307医院EGFR突变检测经验总结.ppt

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307307医院医院EGFREGFR突变检测经验总结突变检测经验总结开展开展EGFREGFR突变检测面临的问题突变检测面临的问题一、是什么和为什么一、是什么和为什么二、怎么做及注意事项二、怎么做及注意事项三、临床问题的解决：

转化性研究三、临床问题的解决：

转化性研究一、是什么和为什么一、是什么和为什么EGFREGFR基因的基本情况基因的基本情况EGFREGFR：

表皮生长因子受体：

表皮生长因子受体EGFREGFR的胞内信号传导途径的胞内信号传导途径EGFREGFR与肿瘤的生长及酪氨酸激酶抑制剂（与肿瘤的生长及酪氨酸激酶抑制剂（TKITKI）http:

/www.egfr-5-TATCAAGGAATTAAGAGAAGCAACATCTCCGAAAG-TATCAAGGAATTAAGAGAAGCAACATCTCCGAAAG-332121外显子：

外显子：

55-GGGCTGGCCAAACTG-GGGCTGGCCAAACTG-33NEnglJMedNEnglJMed2004;350:

2129-392004;350:

2129-39EGFREGFR的突变类型的突变类型NatureReviewsCancerNatureReviewsCancer2007;7:

169-1812007;7:

169-181肺癌靶向治疗的里程碑：

肺癌靶向治疗的里程碑：

IPASSIPASS研究研究肺癌靶向治疗的里程碑：

肺癌靶向治疗的里程碑：

IPASSIPASS研究研究NEnglJMed2009;361:

947-57NEnglJMed2009;361:

947-57肺癌靶向治疗的里程碑：

肺癌靶向治疗的里程碑：

IPASSIPASS研究研究EGFREGFR突变状态指导突变状态指导TKITKI类药物的使用类药物的使用EGFREGFR突变状态已成为患者能否在一线使用突变状态已成为患者能否在一线使用TKITKI药物的重要指标药物的重要指标二、怎么做及注意事项二、怎么做及注意事项目前较为常见的目前较为常见的RGFRRGFR突变检测方法突变检测方法http:

/www.egfr-http:

/www.egfr-EGFREGFR突变检测中需要明确的几个基本概念突变检测中需要明确的几个基本概念22、基因突变是指、基因突变是指DNADNA发生碱基序列的改变：

发生碱基序列的改变：

须选择有针对性的检测手段，针对非DNA的检测手段如：

RT-PCR（检测RNA表达），免疫组化（检测蛋白表达）以及针对非碱基序列的检测手段如：

FISH（检测DNA的扩增、缺失、断裂、融合）等，均不适用。

体细胞突变体细胞突变发生在非种系组织中不具有遗传性不会遗传给子代种系突变种系突变发生于精子或卵子中可以遗传子代子代所有细胞均带突变11、EGFREGFR突变为体细胞突变：

突变为体细胞突变：

发生于肿瘤细胞中，正常细胞（癌旁或白细胞等）不含突变。

要尽可能取到足量的肿瘤细胞进行检测要尽可能取到足量的肿瘤细胞进行检测，这是保证检测结果可靠的根本前提。

肿瘤细胞内及与正常组织间的异质性肿瘤细胞内及与正常组织间的异质性片段化的片段化的DNADNA不容易进行扩增不容易进行扩增EGFREGFR突变检测中需要明确的几个基本概念突变检测中需要明确的几个基本概念33、样品特性：

异质性，突变细胞或、样品特性：

异质性，突变细胞或DNADNA的含量一般较少，的含量一般较少，DNADNA经常会严重片段化经常会严重片段化44、关键是保证突变、关键是保证突变DNADNA有效扩增至可检测的范围：

扩增效率及检测方法的敏感性有效扩增至可检测的范围：

扩增效率及检测方法的敏感性11、TapManTapMan探针法：

边扩增边检测探针法：

边扩增边检测优势优势只检测突变的序列只检测突变的序列敏感性高且污染几率小敏感性高且污染几率小不足不足探针费用较高探针费用较高只能针对已知突变只能针对已知突变正常正常DNADNA的扩增无限制的扩增无限制NatureReviewsDrugDiscoveryNatureReviewsDrugDiscovery20042004：

