蚕药临床试验技术规范.docx

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蚕药临床试验技术规范

蚕用消毒剂药效评价试验技术指导原则

一、概述

（一）定义与目的

蚕用消毒剂药效评价试验技术指导原则是为蚕用消毒剂进行临床试验制定的。

蚕用消毒剂临床消毒效果评价以家蚕为主要对象，其目的是为了评价一种蚕用消毒剂是否对家蚕病原微生物具有消毒（杀灭）作用，并确定临床应用的推荐用法与用量。

广谱蚕用消毒剂必须对本指导原则中列出的所有菌、毒种进行消毒试验，专用消毒剂可选择1种或几种菌、毒种进行试验。

（二）适用范围

本指导原则适用于蚕室蚕具消毒剂、蚕用烟熏剂和桑叶叶面消毒剂对各种病原体的消毒效果评价。

二、试验设计

（一）试验用蚕

1.品种：

用一化性或二化性的现行普通四眠蚕品种，所用蚕种为杂交种。

2.来源：

有生产许可证单位生产的合格蚕种。

（二）试验材料

1.受试药物及来源：

受试药物应与拟上市的制剂完全一致，有完整的产品质量标准，有合乎规定格式的说明书。

受试药物应来源于同一批号，由申报单位自行研制并在GMP验收合格的车间生产的样品，并提供中国兽医药品监察所或农业部认定的其他兽药检验机构出具的产品检验合格报告。

2.标准培养基：

下列标准培养基和稀释液用于试验菌、毒种的制备。

营养肉汤培养基、营养琼脂培养基、稀释液（胰蛋白胨生理盐水溶液）、沙堡液体培养基、沙堡琼脂培养基、有机干扰物（3%牛血清白蛋白）。

上述培养基配方参见附录A。

3.试验菌、毒种

应采用大学或省级以上专业研究机构鉴定保藏的菌种。

如果采用自然感染病例分离的菌株，应详细记录其来源，并应经有资质的部门鉴定方可用于试验。

试验菌、毒种的制备、计数、保藏及试验菌片的制备等见附录B。

（三）残留消毒剂的去除和中和剂选择

观察药物的杀菌（消毒）作用时，必须在药物与菌体接触一定时间后立即去除菌体周围的药物或消除药物的杀菌作用。

去除残留消毒剂的方法可用化学中和法和离心沉淀法等。

1.化学中和法

是目前最常用的一种方法。

做法是向标本回收液中加入适当量的中和剂，使消毒剂浓度得到稀释，并且消毒作用受到化学中和。

中和剂选择试验方法见附录C。

2.离心沉淀法

将消毒处理后的标本用磷酸盐缓冲液反复离心洗涤3次，最后将沉淀物转种到合适培养基上进行培养。

无论用何种方法，事先必须用实验证明该法可中止消毒剂的作用且对实验菌、毒种无抑制作用，对培养基无不良影响。

（四）试验分组

进行蚕用消毒剂试验时应分以下各组。

1.空白对照（不感染不处理）组。

2.感染不处理组（阴性对照组）：

根据各种试验的规定，用稀释液代替消毒剂溶液，按试验组同样的方法进行试验。

所得结果代表菌液原有浓度，以其作为计算杀灭对数或灭活率的初始浓度。

3.试验组：

根据本原则中所列试验菌、毒种，选定所有的试验菌种和不同消毒剂浓度以及作用时间进行试验；如试验目的是研制专用的蚕用消毒剂，根据本原则中所列试验菌、毒种，选定相应的试验菌、毒种和不同消毒剂浓度以及作用时间进行试验。

4.药物对照组（阳性对照组）。

每个组设3个重复，每个重复（单元）用50条2龄起蚕。

（五）试验方法

蚕用消毒剂进行消毒试验时，常用的试验方法有：

悬液定量杀灭试验、载体浸泡定量杀灭试验、载体喷雾定量杀灭试验和烟熏定量杀灭试验等。

进行蚕室蚕具消毒剂研制时，一般采用悬液定量杀灭试验或载体浸泡定量杀灭试验；或追加载体喷雾定量杀灭试验；进行烟熏剂研制时，采用烟熏定量杀灭试验。

1.细菌芽孢消毒试验

进行细菌芽孢消毒试验时，有下列4种方法可供选择，按测试目的选择1种方法进行试验。

（1）悬液定量杀灭试验操作程序

消毒液配制：

首先按试验设计或产品说明书要求配制消毒液。

无特殊说明者，一律使用无菌硬水配制，配制的浓度为待测浓度的1.25倍（例如要评价的消毒液浓度为200mg/L，则应配制250mg/L），置20℃±1℃水浴备用。

试验菌液配制：

按照“附录B试验菌、毒种的制备、计数、保藏及试验菌片的制备”规定的方法配制实验用菌悬液，浓度为1×108cfu/ml～5×108cfu/ml。

消毒处理：

取消毒试验用无菌大试管，先加入0.5ml试验用菌悬液，再加入0.5ml有机干扰物，混匀，置20℃±1℃水浴中5min后，用无菌吸管吸取上述浓度消毒液4.0ml注入其中，迅速混匀并立即记时。

