医学免疫学实验指导.docx

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医学免疫学实验指导

医学免疫学实验指导

（供医学、药学各专业使用）

主编：

刘彦平

编委：

邵嘉会陆东明李萍高翔

青海大学医学院病原生物学与免疫学教研室

2008年10月

前言

医学免疫学是医学院校必设的基础课程之一，按教学大纲要求医学免疫学的实验课时占总学时的1/3左右，说明该学科具有理论与实践紧密结合的特点及实验教学在学科中的重要性。

本课程设置要求学生不仅要掌握基础理论、基本知识，而且要学习和掌握各项基本技能。

据此，我们编写出《医学免疫学实验指导》一书，力求规范实验教学，从整体提高教学水平和教学质量。

本书结合教学工作实际，共编写14个实验项目，每个实验说明实验目的，实验原理，实验内容方法，实验要求及注意事项，并附有一定量的思考题。

本书依教学进程安排实验次序，可帮助学生巩固基础理论知识，培养学生基本技能，提高教学效果。

免疫学和免疫学技术的发展日新月异，医学教育的改革不断向纵深发展，限于编者的学术及认识水平，本书难免存在缺点和不足。

为此，希望广大师生对本书提出宝贵意见，以便及时加以改进。

编者

2008年10月

实验室规则

实验是映证理论，对学生进行基本技能训练和培养科学研究能力的手段，为

保证实验效果，同时避免病原微生物的实验室内传染，保障实验操作者的安全，特制定如下规则：

一、学生在实验课前，应认真预习所要进行实验的内容，明确实验目的，了解实验原理，熟悉所要使用的仪器、药品的性质及操作程序，如有疑问，应事先请教指导教师。

二、尽量不带个人生活、学习用品入实验室，必须要带的物品如书本、文具应放在远离实验操作的指定位置。

三、进入实验室应穿白大衣，离开时将白大衣脱下并反折叠带走，在实验室内应保持安静，遵守秩序，不得大声喧哗，随便走动或拆卸仪器、搬弄标本。

四、实验室内禁止吸烟、进食及饮水，严禁用嘴吸移液及湿润标签，尽量不要用手触摸头面部及身体其他暴露部位。

五、如遇不慎而打破菌种管或使有菌材料污染皮肤、衣物、桌面等情况，应及时报告指导教师，切勿隐瞒或自行处理。

六、实验中所被污染过的器材、物品及其他盛过有菌物的容器、应用完后立即投入已准备的消毒剂（如来苏尔、氯胺液）中，不可随意仍放。

七、注意观察分析实验结果，独立思考解决实验中所遇到的问题，要严格按操作程序进行实验。

八、要爱护公共财物，节约水电及试剂材料，不得将实验物品私自带出实验室。

如遇仪器、用品损坏，应报告指导教师并按规定予以赔偿。

九、实验结束后，应清理实验用品，实验废弃物（包括实验动物尸体）应收入或倒入指定的地方和容器内。

每一同学均应服从卫生值日安排，认真负责地做好清洁卫生。

十、离开实验室前，应用84消毒液将双手浸泡5—10分钟，然后用清水洗净。

最后离开的同学应注意关水、关电、关窗、关门。

如有借用的物品和仪器要及时归还。

实验一显微镜的结构与使用

【实验目的】

1.熟悉光学显微镜的结构和成像原理。

2.掌握普通光镜的使用方法，尤其是油镜的正确使用。

3.了解暗视野、相差显微镜的原理和使用方法。

【实验用品】

1.器材：

普通光学显微镜、暗视野显微镜、相差显微镜、香柏油、二甲苯、擦镜纸。

2.标本：

细菌革兰染色玻片标本、普通变形杆菌24h内培养液、啤酒酵母新鲜培养的活标本。

【内容和方法】

一、普通光学显微镜的结构和使用方法

微生物是肉眼看不见而必须借助于光学或电子显微镜将其放大数百乃至数万倍才能观察到的微小生物，因此显微镜是认识和研究微生物最重要和最基本的工具之一。

因此，掌握其使用方法是进行微生物研究的基本技能。

1.普通光镜的基本结构

普通光镜无论其外观形状如何，它都由两大部分组成，即机械装置部分和光学系统部分。

