毛细管电泳手性拆分研究Word下载.docx
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由于CE的消耗少且一机多用,其运行成本可以下降到极低的水平。
⑦应用范围广,几乎可以分离除挥发性和难溶物之外的各种物质。
1.2、食用色素的概念、特点及作用
1食用色素的概念食用色素,是色素的一种,即能被人适量食用的可使食物在一定程度上改变原有颜色的食品添加剂。
食用色素按来源可分为天然色素和人工合成色素。
天然色素主要是指由动、植物组织中提取的色素,包括微生物色素、动物色素及无机色素。
绝大部分来自植物组织,特别是水果和蔬菜。
安全性高,有的还兼具营养作用（如β-胡萝卜素）。
按来源可分为植物色素（如叶绿素等）、动物色素（如紫胶红等）、微生物色素（如红曲色素等）。
此外,它还可包括某些无机色素。
按结构尚可分为叶啉类（如叶绿素）、异戊二烯类（如β-胡萝卜素）、多酚类（如花色素苷）、酮类（如姜河北大学理学硕士学位论文2黄素）、醌类（如紫胶红）和甜菜红、焦糖色等。
人工合成色素主要是以化工产品为原料通过化学合成制得的有机色素。
按化学结构可分为偶氮类色素和非偶氮类色素。
按溶解性又可分为油溶性色素和水溶性色素。
油溶性色素毒性较大,各国基本不再用于食品着色。
此外还有一类色淀,它是由水溶性色素沉积在许可使用的不溶性基质上制成的特殊着色剂,可含有不同的纯色素（10~40%）和水分,并且不溶于大多数溶剂。
我国食品添加剂使用卫生标准（GB2760-2007）列入的合成色素有胭脂红、苋菜红、日落黄、赤藓红、柠檬黄、新红、靛蓝、亮蓝、二氧化钛（白色素）等等。
1.3、甘氨酸的定义
Gly或G）,为人体非必需氨基酸。
甘氨酸分子结构同时具有酸性和碱性官能团,是最为简单的一种氨基酸。
甘氨酸的结构决定了在水溶液中为强电解质,在强极性溶剂中溶解度较大,基本不溶于非极性溶剂,具有较高的沸点和熔点,通过条件水溶液的酸碱性可以使甘氨酸呈现不同的分子形态。
[1]
1.4、光镊的定义
光镊——光学镊子,顾名思义它是一种利用光物理性质实现的工具。
由于它具有传统机械镊子挟持和操纵微小物体的功能,所以我们称它为光学镊子或简称光镊。
传统的机械镊子用来挟持物体必须使镊尖接触到物体,然后施加一定的压力于物体,物体才会被夹住。
光镊则大不相同。
它使整个物体受到光的束缚达到”钳”的效果,然后通过移动光束来迁移或翻转物体。
光镊酷似一个陷阱,也就是说由光造成了一个势能较低的阱域,从这个阱域到阱域外存在一个势垒。
所以,光镊是比拟宏观机械镊子,对光的势阱效应的一种形象而通俗的描绘。
光与物体间的相互作用力本质上是光的电磁场与组成物质的带电粒子相互作用的结果,包括散射力和梯度力两部分。
散射力正比于辐射强度,方向指向光束传播方向,梯度力正比于光的强度梯度,指向光的强度梯度方向。
通常光辐射对物体的作用都是以散射力为主,表现为推力。
然而在特定强度分布的光场下,例如高度会聚光束的光场,梯度力起主导作用。
这时,梯度力与光强梯度都指向焦点,形成一个三维势阱。
光镊就是利用这样的光学势阱,来捕获微小粒子的。
光镊一诞生就为生命科学家所关注,这与光镊所具有的一系列独特性能有关。
众所周知,微粒的个体行为是大量粒子群体行为的基础,而对微粒的操控正是研究其个体行为的首要条件。
在此基础上才谈得上进行对个体的观测研究、排布组装和各种修饰加工。
光镊可以捕获并进而操控数十纳米到数十微米大小的微粒。
大多生物微粒,诸如细胞、细胞器直至生物大分子都在这一尺度范围里,光镊恰好成为这些生物微粒操控和研究的特有手段。
