选后可多选几株高产株，而二级筛选为重点阶段，其最适量可参考以下计算方法：
如初筛菌株数为200株，二次筛选欲选株数为2株，则二级应选（200×
2）1/2，为20株，这样的数量选择，使有可能从较少的数量中获得相对较多的优良菌株。
序号
考核方式
成绩比重（%）
1
实验态度
25
2
实验理论
3
操作技能
4
实验报告
合计
100
从各方面考察学生的操作能力和独立思考能力，实验成绩占本门课程总成绩的20%。
实验考核成绩采用实验平时考核成绩取和求平均值的方法进行，以百分制计。
实验平时考核是指每完成一次实验题目要考核一次，每个实验题目考核分为实验过程和实验报告两部分，其中实验过程考核成绩占75%，主要包括预习报告、实验纪律、实验操作和记录；
实验报告考核成绩占25%，主要包括报告格式、内容、结果分析与讨论。
十、教材及参考书目：
1、自编.
2、邓开野.发酵工程实验.暨南大学出版社.2010.
3、吴根福.发酵工程实验指导.高等教育出版社.2006.
常用缓冲溶液的配制方法
1．甘氨酸–盐酸缓冲液（0.05mol/L）
X毫升0.2mol/L甘氨酸+Y毫升0.2mol/LHCI，再加水稀释至200毫升
pH
X
Y
2.0
2.4
2.6
2.8
50
44.0
32.4
24.2
16.8
3.0
3.2
3.4
3.6
11.4
8.2
6.4
5.0
甘氨酸分子量=75.07，0.2mol/L甘氨酸溶液含15.01克/升。
2．邻苯二甲酸–盐酸缓冲液（0.05mol/L）
X毫升0.2mol/L邻苯二甲酸氢钾+0.2mol/LHCl，再加水稀释到20毫升
pH（20℃）
2.2
5
4.070
3.960
3.295
2.642
2.022
3.8
1.470
0.990
0.597
0.263
邻苯二甲酸氢钾分子量=204.23，0.2mol/L邻苯二甲酸氢溶液含40.85克/升
3．磷酸氢二钠–柠檬酸缓冲液
0.2mol/LNa2HPO4
（毫升）
0.1mol/L
柠檬酸
（毫升）
4.0
4.2
4.4
4.6
4.8
0.40
1.24
2.18
3.17
4.11
4.94
5.70
6.44
7.10
7.71
8.28
8.82
9.35
9.86
10.30
10.60
18.76
17.82
16.83
15.89
15.06
14.30
13.56
12.90
12.29
11.72
11.18
10.65
10.14
9.70
5.2
5.4
5.6
5.8
6.0
6.2
6.6
6.8
7.0
7.2
7.4
7.6
7.8
8.0
10.72
11.15
11.60
12.09
12.63
13.22
13.85
14.55
15.45
16.47
17.39
18.17
18.73
19.15
19.45
9.28
8.85
8.40
7.91
7.37
6.78
6.15
5.45
4.55
3.53
2.61
1.83
1.27
0.85
0.55
Na2HPO4分子量=14.98，0.2mol/L溶液为28.40克/升。
Na2HPO4·
2H2O分子量=178.05，0.2mol/L溶液含35.01克/升。
C4H2O7·
H2O分子量=210.14，0.1mol/L溶液为21.01克/升。
4．柠檬酸–氢氧化钠-盐酸缓冲液
钠离子浓度
（mol/L）
柠檬酸（克）
C6H8O7·
H2O
氢氧化钠（克）
NaOH97%
盐酸（毫升）
HCl（浓）
最终体积（升）①
3.1
3.3
4.3
5.3
6.5
0.20
0.35
0.45
0.38
210
245
285
266
84
83
144
186
156
160
116
106
45
68
105
126
10
①
使用时可以每升中加入1克克酚，若最后pH值有变化，再用少量50%
氢氧化钠溶液或浓盐酸调节，冰箱保存。
5．柠檬酸–柠檬酸钠缓冲液（0.1mol/L）
0.1
mol/L
柠檬酸钠
18.6
17.2
16.0
14.9
14.0
13.1
12.3
10.3
9.2
1.4
5.1
6.9
7.7
8.6
9.7
10.8
7.3
5.5
4.7
11.8
12.7
13.6
14.5
15.3
16.2
18.0
柠檬酸C6H8O7·
H2O：
分子量210.14，0.1mol/L溶液为21.01克/升。
柠檬酸钠Na3C6H5O7·
2H2O：
