10基因治疗.ppt

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基因治疗GeneTherapy医学遗传学国家重点实验室医学遗传学国家重点实验室NationalKeyLaboratoryofMedicalGenetics.（11）概述）概述（22）基因转移系统）基因转移系统（33）临床例子）临床例子（44）肿瘤的基因治疗）肿瘤的基因治疗（55）基因治疗存在的问题基因治疗存在的问题概述概述基因治疗的定义基因治疗的定义基因治疗基因治疗（genetherapy）genetherapy）是指将正常基因植是指将正常基因植入靶细胞代替遗传缺陷的基因，或关闭、抑制入靶细胞代替遗传缺陷的基因，或关闭、抑制异常表达的基因，以达到预防和治疗疾病目的异常表达的基因，以达到预防和治疗疾病目的的一种临床治疗技术。

的一种临床治疗技术。

一句话：

将外源性基因引入细胞，以改变细一句话：

将外源性基因引入细胞，以改变细胞或个体的表型来达到治疗的目的。

胞或个体的表型来达到治疗的目的。

11、原理、原理1）DNA1）DNA是遗传的物质基础。

是遗传的物质基础。

2）2）基因是能表达产生特异蛋白质基因是能表达产生特异蛋白质的的DNADNA片段。

片段。

3）3）遗传病的根源在于基因异常，遗传病的根源在于基因异常，对异常基因的纠正可以使疾病获得对异常基因的纠正可以使疾病获得根治。

根治。

基因表达序列的改变：

基因表达序列的改变：

单个或多个核苷酸的突变、缺失、重复单个或多个核苷酸的突变、缺失、重复基因调控区域的改变：

基因调控区域的改变：

基因启动子的突变、缺失等基因启动子的突变、缺失等20世纪世纪50年代年代,DNA双螺旋结构、遗传密码与中心双螺旋结构、遗传密码与中心法则，奠定了基因结构和功能的分子生物学理论法则，奠定了基因结构和功能的分子生物学理论基础。

基础。

70年代重组年代重组DNA技术的发展，使携带目的基因技术的发展，使携带目的基因的病毒载体在实验室产生。

的病毒载体在实验室产生。

80年代现代生物学在理论和技术上的突破，使基年代现代生物学在理论和技术上的突破，使基因治疗成为可能。

因治疗成为可能。

1980年，年，Cline等采用磷酸钙介导的基等采用磷酸钙介导的基因转移系统治疗地中海贫血，未能成功。

因转移系统治疗地中海贫血，未能成功。

基础工作的重要，主要是基础工作的重要，主要是基因转移与表基因转移与表达调控，探讨目的基因在受体细胞或整达调控，探讨目的基因在受体细胞或整体动物中的整合特点、表达水平与调控体动物中的整合特点、表达水平与调控规律。

并且疾病的基因治疗必须视不同规律。

并且疾病的基因治疗必须视不同疾病而异。

疾病而异。

基因治疗作为现代医疗史上的充满着很基因治疗作为现代医疗史上的充满着很大希望和潜在风险的现代高新技术，因大希望和潜在风险的现代高新技术，因此伦理学和安全性的讨论有其必要性与此伦理学和安全性的讨论有其必要性与超前性。

超前性。

目的性目的性基因转移的受体细胞基因转移的受体细胞病毒载体的安全性病毒载体的安全性基因治疗的审批与临床试验基因治疗的审批与临床试验美国是最早开展基因治疗的国家美国是最早开展基因治疗的国家先在地方伦理小组先在地方伦理小组-HGTS-RAC-FDA1989年首例基因标记与基因治疗，恶性黑色年首例基因标记与基因治疗，恶性黑色素瘤素瘤1990年首例成功案例，年首例成功案例，ADA-SCID1999年患难事件，杰辛格事件年患难事件，杰辛格事件-OTC二、基因转移系统怎样将重组DNA导入宿主细胞，并且能在宿主细胞中有效表达目的蛋白，达到基因治疗的目的。

11、基因治疗的策略：

、基因治疗的策略：

1）1）基因修复基因修复（genereparation）（genereparation）2）2）基因代替基因代替（genesubstitution）（genesubstitution）3）3）基因抑制基因抑制（geneinhibition）（geneinhibition）4）4）基因开放基因开放（geneopening）（geneopening）5）5）基因增强基因增强（geneenhancement）（geneenhancement）基因修复基因修复：