由于它是用”无形”的光来实现对微粒非机械接触的捕获,捕获力是施加在整个微粒上,而不是像机械捕获那样集中在很小的面积上,因而不会对被捕获的生物微粒产生机械损伤。
至于光10吸收造成的损伤,选择粒子吸收小的光波长即可避免。
又由于光镊的所有机械部件离捕获对象的距离都远大于捕获对象的尺度（约1000倍）,是”遥控”操作,因而几乎不干扰生物粒子周围环境和它的正常生命活动,加之光具有穿透性,可以无损伤的穿过封闭系统的透明表层（细胞膜）操控内部微粒（细胞器）,也可以穿过封闭的样品池的透明外壁,操控池内微粒,实现真正的无菌操作。
并且光镊对微粒的操控不是刚性的,可以在操作过程中实时测量微粒间的微小相互作用力。
光镊既是微机械手又是力的微探针,是生物微粒静态和动态力学特性的理想研究手段。
这对生物大分子行为的研究具有特别重要的意义,在生物大分子的水平上,与各种生化过程的同时,生命过程还表现为它们的运动（位移和速度）,受力的大小与方向,彼此间的结合与分离等运动学和动力学特性,这些特性与它们的结构和功能密切相关,因而力学量成为表征其特性和生物过程的重要参量。
由上述特性可以看出,光镊技术特别适用于对活体生物微粒,诸如细胞、细胞器以及生物大分子的操控和研究。
它对生物微粒的生命活动干扰极小,整个操作体系涉及的细胞生存环境几乎等同于”天然”环境,细胞等的生命活动的变化得以完整保留并”实时动态”展现给研究者。
以往对细胞或生物分子行为的观察依赖于”微粒”自由运动而随机”配对”或”配群”,无法进行”科学设计”。
光镊技术使得这些生命过程成为可控的,使对它们个体行为的研究真正从”观测”上升到”科学实验”[37]。
1.5、自组装的定义
自组装是组装基元通过非共价键（范德华力、氢键、静电力、配位键等）自发聚集或组装成有序结构的过程。
自组装为什么这么倍受人们的关注呢[7]。
一、人类要认识生命的本质必须了解自组装;
二、自组装是一种比较实际的策略在创造新的纳米结构体方面,它将是纳米技术发展的一个重要部分;
三、制造业和机器人学的发展将会受益于自组装;
四、自组装普遍存在于动态,多组成系统中。
自组装过程并不是组装基元之间弱键相互作用的简单加和,而是若干个体之间相互协同作用的结果。
自组装主要分为静态自组装和动态自组装两大类[8]。
在静态自组装中,形成规整结构需要借助一定的能量,但是一旦构建之后其组装体就相当稳定[8]。
例如分子晶体[9,10]是通过静态自组装构成的,大部分可折叠的球形蛋白质也是这样形成的;
大多数的自组装研究都是属于静态自组装[8]。
动态自组装只有在系统有能量消耗时各组分之间相互作用才会发生,这种组装体在振荡化学反应中通过反应与扩散相互竞争而形成[11],动态自组装的研究还处于初期阶段。
1华南理工大学硕士学位论文
1.6、大豆多肽的概念
肽[peptide]是α-氨基酸以肽链连接在一起而形成的化合物,它也是蛋白质水解的中间产物[11]。
由两个氨基酸分子脱水缩合而成的化合物叫做二肽,同理类推还有三肽、四肽、五肽等。
通常由10~100氨基酸分子脱水缩合而成的化合物叫多肽。
它们的分子量低于10000Da（Dalton道尔顿）,能透过半透膜,不被三氯乙酸及硫酸铵所沉淀。
也有文献把由10以下个氨基酸以下组成的肽称为寡肽（小分子肽）;
10~50个氨基酸组成的肽称为多肽;
由50个以上的氨基酸组成的肽就称为蛋白质。
多肽没有严密并且相对稳定的空间结构,即其空间结构易变,具有可塑性,蛋白质分子则具有相对严密,比较稳定的空间结构,多肽和蛋白质都是氨基酸多聚缩合物,而多肽也是蛋白质不完全水解的产物。
