生化工艺理论课复习资料.docx

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生化工艺理论课复习资料

生化工艺理论课复习提纲

第一章绪论

•1.生物技术产品的特点

•

（1）生物活性－结构复杂

•

（2）分布广泛－胞内胞外

•（3）原始浓度偏低

•（4）组分复杂

•（5）产物稳定性差批间差异大

•（6）质量要求高（生物医药）

•（7）经济性

•

•2.生物分离纯化技术的特点

•

（1）环境复杂、分离纯化困难

•

（2）含量低、工艺复杂

•（3）稳定性差、操作要求严格

•（4）目标产物最终的质量要求很高

•（5）终极产品纯度的均一性与化学分离上纯度的概念并不完全相同

•（6）操作条件（环境）严格、无菌或密封

•3.生物分离纯化技术选择依据

•目标产物与杂志之间的生物学和物理化学性质上的差异

•

•4.以发酵液为例，生物分离纯化的一般工艺流程

•

第二章发酵液的预处理

•1.发酵液预处理目的

（1）改变料液性质,促进固液分离，提高分离效率

（2）除去部分杂质（杂蛋白和不溶性的多糖等），以利后续操作

（3）尽可能使产物转移到后处理的相（液）中，利于提取和精制的顺利进行。

•2.常见发酵液预处理方法

•①过滤特性的改善

•a、加热（降低黏度、去除杂蛋白）

•b、pH、稀释

•c、凝聚与絮凝（增大粒度）

•d、加助滤剂（改善过滤）

•②杂质的去除

•a、去杂蛋白（等电点、变性剂、吸附）

•b、去多糖（酶解）

•c、去离子（沉淀）

•

•3.凝聚、絮凝与盐析

联系：

絮凝、凝聚和盐析都是使蛋白质等胶体从溶液中析出的方法，但其原理和方法有所不同。

区别：

絮凝是指通过聚电解质的架桥作用，将溶液中的蛋白质连接起来，增大蛋

白质的尺度而不是蛋白沉淀。

凝聚和盐析虽然都是采用无机盐使蛋白质沉淀，但凝聚所用的是含有高价离子的无机盐，主要是由于蛋白质与带相反电荷的高价离子发生电荷中和作用而使得蛋白质聚集沉淀，所以凝聚所需的盐浓度很低。