机械部分包括镜座、镜臂、载物台及台上的标本推进器、镜筒、物镜转换盘以及升降调节器等，其主要作用是支撑、固定镜头、调节物象焦距、搁置和移动标本。

光学系统包括反光镜、聚光器、物镜和目镜。

它的作用是收集光源并聚集于标本上，然后通过透镜放大成像映与眼帘，是肉眼本不能分辨的物体得以清楚观察（图1-1）。

图1-1光学显微镜的结构

光学系统是光学显微镜的核心部分，而物镜又是其中最重要的部件。

一般的光镜配有3-4个物镜，有10倍的低倍镜、40倍的高倍镜和100倍的油浸镜（有的配有一个4倍的物镜头）。

标本的放大主要靠物镜。

为了使用方便，常用红、黄、蓝、白的色圈分别标记物镜倍数。

另外，在镜头上还刻有一些符号和数值，低倍镜上刻有10/0.25、160，10指放大倍数，0.25指镜口率（N.A），160表示镜筒长度（mm）。

高倍镜刻有40/0.65和160/0.17，40为放大倍数，0.65指镜口率，160表示镜筒长度，0.17则表示使用时所要求盖玻片的厚度。

油镜上刻有100/1.25和160/0.17，该数值也表示放大倍数、镜口率、镜筒长度、盖玻片厚度，除此之外，油镜头上还常刻有一个“油”或“oil”字。

2.普通光镜的使用方法

（1）对光和调焦：

首先将显微镜平置于实验台上，转动物镜转换器使低倍镜与镜筒垂直到位（听到“咔”声即可），然后将反光镜凹面对着光源翻动，侧面观察聚光器明亮或从目镜观察视野明亮即说明对光完成。

如果此时虽对光较好却是也不够明亮时，应检查聚光器的光圈是否打开，聚光器是否升至最高。

对好光后即将标本置于载物台上的标本夹中（注意标本面向上），先用低倍镜观察。

用粗调节器调出物像后，再用细调节器调出清晰物像。

在换高倍镜观察时，由于高倍镜视野范围比低倍镜小，故须先将观察内容移至视野中央后再换之。

有时显微镜存在偏心现象，此时要记住其偏心的方向和距离。

（2）油镜的原理、使用、保护

在免疫学中主要使用的是油镜。

油镜是因为在使用时需用香柏油等作介质而得名。

光学显微镜的放大倍数与玻璃透镜的大小有关。

油镜的透镜小，镜孔也小，观察时由于聚光器聚集的光源要通过载玻片、空气，才能进入物镜中。

玻璃与空气的折光率不同，会产生折射，使一部分光线失掉，进入物镜的光线减少，致使观察视野暗淡，物像不清。

如果使用折射率与玻璃相近的油介质，即可减少折射，增加视野亮度，提高分辨率。

如图1-2所示。

图1-2油镜头使用原理

最常用的油介质为香柏油和石蜡油，其折光率分别为1.515和1.46，与玻璃的折光率1.52相近似（空气为1）。

故可达到上述减少折射，增加光亮度的效果。

使用油镜时应先将集光器升至最高，光栅增至最大。

转开物镜镜头，在玻片上加一滴镜油，再转换油镜头。

眼从侧方看，调节粗调节器，使镜头浸入镜油中，以轻轻接触玻片为止（注意勿压碎玻片）。

眼看目镜，调节粗调节器缓慢下降载物台，看到物像，立即停止，改用细调节器调出清晰物像。

观察结束后，应用擦镜纸蘸少许二甲苯擦拭油镜头，再用于擦镜纸擦去残存二甲苯。

下降集光器，竖起反光镜，将物镜镜头摆成“八”字型，对号送入镜盒内。

二、暗视野显微镜和相差显微镜简介

观察暗视野显微镜和相差显微镜实物或图片。

暗视野显微镜是将普通光学显微镜换装上特制的暗视野聚光器或者在普通光镜聚光器上加一个中央遮光板改装而成。

使用暗视野聚光器或光板，光线不能通过聚光器的中心部位透入物镜；而只能从周边斜射经标本反射进入物镜，因此视野背景是暗的，标本成为亮点。

使用暗视野显微镜可检查不经染色，在普通显微镜下不易看清的活体微生物，如活的细菌、螺旋体等，它的缺点是不能观察生物体的内部结结构。

相差显微镜也称相衬显微镜。

相差显微镜具一个特殊的由环状光圈和聚光镜组合的转盘聚光镜和一组特别的相差物镜（内装相位板），能使直射光和绕射光产生干涉，改变其光相与振幅，形成明暗差，增强观察物体的立体感，并使细胞的内部构造清晰，因而可观察活体微生物的形态及某些内部细微结构。