中和：

待试验菌与消毒剂相互作用至各预定时间，分别吸取0.5ml试验菌与消毒剂混合液加于4.5ml经灭菌的中和剂中，混匀。

活菌计数：

各管试验菌与消毒剂混合液经加中和剂作用10min后，分别吸取1.0ml样液，按活菌培养计数方法测定存活菌数，每管样液作两次活菌计数即可。

如平板上生长的菌落数较多时，可进行系列10倍稀释后，再进行活菌培养计数。

对照：

同时用稀释液代替消毒液，进行平行试验，作为感染不处理组（阴性对照组）。

以不作任何处理的作为空白对照组。

培养与观察：

所有试验样本均在37℃温箱中培养，培养72h观察最终结果。

重复与计量：

试验重复3次，计算各组的活菌浓度（cfu/ml），并换算为对数值（N），然后按下式计算杀灭对数值:

杀灭对数值（KL）＝对照组平均活菌浓度的对数值（No）－试验组活菌浓度对数值（Nx）

计算杀灭对数值时，取小数点后两位值，可以进行数字修约。

如果消毒试验组消毒处理后平均生产菌落数，小于等于1时，其杀灭对数值，即大于等于对照组平均活菌浓度的对数值。

（2）载体浸泡定量杀灭试验操作程序

消毒处理：

取无菌小平皿，标明所注入消毒液的浓度。

按每片5.0ml的量，吸取相应浓度的消毒剂溶液注入平皿中。

将盛有消毒剂的平皿置20℃±1℃温箱内5min后，用无菌镊子分别放入预先制备的菌片3片，并使之浸透于消毒液中。

中和与活菌计数：

待菌药相互作用至各预定时间，用无菌镊子将菌片取出分别移入一含5.0ml中和剂试管中。

用电动混合器混合20s，或将试管在手掌上振敲80次，使菌片上的细菌被洗脱进入中和液中，再放置5min以上，使中和作用充分。

最终进一步混匀后，吸取1.0ml直接接种平皿，每管作两次活菌计数，测定存活菌数。

对照：

另取无菌小平皿，按每片5.0ml的量，吸取相应的稀释液注入平皿中，置20℃±1℃温箱内5min后，用无菌镊子分别放入预先制备的菌片3片，并使之浸透于稀释液中，进行平行试验，作为感染不处理组（阴性对照组）。