而盐析使用的是中性盐，主要依靠盐离子的亲水性，夺走与蛋白质亲和的水而沉淀，因而盐析通常需要较高的盐浓度。

•4.助滤剂-定义、原理

•

（1）定义：

•助滤剂是一种质地坚硬、颗粒均匀，不可压缩的，具有吸附胶体能力的惰性物质。

•

（2）原理：

•助滤剂具有吸附胶体能力，可以改变滤饼的结构（使其成网状），降低滤饼的可

•压缩性（可压缩变成部分可压缩），从而降低过滤的阻力，加快过滤速度。

•

•5.改善过滤的方法

•a.降低黏度：

加水稀释和加热

•b.调整pH

•c、加入反应剂

•d、加入助滤剂

•e、增大悬浮颗粒体积

•f、操作条件的改变

•6.错流过滤（定义）：

悬浮液在过滤介质表面做切向流动，利用流动的剪切作用将过滤介质表面的固体带走的方

•1.细胞破碎的定义、方法有哪些？

•定义：

用物理、化学、酶或机械的方法破坏细胞壁或细胞膜。

•方法：

•

（1）机械破碎：

高压匀浆法、珠磨法、超声波破碎法、X-press法

•

（2）非机械破碎：

酶溶法、化学试剂法、渗透压冲击法、反复冻融法、干燥法

•

•2.高速球磨与高压匀浆的影响因素

•高速球磨：

⑴搅拌速度－适中

•a.破碎速率与外缘速度成正比（一定范围）

•b.外缘速度增加，热量与消耗的功率增加，产物失活率增加

•⑵细胞浓度－最佳

•⑶珠粒的大小、用量

•a.珠粒越小，细胞破碎速度越快（太小，易于漂浮）－0.2mm。

•b.用量越多，细胞破碎速度越快（80－90％填充密度）

•⑷T－5-40℃⑸流量－小（6）微生物

•高压匀浆：

a.Tb.操作压力

•

•3.细胞破碎方法的选择依据

•

（1）目标生化物质的位置：

•

（2）目标生化物质对破碎条件的敏感性：

•（3）破碎程度、目的

•（4）规模、经济

•4.各破碎方法的原理及应用

•

•5.包涵体（定义）

细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成无活性的固体颗粒

第三章固相析出分离技术

•1.可逆沉淀与不可逆沉淀

•可逆沉淀：

等电点沉淀、盐析法、有机溶剂沉淀；

•不可逆沉淀：

热变性沉淀、重金属盐沉淀、有机酸沉淀

•

•2.盐析-定义、原理及影响因素

•盐析：

在高浓度的中性盐存在下，蛋白质（酶）等生物大分子物质

•在水溶液中的溶解度随盐浓度的升高会急剧下降，并产生沉淀，

•这种现象称为盐析。

盐析原理a.盐亲水性大于pr亲水性－破坏水化模

•b.盐离子中和pr分子表面电荷，静电斥力减弱。

•影响因素：

•盐饱和度的影响、样品浓度的影响、ph的影响、温度的影响

•影响因素：

•

（1）溶质种类的影响：

•

（2）溶质浓度的影响：

•蛋白质浓度大，盐的用量小，共沉作用明显，分辨率低；

•蛋白质浓度小，盐的用量大，共沉作用小、分辨率高

•（3）pH值：

影响蛋白质表面净电荷的数量

•通常调整体系pH值使其在pI附近；且pr稳定性好

•（4）盐析温度-常温

•一般在高盐浓度下，温度升高，其溶解度反而下降

•

•3.有机溶剂沉淀-原理、常见沉淀剂（或条件）及影响因素

•.有机溶剂沉淀原理：

•

（1）降低了溶质的介电常数，使溶质之间的静电引力增加，从而出现聚集现象，导致沉淀。

•

（2）由于有机溶剂的水合作用，降低了自由水的浓度，降低了亲水溶质表面水化层的厚度，从而降低了亲水性，导致脱水凝聚－破坏水化膜。

•（3）加有机溶剂后，pr等分子的空间结构可能发生变化，使内部疏水基团部分外露，并与有机溶剂的疏水基团结合成疏水层，从而使蛋白沉淀。

•常用的有机溶剂沉淀剂（或条件）：

乙醇（常用于蛋白质、核酸、多糖等

•生物大分子的沉淀）、丙酮、甲醇

•影响因素：

（1）温度－预冷：

低温有利于防止溶质变性；有利于提高收

•率（溶解度下降）；（有机溶剂溶于水放热）

•

（2）搅拌速度－散热

•（3）溶液pH值：

目标蛋白与杂质带有相同的电荷，pI附近；

•稳定性好

•（4）离子强度:

离子强度低有利于沉淀，0.01－0.05mol/L

•（5）样品浓度:

0.5－2%

•稀：

溶剂用量大，回收率低，但共沉淀作用小

浓：

节省溶剂用量，共沉作用强，分辨率低

•

•

•4.沉淀与结晶的区别

•联系：

沉淀法与结晶法都是将溶质以固体形式从溶液中析出的方法

•区别：

沉淀是利用沉淀剂使所需提取的生化物质或杂质在溶液中的溶解

•度；结晶是溶液中的溶质在一定条件下，因分子有规则的排列而

•结合成晶体。

两者的区别在于构成单位的排列方式不同，晶体的

•原子、离子或分子排列是规则的，而沉淀是不规则的。

•

•5.影响结晶的因素

•

（1）杂质：

•a.促进生长、抑制生长、影响晶体外形

b.其透经不同：

晶体内、吸附在晶体表面、晶体与溶液界面上的液层

•

（2）搅拌：

加速晶体生长、加速晶核的生成；

•（3）温度：

T升高有利于扩散，增加结晶速度；

•（4）过饱和度：

过饱和度增高一般使晶体生长速度增大，但粘度增大，结

•晶速度受阻

•

•第四章萃取技术

•1.基本概念：

萃取、反萃取、分配定律及分离系数

•萃取:

利用溶质在互不相溶的两相中溶解度（或分配系数）的不同而使溶质得到化

•或浓缩的技术。

•反萃取:

将目标产物从有机相转入水相的萃取操作。

•分配定律：

在恒温恒压条件下，溶质在互不相溶的两相中达到分配平衡时，在两相

•中的平衡浓度之比为常数。

•分离系数：

萃取剂对溶质A和B分离能力的大小可用分离因素β来表征

•β＝Ka/Kb

•

•2.各种萃取方式的流程图（P135）与特点

•特点：

•单级萃取:

操作简单、快速，但对分配系数不大的产物分离时回收率低

•多级错流萃取:

回收率较高、但溶剂用量大、产物浓度低、能耗较大。

•多级逆流萃取：

萃取效率高，萃取相中目标产物浓度高；溶剂用量少。

•

•3.有机溶剂萃取：

（1）影响因素（pH）

a）萃取剂的性质

b）原溶剂（B）的pH值对弱电解质分配系数均具有显著影响。

弱酸性电解质的分配系数随pH降低（即氢离子浓度增大）而增大，而弱碱性电解质则正相反。

c）温度－适宜

d）盐析

（2）萃取剂具备的条件

a）萃取容量大（如青霉素）

b）有较高的选择性

c）不与目标产物发生反应，并且与水相不互溶；

（d）与水相有较大的密度差，并且粘度小，表面张力适中，相分散和相分离较容易；

（e）有链烃或芳烃，水溶性低

（f）价廉易得；容易回收和再利用；

（7）毒性低，腐蚀性小，使用安全。

（3）乳化（定义、类型、形成条件、不利影响及消除方法）

定义：

一种液体以细小液滴（分散相）的形式分散在另一互不相容的液体（连续相）中。

类型——油包水（W/O）型和水包油（O/W）型两大类

乳状液形成的条件

a.互不相溶的两相溶剂

b.表面活性剂使有机溶剂（油）和水的表面张力降低

不利影响:

相分离困难；夹带目的物，导致收率低

a）去乳化方法：

加热、稀释、吸附

b）离心或过滤（乳化现象不严重）

c）加强电解质，破坏乳状液双电层

d）转型：

加相反的界面活性剂，促使乳状液转型。

（如：

对于o/w乳状液，加亲油性表面活性剂如SDS，可使o/w向w/o转化，但由于溶液条件不允许w/o的形成，从而达到破乳目的，相反对于w/o型乳浊液，加入亲水性表面活性剂可达到破乳的目的）。

e）加入表面活性更强的物质，把界面活性剂替代出来的顶替法

f）凝聚或絮凝等预处理

4.双水相萃取

（1）双水相萃取特点

（a）条件温和，保留产物活性

（b）通用性强（大分子及小分子萃取）

（c）步骤简单,可连续操作（除去细胞的同时纯化蛋白质）、易于放大

（d）细胞碎片不需要去除

（e）成本高

（2）双水相形成的条件、相图

条件：

至少有一种亲水性很强的高聚物，另一种可以是亲水性很高的无机盐或高聚物

相图:

（3）双水相体系的类型及原因

类型：

1、两种都是非离子型高聚物（PEG/DEX、聚丙二醇/DEX等）

2、非离子型高聚物和离子型高聚物（羧甲基纤维素钠/葡聚糖DEX）

3、两种都是离子型高聚物（羧甲基纤维素钠/羧甲基葡聚糖钠）

4、高聚物和无机盐（磷酸盐、硫酸盐等）

原因：

1、聚合物/聚合物体系——高聚物不相容性

2、对于聚合物/无机盐双水相系统－主要是由于盐析作用分相的

（4）聚合物的不相容性

（5）影响双水相萃取的因素

1.双水相中聚合物组成的影响2.双水相中聚合物浓度影响

3.盐与缓冲液4.pH

5.温度的影响（离开临界点远，不太敏感，粘度）

5.反胶团萃取

•

（1）反胶团萃取的特点

a）成本低

b）选择性好、萃取率和反萃取率高

c）操作方便、放大容易

d）萃取剂（反胶团相）可循环利用

e）蛋白质不易变性等优点

f）影响因素多

•

（2）胶团与反胶团的定义、结构特征

胶团：

表面活性剂分子的两亲性质使之在水溶液中能自发形成结构有序的多分子聚集体反胶团：

是指当油相中表面活性剂的浓度超过临界胶束浓度后,其分子在非极性溶剂中自发形成的亲水基向内、疏水基向外的具有极性内核（polarcore）的多分子聚集体

结构特征：

胶团：

极性头向外，非极性头向内，形成非极性核，溶解非极性化合物

•反胶团：

极性头向内，非极性头向外，形成极性核

（3）表面活性剂的结构、种类

•结构：

表面活性剂是由亲水憎油的极性基团和