大豆多肽又叫大豆肽,即”肽基大豆蛋白水解物”的简称,是一种生物活性肽,是大豆蛋白质经酸、碱、蛋白酶作用,再经特殊处理而得到的蛋白质水解产物。
大豆多肽的必需氨基酸组成与大豆蛋白质完全一样,含量丰富而平衡,且多肽化合物易被人体消化吸收,并具有防病,治病,调节人体生理机能的作用,大豆多肽是极具潜力的一种功能性食品基料,已逐渐成为21世纪的健康食品。
7西安科技大学硕士学位论文
1.7、定义材料
空气的物性参数为:
除了密度,其它的参数按默认值设置。
对于密度的处理采用了Boussinesq密度假定[29,30]。
使用Boussinesq模型假设按定常问题计算。
所谓的Boussinesq模型（假设）就是在计算中假设所有方程中的密度为常数,只有动量方程中的浮力项密度为变量,这种方法仅适用于小温差的流场计算。
另外,它也不能与组分计算同时使用。
本文中的毛细管辐射式空调系统中,热源是空气流动的主要驱动力。
因此采用Boussinesq密度假定来考虑。
其余方程中的密度项均取为常数,即流体区域的平均密度值:
ρ0=（ρmin+ρmax/）2（3.20）动量方程浮力项中的密度可表示为:
ρ=ρ0[1?
β（Τ?
Τ0）]（3.21）其中,T0是区域内流体的最低温度值,ρ0是参考流体密度值。
-25-
1.8、毛细管离子色谱的几个概念
1.峰体积（peakvolume）当在设计一个微尺寸离子色谱系统时,峰体积是需要考虑的一个最基本的因素。
因为它决定了对仪器的大部分要求。
假设样品的浓度是呈高斯（Gussian）分布,样品峰的峰体积Vp可由下式表示:
Vp=4σ=4VRN=4Vo（1+k’）N
（1）其中:
Vp:
峰体积（peakvolume）;
σ:
浓度分布的标准偏差;
VR:
保留体积（rententionvolume）;
N:
理论塔板数（theoriticalplatenumber）;
V0:
柱子的死体积（vacantvolume）;
k’:
容量因子（capacityfactor）。
若不考虑柱外死体积:
V0=πdc2εL4
（2）其中:
dc为柱内径;
ε为柱子的孔率;
L为柱长。
将2式代入1式,可得:
Vp=πdc2εL（1+k’）N（3）第一章绪论11可知,峰体积与柱径平方和柱长成正比,与理论塔板数的平方根成反比。
2.最大峰浓度（Cmax）通过将样品的峰浓度分布曲线积分,可得到峰面积A:
A=2πσCmax（4）因为σ=Vp4,假设ms为给定样品的质量,fR为检测器的响应因子,ms=fR×
A,所以Cmax=RPsfV22mπ（5）将3式代入5式,可得:
Cmax=22msNfRπ32dc2εL（1+K‘）（6）可知Cmax反比于dc2和L,正比于N。
故对于一个给定质量的样品,降低dc即可增大Cmax。
即降低dc可以提高检测相同质量样品时的灵敏度（但前提是使用对浓度响应的检测器）。
这是毛细管色谱一个很大的优点。
3.流速流动相的流速可分为线速度和体积流速。
线速度u:
u=L/t0（7）L为柱长（单位mm）,t0为死时间（单位s）。
体积流速F:
F=V0t0（8）V0为死体积（单位为mL）因为V0=πdc2εL4,故u=4Fπdc2ε（9）故为了在不同尺寸的柱子上获得相同的线速度,体积流速F要同dc2成比例地减小。
下表是各种尺寸色谱法色谱参数的比较:
第一章绪论12表1-1各种尺寸色谱法色谱参数的比较Table1-1Comparisonsofthechromatographicparametersinseveralscalesofchromatography柱子尺寸（长度,mm;