分子量294.12，0.1mol/L溶液为29.41克/毫升。
6．乙酸–乙酸钠缓冲液（0.2mol/L）
pH（18℃）
0.2
NaAc
0.3
HAc
NaAc
HAc
0.75
1.20
1.80
2.65
3.70
4.90
9.25
8.80
8.20
7.35
6.30
5.10
5.90
7.00
7.90
8.60
9.10
9.40
4.10
3.00
2.10
1.40
0.90
0.60
Na2Ac·
3H2O分子量=136.09，0.2mol/L溶液为27.22克/升。
7．磷酸盐缓冲液
（1）磷酸氢二钠–磷酸二氢钠缓冲液（0.2）
Na2HPO4
NaH2PO4
mol/L
Na2HPO4
5.9
6.1
6.3
6.7
10.0
15.0
18.5
22.5
26.5
31.5
37.5
43.5
49.5
55.0
92.0
90.0
87.7
85.0
81.5
77.5
73.5
68.5
62.5
56.5
51.0
45.0
7.1
7.5
7.9
61.0
67.0
72.0
77.0
81.0
84.0
87.0
89.5
91.5
93.0
94.7
39.0
33.0
28.0
23.0
19.0
13.0
10.5
8.5
2H2O分子量=178.05，0.2mol/L溶液为85.61克/升。
12H2O分子量=358.22，0.2mol/L溶液为71.64克/升。
2H2O分子量=156.03，0.2mol/L溶液为31.21克/升。
（2）磷酸氢二钠–磷酸二氢钾缓冲液（1/15mol/L）
mol/L/15Na2HPO4
mol/L//15KH2PO4
mol/L//15Na2HPO4
4.92
5.29
5.91
6.24
6.47
6.64
6.81
6.98
0.10
0.50
1.00
2.00
4.00
5.00
6.00
9.90
9.50
9.00
8.00
7.17
7.38
7.73
8.04
8.34
8.67
8.18
9.75
10.00
0.25
2H2O分子量=178.05，1/15M溶液为11.876克/升。
KH2PO4分子量=136.09，1/15M溶液为9.078克/升。
8．磷酸二氢钾–氢氧化钠缓冲液（0.05M）
X毫升0.2MK2PO4+Y毫升0.2NNaOH加水稀释至29毫升
pH（20℃）
X（毫升）
Y（毫升）
0.372
0.570
0.860
1.260
1.780
2.365
2.963
3.500
3.950
4.280
4.520
4.680
9．巴比妥钠-盐酸缓冲液（18℃）
0.04M巴比妥钠溶液
0.2V盐酸
0.04M巴比妥钠溶液（毫升）
0.2N盐酸（毫升）
18.4
17.8
16.7
13.4
11.47
9.39
7.21
8.4
8.8
9.0
9.4
9.6
5.21
3.82
2.52
1.65
1.13
0.70
巴比妥钠盐分子量=206.18;
0.04M溶液为8.25克/升
10．Tris–盐酸缓冲液（0.05M，25℃）
50毫升0.1M三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶液与X毫升0.1N盐酸混匀后，加水稀释至100毫升。
X（毫升）
7.20
7.30
7.40
7.50
7.60
7.70
7.80
45.7
44.7
43.4
42.0
40.3
38.5
36.6
34.5
32.0
29.2
8.10
8.30
8.50
8.70
8.90
26.2
22.9
19.9
14.7
12.4
三羟甲基氨基甲烷（Tris）HOCH2CH2OH
CHOCH2NH2
分子量=121.14;
0.1M溶液为12.114克/升。
Tris溶液可从空气中吸收二氧化碳，使用时注意将瓶盖严。
11．硼酸–硼砂缓冲液（0.2M硼酸根）
0.05M硼砂（毫升）
0.2M硼砂（毫升）
0.2M硼酸（毫升）
1.0
1.5
8.7
3.5
4.5
硼砂Na2B4O7·
H2O,分子量=381.43;
0.05M溶液（=0.2M硼酸根）含19.07克/升。
硼酸H2BO3,分子量=61.84,0.2M溶液为12.37克/升。
硼砂易失去结晶水，必须在带塞的瓶中保存。
11．硼酸-硼砂缓冲液（0.2M硼酸根）
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