以不作任何处理的作为空白对照组。

培养与观察：

所有试验样本均在37℃温箱中培养，培养72h观察最终结果。

重复与计量：

试验重复3次（包括对照），计算各组的活菌量（cfu/片），并换算为对数值（N），然后按“悬液定量杀灭试验”中的公式计算杀灭对数值。

（3）载体喷雾定量杀灭试验操作程序

选定消毒剂的浓度与作用时间：

根据所试菌种和消毒剂对该菌的杀灭能力，选定1个消毒剂浓度（试验设计中设定的浓度）和至少3个不同作用时间进行试验。

载体设置：

试验时，每种载体菌片各取3片，以等边三角形或三角形阵列，均匀排布于一未沾有任何消毒剂的清洁无菌玻璃板上（如无菌平皿内）。

消毒处理：

每批试验以同一浓度消毒剂溶液对上述排列的菌片进行均匀喷雾。

每次喷雾的距离和压力保持一致，以尽量使喷到菌片上的雾粒大小和数量一致。

喷雾量以不使菌片湿透、流液为度。

中和与活菌计数：

待试验菌与消毒剂相互作用至各规定时间，取每种载体菌片1片，各放入一含5.0ml中和剂的无菌试管中。

将试管用电动混合器混合20s，或在手掌上振敲80次，使菌片上细菌被洗脱进入中和液中。

吸取1.0ml上述洗脱液，按活菌培养计数方法测定存活菌数，每管作两次活菌计数。

每批试验均应换一块未沾有任何消毒剂的清洁无菌玻璃板。

喷雾器换装新浓度消毒剂前，应将原残留消毒剂洗净，再换装新浓度消毒剂。

对照：

用稀释液代替消毒液，按同样的喷雾方法进行处理，进行平行试验，作为感染不处理组（阴性对照组）。

以不作任何处理的作为空白对照组。

培养与观察：

所有试验样本均在37℃温箱中培养，培养72h观察最终结果。

重复与计量：

试验重复3次，计算各组的活菌数（cfu/片），并换算为对数值（N），然后按“悬液定量杀灭试验”中的公式计算杀灭对数值。

（4）烟熏定量杀灭试验操作程序

根据试验设计或产品说明书的要求，选定试验菌种与消毒剂的浓度和作用时间进行试验。

熏烟容器：

烟熏定量杀灭试验在一个容积为1m3正方形的密闭箱子内进行，箱子的每个内壁都安装有宽约20cm的平台，分三层，供消毒时放置菌片用。

如需要特定的温度条件，试验时箱子内的温度必须达到要求的温度。

试验时，每种载体菌片各取12片，分上、中、下三层放置，每片菌片放置在一清洁无菌玻璃板上（如无菌平皿内），每层4片菌片，分别放在不同的平台上。

消毒处理：

每批试验根据试验设计的要求进行，如该产品注明必须利用烟雾进行消毒，要做到消毒时无明火，且药剂发烟充分彻底。

中和与活菌计数：

待试验菌与消毒剂相互作用至各规定时间，打开箱子，分别从每层取载体菌片1片（共3片），一起放入一含5.0ml中和剂的无菌试管中。

将试管用电动混合器混合20s，或在手掌上振敲80次，使菌片上细菌被洗脱进入中和液中。

吸取1.0ml上述洗脱液，按活菌培养计数方法测定存活菌数，每管作两次活菌计数。

对照：

在相同的温度下将菌片放置在不作消毒处理的箱子内相同时间，进行平行试验，作为感染不处理组（阴性对照组）。

以不作任何处理的作为空白对照组。

培养与观察：

所有试验样本均在37℃温箱中培养，培养72h观察最终结果。

重复与计量：

试验重复3次，计算各组的活菌数（cfu/片），并换算为对数值（N），然后按“悬液定量杀灭试验”中的公式计算杀灭对数值。

（5）评价规定

产品申报新蚕用消毒剂时，要求在产品说明书指定的浓度与3个作用时间，重复试验3次。

在产品指定最低浓度与最短作用时间，以及最短作用时间的1.5倍时，要求悬液定量杀灭试验中各次的杀灭对数均应≥5.00。

要求载体浸泡定量杀灭试验、载体喷雾定量杀灭试验和烟熏定量杀灭试验中，各次的杀灭对数均应≥3.00，可判定为消毒合格。

在产品指定浓度与最短作用时间的0.5倍时，可容许在部分重复次数中，出现不合格结果。

产品鉴定时，在产品说明书指定的最低浓度与最低作用时间，重复试验3次。

要求悬液定量杀灭试验中，各次的杀灭对数值均≥5.00，可判定为消毒合格。

要求载体浸泡定量杀灭试验、载体喷雾定量杀灭试验和烟熏定量杀灭试验中，各次的杀灭对数值均≥3.00，可判定消毒合格。

报告中应将各次试验的结果全部以表格的形式列出。

感染不处理组（阴性对照组）应列出各次试验菌浓度，以及平均试验菌浓度。

试验组应列出杀灭对数值，杀灭对数值大于5.00时，应表示为≥5.00，而不必列出具体的数字；杀灭对数值小于5.00时，应列出具体的数字（例如2.58，4.65）。

（6）注意事项

试验中所使用的中和剂、稀释液和培养基等，各批次均应进行无菌检查，发现有菌生长，则全部试验需换用未污染试剂或培养基重做。

悬液定量杀灭试验时，有机干扰物一般采用3%（W/V）牛血清白蛋白贮存溶液，取0.5ml加入到消毒体系中（稀释10倍），进行消毒试验。

如果某消毒剂使用说明书中规定，产品只用于清洁物品或器械的消毒或只作清洗消毒，可采用0.3%（W/V）牛血清白蛋白贮存溶液，取0.5ml加入到消毒体系中（稀释10倍），进行消毒试验。

进行烟熏定量杀灭试验时要密切观察，防止明火产生，注意安全。

2.真菌消毒试验

（1）试验程序

常用杀灭试验有：

悬液定量杀灭试验、载体浸泡定量杀灭试验、载体喷雾定量杀灭试验、烟熏定量杀灭试验等。

选择的试验菌种一般为白僵菌和黄曲霉，试验用培养基一般为沙堡琼脂培养基和沙堡液体培养基。

其操作程序同“细菌芽孢消毒试验”。

活菌培养计数时，对白僵菌，在25℃培养箱中培养24h~72h观察最终结果。

对黄曲霉，在30℃培养箱中培养24h~72h观