ID,mm）单位Conventional（250;
4.6）Semi-micro（250;
1.5）Micro（250;
0.5）流动相线速度（u）mms-11.41.41.4体积流速（F）mLmin-11.00.10.01峰体积（Vp）μL116121.4峰浓度（Cmax）%1.212100每7小时消耗流动相体积mL420424.2
2、相关背景
2.1、研究的背景和意义
为成熟的一种离子分析方法,无机阴离子的分析目前一般都采用离子色谱。
但常规离子色谱难以同时检测无机阴、阳离子,一般只能采取阴离子柱与阳离子柱切换的方式[1]。
毛细管电泳（CapillaryElectrophoresis,CE）是20世纪80年代初发展起来的一种新型分离检测技术。
自从毛细管电泳的问世以来,以分析快速、高效、简便等特点引起了分析化学界的广泛关注[2-4]。
传统的CE主要用于大分子的分离,以无机离子为主的小离子CE是1990年代发展起来的毛细管电泳离子分析方法,它与常规离子色谱法相比具有高效、快速、微量、低耗等特点[5]。
随着非接触电导检测器的快速发展,非接触电导检测技术也日渐成熟,使得毛细管电泳在无机离子方面的应用日益成熟。
关于非接触电导检测器应用于毛细管电泳中来分析无机离子的文献逐渐增多[6,7]。
该方法仅需常规的毛细管作为分离通道,采用非接触电导检测器,在几分钟内可以同时分离几十种无机阴、阳离子[8,9],检测限可达10-8~10-9mol/L,这是常规离子色谱和毛细管离子色谱无法与之相比的。
毛细管电泳离子色谱正逐渐发展成为一种独立的分离检测方法,并有望取代传统离子色谱和毛细管离子色谱。
目前,国内还没有商业化的毛细管电泳离子色谱仪。
与传统离子色谱法相比,毛细管电泳离子色谱具有以下优点,
（1）分离性能高:
传统离子色谱柱内径4~5mm,而毛细管电泳离子色谱柱的内径为5~500μm,其理论踏板数为每米几十万到百万,远高传统离子色谱。
（2）分离速度快:
通常在几分钟内即可分离完全,而常规离子色谱分析一般需要几十分钟。
（3）操作简便、费用低、毛细管的价格远远低于离子色谱柱的价格。
（4）进样量小:
一般小于100nL,而传统离子色谱则需10~15μL。
同时非接触电导检测器的结构简单、制作容易且成本十分低廉,克服了其他所有电化学检测器都存在的检测电极易污染的缺点,在CE-IC中的初步应用已经显示出巨大的潜能。
随着现代分析技术的发展,数据处理已经成为现代仪器分析过程中重要的一部分[10]。
数据处理系统从原始的记录仪到专用的数据处理机,然后到现在的色谱工作站[11-13]。
现在的数据处理系统显著提高了分析结果的准确度和精密度。
可以对色谱峰进行优化,弥补色谱分离过程的不足。
色谱数据处理系统是色谱技术中发展最快的领域。
许多不同种类的色谱处理系统已应用于色谱分析工作中,各自的积分算法和积分条件都不同,同样也会得到不同的分析结果[14-16]。
因为,在色谱分析中,分析对象经检测器后,其相关信息以模拟电信号的形式输出,这种信号不能直接用来定性和定量分析,必须经过数据处理,数据处理的好坏直接影响2分析结果的准确性[17]。
任何一个分析系统的检出限、准确度和精密度是衡量系统的质量标准。
在色谱数据处理系统中,准确地识别峰,精密测量峰高和峰面积是很关键的,特别是在出现不同程度的重叠峰时,这就对色谱数据处理系统提出了更高的要求。
否则,无法达到准确的定性和定量分析。
我国许多高校、工厂企业仍然拥有大量各种早期的中小型色谱仪,主机性能大都保持良好。