33,749-761749-761突变突变DNADNA有荧光信号有荧光信号野生型野生型DNADNA无荧光信号无荧光信号特定的探针：

只结合突变序列特定的探针：

只结合突变序列22、高分辨率溶解曲线（、高分辨率溶解曲线（HRMHRM）：

扩增后再检测）：

扩增后再检测优势优势已知和未知突变序列已知和未知突变序列敏感性高且污染几率小敏感性高且污染几率小不足不足正常正常DNADNA的扩增无限制的扩增无限制对仪器设备的要求较高对仪器设备的要求较高阳性结果还需进一步确认阳性结果还需进一步确认33、变性高效液相色谱分析（、变性高效液相色谱分析（dHPLCdHPLC）：

扩增后再检测）：

扩增后再检测优势优势敏感性高敏感性高已知和未知突变序列已知和未知突变序列不足不足仪器普及率低仪器普及率低正常正常DNADNA的扩增无限制的扩增无限制开盖检测增加污染几率开盖检测增加污染几率阳性结果还需进一步确认阳性结果还需进一步确认检测环境需独立且通风良好检测环境需独立且通风良好44、直接测序法：

扩增后再检测、直接测序法：

扩增后再检测优势优势直观且相对成本低直观且相对成本低已知和未知突变序列已知和未知突变序列不足不足工作量大且敏感性低工作量大且敏感性低开盖会增加污染几率开盖会增加污染几率正常正常DNADNA的扩增无限制的扩增无限制SangerSanger测序法原理测序法原理55、焦磷酸测序：

扩增后再检测、焦磷酸测序：

扩增后再检测优势优势适合已知序列适合已知序列已知和未知突变均可测已知和未知突变均可测敏感性高、直观、能够定量敏感性高、直观、能够定量不足不足需要专用仪器需要专用仪器正常正常DNADNA的扩增无限制的扩增无限制开盖会导致污染几率增加开盖会导致污染几率增加66、突变富集、突变富集PCRPCR：

扩增后再检测（抑制正常：

扩增后再检测（抑制正常DNADNA扩增）扩增）优势优势敏感性高（此消彼长）敏感性高（此消彼长）不足不足操作繁琐操作繁琐只针对已知突变只针对已知突变开盖导致污染几率增加开盖导致污染几率增加不好找合适的限制性内切酶不好找合适的限制性内切酶ClinCancerResClinCancerRes2006;12

（1）:

43-482006;12

（1）:

43-4877、扩增阻滞突变系统（蝎形探针）：

边扩增边检测、扩增阻滞突变系统（蝎形探针）：

边扩增边检测优势优势敏感性高且污染几率小敏感性高且污染几率小只扩增并检测突变的序列只扩增并检测突变的序列不足不足只针对已知突变只针对已知突变试剂盒费用较高试剂盒费用较高7272延伸延伸9494解链解链6060自身杂交发光自身杂交发光ARMSARMS引物引物各种突变检测方法的综合比较各种突变检测方法的综合比较http:

/www.egfr-http:

/www.egfr-11、操作流程、操作流程22、污染几率、污染几率33、敏、敏感感性性44、可实施性、可实施性我们最初采用的方法：

直接测序法我们最初采用的方法：

直接测序法选择的理由选择的理由结果直观易懂结果直观易懂大量文献支持、金标准大量文献支持、金标准实验室条件能够满足要求实验室条件能够满足要求注意事项：

注意事项：

DNADNA抽提部分抽提部分新鲜组织新鲜组织体液（胸水或血浆）体液（胸水或血浆）石蜡包埋组织石蜡包埋组织提取过程约提取过程约11小时小时提取过程约提取过程约11小时小时提取过程约提取过程约33小时小时11、DNADNA提取之前的病理质量控制非常重要，它决定了最终检测结果的可靠性提取之前的病理质量控制非常重要，它决定了最终检测结果的可靠性22、尽可能使用认可程度高的试剂，以保证、尽可能使用认可程度高的试剂，以保证DNADNA的提取效率（的提取效率（TaKaRaDEXPATTaKaRaDEXPAT）33、严格按照说明书要求保存试剂（温度、湿度等），以免试剂失效、严格按照说明书要求保存试剂（温度、湿度等），以免试剂失效44、可按自身需求对操作流程做适当修改，但要形成、可按自身需求对操作流程做适当修改，但要形成SOPSOP操作规范（操作规范（示例示例11、22）55、DNADNA提取区域与提取区域与DNADNA扩增后的分析区域要完全分隔，以避免气溶胶污染扩增后的分析区域要完全分隔，以避免气溶胶污染注意事项：

注意事项：

PCRPCR扩增部分扩增部分11、DNADNA质量控制非常重要，可保证后续实验的顺利进行（模板过量、质量控制非常重要，可保证后续实验的顺利进行（模板过量、PCRPCR抑制剂）抑制剂）22、设置好阴性对照（避免污染）和阳性对照（验证实验体系，必要时可取消）、设置好阴性对照（避免污染）和阳性对照（验证实验体系，必要时可取消）33、选用保真性较高的、选用保真性较高的TaqTaq酶，避免由实验体系带来的假阳性酶，避免由实验体系带来的假阳性44、做好详细的实验记录，为以后的各种分析提供依据（、做好详细的实验记录，为以后的各种分析提供依据（示例示例）MarkerMarker百倍稀释百倍稀释原液原液空白空白MarkerMarker空白空白19211921MarkerMarker空白空白19211921注意事项：

注意事项：

PCRPCR扩增部分扩增部分原来的原来的1919号外显子巢式号外显子巢式PCRPCR引物引物原来的原来的2121号外显子巢式号外显子巢式PCRPCR引物引物NEnglJMedNEnglJMed2004;350:

2129-392004;350:

2129-39改进后的改进后的1919号外显子巢式号外显子巢式PCRPCR引物引物改进后的改进后的2121号外显子巢式号外显子巢式PCRPCR引物引物55、巢式、巢式PCRPCR并非必须，如果并非必须，如果DNADNA的质量足够好，可以选择一次的质量足够好，可以选择一次PCRPCR66、不必迷信权威文献中的实验条件，实践是检验真理的唯一标准、不必迷信权威文献中的实验条件，实践是检验真理的唯一标准注意事项：

结果分析部分注意事项：

结果分析部分早期的报告早期的报告现在的报告现在的报告报告力求简洁明了，不仅有检测结论还要有可靠的事实依据报告力求简洁明了，不仅有检测结论还要有可靠的事实依据注意事项：

结果分析部分注意事项：

结果分析部分检测结果随时归档，以备日后查询、统计检测结果随时归档，以备日后查询、统计三、临床问题的解决：

转化性研究三、临床问题的解决：

转化性研究转化医学转化医学转化医学：

以患者为中心，建立临床治疗和基础研究间的双向通道，转化医学：

以患者为中心，建立临床治疗和基础研究间的双向通道，从临床工作中发现从临床工作中发现和提出问题，和提出问题，寻找或建立相应的解决方案，然后将其应用于临床，解决临床的实际问题寻找或建立相应的解决方案，然后将其应用于临床，解决临床的实际问题测序法敏感性不足将导致假阴性结果测序法敏感性不足将导致假阴性结果1.1.FHirsch,etal.JCO2006FHirsch,etal.JCO20062.2.CZhu,etal.JCO2008CZhu,etal.JCO20083.3.TMok,etal.DiscoveryMed2009TMok,etal.DiscoveryMed2009ISELISELBiomarkerBiomarker11测序法阴性样本测序法阴性样本200200份份ARMSARMS法重新检测法重新检测17（+）17（+）测序法复测测序法复测7（+）7（+）BR21BR21后续分析后续分析22测序法阴性样本测序法阴性样本n=148n=148ARMSARMS法重新检测法重新检测11（+）11（+）ARMSARMS法是灵敏度更高的方法，测序法的假阴性率约为法是灵敏度更高的方法，测序法的假阴性率约为8%8%33ADx-ARMSADx-ARMS