【注意事项】

1.取送显微镜时动作要轻，一只手托镜座，一只手持镜臂，防止反光镜、目镜、物镜等脱落损坏。

2.油镜用后一定要擦洗，以防止油干影响其使用寿命。

注意擦镜时一定要用专用擦镜纸。

3.使用油镜时，一定要等标本干后才能加香柏油。

滴油时应避免气泡形成。

【实验报告与思考题】

1.为什么用油镜要等标本片干后才能滴加香柏油？

2.油镜有哪些标志？

如何使用油镜？

3.如果视野中光线太强或太弱，应该怎么做？

4.用油镜观察革兰染色细菌标本并绘图。

实验二白细胞的吞噬及溶菌酶试验

【实验目的】

1.熟悉白细胞的吞噬及溶菌酶试验的原理和方法。

2.通过本实验理解机体的非特异性免疫机制。

【实验原理】

机体内具有吞噬功能的细胞大致分为两大类，即小吞噬细胞和大吞噬细胞。

小吞噬细胞一般指血液中的中性粒细胞，大吞噬细胞则是存在于组织中的巨噬细胞和血液中的大单核细胞。

它们构成机体天然防御机能。

本实验通过体外或动物体内的细胞吞噬及溶菌酶试验，以证实机体的非特异性免疫机制。

【实验用品】

1.器材：

显微镜、载玻片、厚凹玻片、接种环、采血针、滴管、湿盒、恒温培养箱、注射器、针头、打孔器、平皿、酒精灯、火柴。

2.材料、试剂：

3.8％枸橼酸钠、2％碘酒、75％酒精、瑞氏染液、蒸馏水、6％可溶性淀粉、1％鸡红细胞悬液、溶壁微球菌（100mg／m1）、l／15mol／L磷酸盐缓冲液（pH6.4）、琼脂、标准溶菌酶（100ug／m1）、新鲜鸡蛋清（1:

10）、生理盐水、香柏油。

3.菌种：

白色葡萄球菌24小时斜面培养物。

4.动物：

小白鼠

【内容和方法】

一、小吞噬试验（中性粒细胞吞噬功能试验）

1.方法

（1）取厚凹玻片一片，在凹孔中用滴管加入一滴3.8％枸橼酸钠溶液。

（2）依次用碘酒、酒精消毒手指或耳垂及采血针后，从消毒部位采取三大滴血加入凹孔中混匀。

（3）将接种环烧灼灭菌后，刮取少许白色葡萄球菌置于凹孔血液中搅匀。

（4）将上述凹玻片放人湿盒，于37℃温箱中作用45分钟，注意每15分钟混匀一次。

（5）取出凹玻片，用烧灼灭菌的接种环将凹孔中血液搅匀后取血3—4环于载玻片上，用另一载玻片推成薄血片。

接种环烧灼灭菌后放回原处。

（6）待血片自干后，用瑞氏染液染色。

用吸管取瑞氏染液数滴滴于上述血片上先染1分钟。

然后加等量缓冲液，轻轻晃动混匀，继续染5分钟后水洗，用吸水纸吸干后镜检。

2.结果分析

油镜检查，先寻找白血球，观察胞浆中有无吞噬的细菌。

如结果正确可见染成紫色的细胞核及被吞噬的细菌，细胞桨则为淡红色。

随机计数100个中性白细胞，记录发生吞噬和未发生吞噬的白细胞数，计数吞噬细胞百分率。

二、大吞噬试验

1.试剂配制

（1）6％可溶性淀粉肉汤：

取肉汤培养基100ml，加入可溶性淀粉6g，混匀后煮沸灭菌，冷却后置4℃冰箱保存（只能保存一周）。

使用时37℃水浴溶解。

（2）1％鸡红细胞悬液：

取肝素抗凝鸡血1m1，加生理盐水99ml混合。

2.方法

（1）试验前3天，于小白鼠腹腔内注射6％可溶性淀粉肉汤lml（注射时切勿刺伤内脏）。

（2）试验当天，于每只小白鼠腹腔内注射1％鸡红细胞悬液lml并轻揉腹部。

（3）注射后30分钟，用注射器吸取腹腔液少许，置于洁净载玻片上，推成涂片、晾干。

用瑞氏染液染色。

（4）油镜观察小白鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞现象（鸡红细胞为有核红细胞），并计算吞噬细胞的百分率。

瑞（Wright）氏染液：

瑞氏染粉0.1g，甲醇60ml，先将染粉置研钵内加少量甲醇研磨，然后加入全部甲醇。

配好的染液要装瓶塞紧，置二周后使用。

三、溶菌酶测定

1.试剂配制

（1）溶壁微球菌菌液的制备：

菌种于使用前先在琼脂斜面上传代一次，然后接种于琼脂斜面培养基中，37℃培养24小时后收集菌苔，称重、用pH6.4磷酸盐缓冲液配成100mg／ml菌液。

经70℃水浴l小时杀菌，放置4℃冰箱备用。

（2）pH6.41／15mol/L磷酸盐缓冲液（沙伦生PBS）：

甲液：

无水Na2HPO49．46g溶于1000ml蒸馏水。

乙液：

无水KH2PO49．078g溶于1000ml蒸馏水。

然后