原位修复有缺陷的基因，使其在质和量上均能得：

原位修复有缺陷的基因，使其在质和量上均能得到正常的表达。

到正常的表达。

基因代替基因代替：

指去除整个变异基因，用有功能的正常基因：

指去除整个变异基因，用有功能的正常基因取代之，使疾病基因得到永久的更正。

取代之，使疾病基因得到永久的更正。

基因抑制：

基因抑制：

利用反义利用反义RNA抑制有害基因的表达抑制有害基因的表达AG-珠蛋白基因家族（珠蛋白基因家族（11号染色体）：

号染色体）：

基因开放基因开放基因开放：

基因开放：

目的在于促使有类似功能的基因表达，目的在于促使有类似功能的基因表达，以超过或代替异常基因的表达。

以超过或代替异常基因的表达。

drug基因增强：

基因增强：

是指将目的基因导入病变细胞或其他细胞，目的基因的表达产是指将目的基因导入病变细胞或其他细胞，目的基因的表达产物可以补偿缺陷细胞的功能或使原有的功能得到加强。

物可以补偿缺陷细胞的功能或使原有的功能得到加强。

22、基因转移的方法基因转移的方法基因转移是基因治疗的关键和基础，实施基因转移是基因治疗的关键和基础，实施基因转移的途径主要有两类：

基因转移的途径主要有两类：

11）直接体内法）直接体内法（invivoinvivo），即活体直接转移即活体直接转移法，指将外源基因直接注入人体内有关组织器法，指将外源基因直接注入人体内有关组织器官，使其进入相应的细胞官，使其进入相应的细胞22）间接体内法（）间接体内法（exvivoexvivo），即在体转移，指即在体转移，指在体外将外源基因导入细胞，再将这种细胞回在体外将外源基因导入细胞，再将这种细胞回输到病人体内。

输到病人体内。

直接体内法直接体内法（invivo）间接体内法（间接体内法（exvivo）基因转移的方法可分为：

基因转移的方法可分为：

gene-transferringstrategiesgene-transferringstrategies物理physical；化学chemical；生物biochemical。

1、基因转移的物理方法、基因转移的物理方法基因转移的物理方法包括：

基因转移的物理方法包括：

裸裸DNADNA直接注射、微粒轰击、电穿孔、显微注射等直接注射、微粒轰击、电穿孔、显微注射等

（1）裸）裸DNA直接注射直接注射

（1）

（1）裸裸DNADNA直接注射直接注射

（2）基因枪（）基因枪（genegun）（3）电穿孔法（）电穿孔法（electroporation）电转（4）显微注射）显微注射（microinjection）（11）磷酸钙共沉淀法）磷酸钙共沉淀法

（2）DEAE-DEAE-葡聚糖转染法葡聚糖转染法（3）脂质体转染法脂质体转染法（4）纳米颗粒转移法）纳米颗粒转移法2、基因转移的化学方法、基因转移的化学方法（11）磷酸钙共沉淀法）磷酸钙共沉淀法CaClCaCl22,DNA,DNA和磷酸盐缓冲液缓慢混合时，即和磷酸盐缓冲液缓慢混合时，即有磷酸钙微细沉淀形成，这些细小颗粒可以有磷酸钙微细沉淀形成，这些细小颗粒可以吸附在细胞表面，通过细胞膜的内吞作用将吸附在细胞表面，通过细胞膜的内吞作用将DNADNA吸收进入细胞质而后进入细胞核吸收进入细胞质而后进入细胞核DNADNA多多以以拷拷贝贝首首位位相相连连的的串串珠珠状状排排列列进进入入细细胞，在细胞中多以多拷贝形式存在。

胞，在细胞中多以多拷贝形式存在。

瞬间表达效率最高可达瞬间表达效率最高可达20%,20%,长期表达效率低。

长期表达效率低。

（2）DEAE-DEAE-葡聚糖转染法葡聚糖转染法二二乙胺乙基葡聚糖（乙胺乙基葡聚糖（diethyl-diethyl-aminoethyl-aminoethyl-dextran,DEAE-dextrandextran,DEAE-dextran）是是一种高分子量的多一种高分子量的多聚阴离子试剂聚阴离子试剂能促进哺乳动物细胞捕获外源能促进哺乳动物细胞捕获外源DNADNA该该方法可广泛用于转染病毒、病毒序列及其他方法可广泛用于转染病毒、病毒序列及其他DNADNA适合于细胞瞬间表达检测及小量适合于细胞瞬间表达检测及小量DNADNA的转染。