由于部分仪器没有配色谱工作站,一直在用积分仪,这就使得操作人员进行分析工作的效率降低,人为的因素造成分析的数据准确性较差,而且大量的分析数据无法方便的进行存储,造成数据的丢失或遗漏[18,19]。
对一些配备了色谱工作站的色谱仪,其中计算机早已淘汰,使用的分析软件存在着分析时间长,运行复杂,可移植性差,与微机系统兼容性差等弊端。
另一方面,随着分析体系的复杂性和多样化,采用单一分析方法和简单的数据处理技术,已无法揭示分析体系的特异性。
因此可以保留旧仪器的主机部分,只改造升级其微机部分即可。
2.2、毛细管电泳的应用背景
毛细管电泳芯片是一个跨学科的新领域,它是新世纪分析科学、微机械加工、生命科学、化学合成、分析仪器及环境科学等许多领域的重要发展前沿,具有广阔的发展前景和巨大的实用价值。
为了得到高质量的毛细管电泳芯片,研究先进的微制造技术就成为该领域的焦点。
另一方面,为了将目前在实验室研究开发的毛细管电泳芯片真正进入百姓生活,就需要实现低成本、批量制造的高科技技术。
因此,研究适用于毛细管电泳芯片的先进微制造技术及其装备,对毛细管电泳芯片技术的发展与实现其产业化都具有决定性的意义[1-4]。
目前用于毛细管电泳芯片的材料主要有硅、玻璃和石英,以它们为基片的毛细管电泳芯片加工技术已突破发展初期加工技术的主要难关并逐渐走向成熟,这项技术正进入更深入的研究、扩大应用领域和逐步产业化的关键时期。
但是,硅材料的缺点是易脆、不透光、价格高,并且电绝缘性能不够好。
玻璃芯片制作工艺冗长,键合难度大,用它们制作的毛细管电泳芯片难以进行批量生产,成本较高。
为了克服玻璃芯片的这些缺点,当今备受关注的、更具优越性的高聚物有机基体（PMMA或PDMS）毛细管电泳芯片制造正处于探索开发阶段。
2.3、毛细管电泳安培检测的应用背景
自20世纪80年代Jorgenson[5]提出现代毛细管电泳（CE）技术以来,经过近30年的迅速发展,CE达到了仪器分析技术所要求的高效、快速和样品用量少的特点。
微芯片毛细管电泳（MicrochipCE）是集成化技术和毛细管电泳（CE）技-1-哈尔滨工业大学工学硕士学位论文术结合的产物,是近年发展起来的一种新的分离技术[6,7],是微全分析系统（μ-TAS）的主流方向。
该技术以玻璃、石英、晶体硅、塑料、陶瓷和硅橡胶等为基体材料,制造工艺主要涉及光刻、刻蚀、汽相生长和键合等MEMS技术,大多采用电动进样[8],借助CE将进样、反应、分离、检测等过程集成在一起。
芯片毛细管电泳与传统毛细管电泳技术相比,具有样品用量更少,分离速度更快的特点,但对检测的灵敏度和响应速度提出了更高的要求。
目前最常用的检测方式为激光诱导荧光（LIF）。
LIF检测由于需要体积庞大、技术复杂的光学系统的支持,难以适应系统微型化的要求。
电化学检测具有灵敏度高,选择性好,易于集成微型化等优点,因此将电化学检测应用于芯片毛细管电泳的研究受到愈来愈多的关注。
近年来,高分子芯片毛细管电泳技术发展迅速[9,10]。
以聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）为代表的塑料电泳芯片由于其低廉的制作成本与良好的电渗性能,已经成为芯片电泳技术发展的一个重要方向[11]。
电化学检测具有灵敏度高、选择性好和易于微型化等优点,因此在塑料芯片电泳领域中具有较好的应用前景。
为了适应CE微体积检测的需要,在检测方法和检测器方面已进行了大量和卓有成效的研究,发展了许多类型的检测器,有光学、电化学、质谱学检测器及化学发光[12]等。
在众多检测方法中,电化学检测以其质量检出限低、线性范围宽、选择性好、设备简单、价格低廉而得到广泛的使用。
电化学检测主要有三种方法:
电位检测、电导检测和安培检测,有关方面的综述[13,14]已见报道。
其中,安培法是应用较多的电化学方法,此外还有电导法、电化学发光法等。
微芯片上特殊的微通道结构使得MicrochipCE可在高电场强度条件下进行快速、高效的分离[15]。
与传统CE技术相比,MicrochipCE具有材料选择多样、通道尺寸相对较小、通道设计多变、通道更短、散热性能更好、样品用量更少（pL）、分析速度更快的特点。
MicrochipCE目前常用的检测方式是激光诱导荧光检测[16-22],该法灵敏度可达10-10-10-12mol/L,可检测单细胞中的核酸等物质,甚至可对某些荧光效率高的物质进行单分子检测[23,24]。
但其检测对象必须能产生荧光或经衍生能产生荧光,对于大多数非荧光物质,需柱前或柱后衍生才可检测,这就使设备和操作复杂化,且对于透光性差的基体,荧光检测难以应用;
另外,激光诱导荧光检测器造价昂贵,需要体积庞大、技术复杂的光学系统支持,难以真正实现微分析系统的微型化和集成化。
电化学检测具有灵敏度高、选择性好、试样用量少、不受管径限制、对检测部位的透光性无要求、成本低、易于集成化、微型化等优点,与先进的微加工、微制作技术相匹-2-哈尔滨工业大学工学硕士学位论文配[25],具有实现大规模生产的潜力,因此电化学检测应用于MicrochipCE的研究受到越来越多的关注[26]。
1.1.2PMMA毛细管电泳安培检测优点1、PMMA材料特性。
集成毛细管电泳芯片基体材料,先后有晶体硅、玻璃、塑料（主要是有机玻璃）、陶瓷、硅橡胶五种。
晶体硅具有强度好、透光性好、价格适中、纯度高、耐腐蚀等优点,但硅是半导体,实验表明,用于绝缘外加电压和硅之间的绝缘薄膜在不到1000V时便会被击穿。
此外,深度刻蚀困难、硅基片的粘合成功率低也影响了硅的应用。
玻璃是现今使用得最多的一种集成毛细管电泳芯片材料,因为玻璃有一定的强度,透光性比较好,绝缘性能较强（大于5000V）,很适合通常的样品分析。
陶瓷做基体的报道较少,可能与陶瓷的机械加工性能不好、透光性不好有关。
最近有人用有机玻璃（polymethylmethacrylate,PMMA）作基体,结果较满意。
由于有机玻璃价格便宜、容易成形等优点,有机玻璃作基体有一定的前景。
新近又有以硅橡胶（polydimethylsiloxane,PDMS）作基体的报道。
PMMA材料的具体特点如下:
（1）PMMA材料有良好的光学性质。
PMMA材料是高度透明的热塑性高分子材料,透光率高达90-92%,超过硅玻璃;
折光指数1.49;
相对密度1.18,为硅玻璃的1/2;
PMMA材料能透过可见光与紫外光,且入射光不能产生显著的背景信号。
高聚物毛细管电泳芯片的应用常用激光荧光法、电导法或安培法检测,要注意芯片材料的本底荧光要尽量低。
使用高本底荧光的芯片材料会引起信噪比降低和检测下限升高。
（2）PMMA材料容易被加工。
PMMA材料的力学性能和韧性比硅玻璃大10倍以上,不同的加工方法对PMMA材料的可加工性有不同的要求。
由于PMMA材料具有很好的热塑性,通常会用热压法或注射成型法对PMMA材料进行加工。
而一般不会采用激光烧蚀法或浇铸法。
（3）在所采用的分析条件下PMMA材料是惰性的。
PMMA材料的微结构在乙腈中会发生溶涨、塌陷甚至堵塞等现象,而它对高浓度的甲醇则是惰性的。
即它的化学稳定性较好,耐碱、稀酸、水溶性无机盐及长链烷烃和油脂等化学品,但可溶于芳烃（如苯、甲苯、二甲苯等
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