的转染。

（3）（3）脂质体（脂质体（liposomeliposome）主要分为两类：

主要分为两类：

11）病毒介导的基因转移）病毒介导的基因转移逆转录病毒（逆转录病毒（RVRV）载体载体腺病毒（腺病毒（AdAd）载体载体腺相关病毒（腺相关病毒（AAVAAV）载体载体单纯疱疹病毒（单纯疱疹病毒（HSVHSV）载体载体多种形式的嵌合病毒载体多种形式的嵌合病毒载体3、基因转移的生物学方法、基因转移的生物学方法逆转录病毒（逆转录病毒（RV）载体载体（Vector）腺相关病毒（腺相关病毒（AAV）载体载体3、基因转移的生物学方法、基因转移的生物学方法22）非病毒载体介导的基因转移）非病毒载体介导的基因转移配体配体/受体受体人工染色体人工染色体配体配体/受体受体（ligand/receptor）电穿孔法电穿孔法，显微注射显微注射，磷酸钙共沉淀法磷酸钙共沉淀法质粒质粒DNADNA注射、吸入，注射、吸入，体内电穿孔，体内电穿孔，基因疫基因疫苗苗非载体法非载体法脂质体，微粒子，脂质体，微粒子，GAMGAM脂质体脂质体，微粒子微粒子，GAMGAM非生物性载体法非生物性载体法Mt,MAC,HAC,HMCMt,MAC,HAC,HMC配体配体/受体受体非病毒性生物载体法非病毒性生物载体法RV,HIVRV,HIV，AV,AAV,AV,AAV,HSV,poxrivusHSV,poxrivusRVRV,HIVHIV，AVAV,AAVAAV,HSVHSV，poxrivuspoxrivus病毒载体法病毒载体法间接体内法间接体内法（exvivo）（exvivo）直接体内法直接体内法（invivo）（invivo）基因转移方法基因转移方法基因治疗的靶细胞基因治疗的靶细胞造血干细胞造血干细胞肝细胞肝细胞肌细胞肌细胞淋巴细胞淋巴细胞皮肤成纤维细胞皮肤成纤维细胞iPS细胞（细胞（inducedpluripotentstemcell）iPS细胞（人工诱导的多潜能干细胞）细胞（人工诱导的多潜能干细胞）最先由日本京都大学Yamanaka科研团队发起这项研究，他们选择Oct3/4,Sox2,c-Myc,andKlf4四个基因，通过逆转录病毒将这四个基因导入小鼠胚胎成纤维细胞和小鼠成体成纤维细胞中，可以引起待诱导细胞的基因组发生重新编程而转变为具有ES细胞（胚胎干细胞）特性的iPS细胞。

iPS细胞显示了ES细胞的形态学（圆形、大核仁和少细胞质）和生长特性，表达了ES细胞的标志基因。

通过皮下注射把iPS细胞移植到裸鼠体内形成了畸胎瘤（包含了来自三个胚层的各种组织），说明其具有分化多潜能性。

用显微注射的方法把iPS细胞注射到小鼠胚泡内，iPS细胞参与了胚胎发育，形成成熟的嵌合体小鼠。

后来科研人员用后来科研人员用Oct3/4,Sox2,和和Klf4三个基因组合以及三个基因组合以及OCT4,SOX2,NANOG,和和LIN28四个基因组合把人四个基因组合把人皮肤成纤维细胞成功诱导为皮肤成纤维细胞成功诱导为iPS细胞，同细胞，同时待诱导的细胞也由成纤维细胞扩大到时待诱导的细胞也由成纤维细胞扩大到胃上皮细胞、肝细胞等细胞。

胃上皮细胞、肝细胞等细胞。

为了评价为了评价iPS细胞的治疗性潜能，美国科学家细胞的治疗性潜能，美国科学家JacobHanna等做了用自体成纤维细胞诱导出的等做了用自体成纤维细胞诱导出的iPS治疗镰治疗镰状细胞性贫血症小鼠模型的动物实验。

状细胞性贫血症小鼠模型的动物实验。

治疗策略：

治疗策略：

1.将突变体小鼠体内成纤维细胞诱导成将突变体小鼠体内成纤维细胞诱导成iPS细胞；细胞；2.通过同源重组修复有遗传缺陷的通过同源重组修复有遗传缺陷的i