啤酒酵母选育Word格式.docx

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显微镜直截了当计数法：

比较直观，我们能够直截了当显微观看，多人工作计数。

耗时较短，且工作量较小，同时我系其他实验组采纳此方法计数，可供参考。

3：

光电比浊法：

尽管绘制标准曲线要求较高，然而工作量较小，且一次绘制好标准曲线好后，以后能够用，准确率较高。

比较三种方法，我倾向于第一种和第三种，二者相比较，能够校正方案。

实验步骤：

打开30W紫外灯预热30min，使其功率达到稳固。

1取斜面菌苔一环于2OmL麦汁中混匀，28℃活化培养14h。

2取4mL培养液以3000r/min的速度离心15min，弃上清液加入4mL生理盐水洗涤，在电磁振荡仪上震荡10min左右，重复2次，制成5mL悬液，用血球计数板在显微镜下直截了当计数，调整细胞浓度。

3取诱变前的1mL菌悬液进行适当稀释，分离出3个合适的稀释度倾注琼脂平板，约为10-3、10-4、10-5，每一个梯度3个平板，每一个平板加0.2mL菌液，进行培养后平板计数法，作为对比。

4取菌悬液5mL移入无菌培养皿中，加入一无菌磁力转子，置于磁力搅拌器上。

530W紫外灯下30cm处照耀，调整照耀时刻。

此次预设为0，30，45，60，90，120，180，600.（单位s）

6取一定稀释梯度的紫外照耀菌液0.1（视具体情形而定）用无菌涂布棒涂布平均，每组做三个平行线培养记录菌落数，运算各照耀时刻下的致死率。

（选在75%-80%）。

致死率=未经照耀菌落数-紫外照耀菌落数

未经紫外照耀菌落数

7挑取平板上生长迅速菌落比较大的菌株进行斜面培养，然后重复1-5，再重复第5步，挑取平板上生长迅速、菌落比较大的菌株进行斜面培养，连续进行5次，

28℃培养20h左右，运算其突变率和致死率。

（上述时刻等数字视为参考数值）

1.2.3.1初筛

诱变后选择在麦芽汁固体培养基上生长良好，菌落呈中等大小、乳白色、表面光滑和边缘整齐的菌落移接斜面供复筛。

1.2.3.2复筛

供复筛的菌株进行500ml三角瓶低温发酵，测定发酵液中的双乙酰含量并以此作为复筛的标准。

同时测定发酵液中双乙酰含量最低的几株酵母的其它性能。

双乙酰含量测定：

初筛获得的菌株经500ml三角瓶内装300ml120Bx麦芽汁发酵8d后，测定发酵液中的双乙酰含量，选择发酵液中双乙酰含量低的菌株进行二次发酵，将双乙酰含量明显降低的4株菌分不编号为FB-E1、FB-E2、FB-E3和FB-E4。

结果见表1

表1发酵液中双乙酰含量的比较

菌株FBFB-E1FB-E2FB-E3FB-E4

双乙酰含量（mg/L）0.12330.07060.09260.07760.0870

降低率（%）042.724.937.129.4

（此处绘制表格样式视为参考）

降低前驱物质α-乙酰乳酸的生产量

措施：

改良酵母菌种

提升麦汁中α-氨基氮含量，能够抑制合成酶的活性

2加速双乙酰的还原

提升酵母的细胞密度（增大酵母菌的接种量）

提升还原温度（封罐后高温还原）

限制后期酵母的出芽率（封罐）

国标中关于啤酒中双乙酰的量的要求

二级啤酒：

0.2mg/L一级啤酒：

0.13mg/L

方法：

国标GB4927-2001检测

培养条件：

恒温12度发酵栓培养8d后检测发酵液中双乙酰的含量。

原理：

双乙酰的测定方法采纳比色法。

邻苯二胺比色法是连二酮类都能发生显色反应的方法，因此，此法测得之值为双乙酰与戊二酮的总量，结果偏高。

但此法快速简便。

用蒸汽将双乙酰从样品中蒸馏出来，加邻苯二胺，形成2，3—二甲基喹喔琳，其盐酸盐在335nm波长下有一最大吸取峰，可进行定量测定。

1仪器：

带有加热套管的双乙酰蒸馏器，蒸汽发生瓶（2000mL或3000mL）或者锥形瓶，平底烧瓶，容量瓶25mL

2试剂和溶液

盐酸溶液（4moL/L），邻苯二铵溶液：

10g/L（称取邻苯二铵0.1g用盐酸溶液溶解并定容至10mL摇匀，放于阴暗处，注意此溶液即用即配）

消泡剂

3实验步骤

（1）把双乙酰蒸馏器安装好，把夹套蒸馏器下端的排气夹子打开。

（2）将内装2.5mL蒸馏水的容量瓶（或量筒）放于冷凝器下，使出口尖端浸没在水面下，外加冰水冷却。

（3）加热蒸汽发生器至沸，通汽加热夹套，备用。

（4）于100mL量筒中加入2~4滴消泡剂，再注入5℃左右未除气啤酒100mL。

（5）待夹套蒸馏器下端冒大汽时，打开进样口瓶塞，将啤酒迅速注入蒸馏器内，再用约10mL蒸馏水冲洗量筒，同时倒入，迅速盖好进样口塞子，用水封口。

（6）待夹套蒸馏器下端再次冒大汽时，将排气夹子夹住，开始蒸馏，到馏出液接近25mL时取下容量瓶，用水定容至25mL，摇匀（蒸馏应在3分钟内完成）。

（7）分不吸取馏出液10mL于两支比色管中。

一管作为样品管加入0.5mL邻苯二胺溶液，另一管不加作空白，充分摇匀后，同时置于暗处放置20-30分钟，然后于样品管中加2mL4N盐酸溶液，于空白管中加2.5mL4N盐酸溶掖，混匀。

（8）在335nm波长处，用1cm比色皿以空白作对比测定样品吸光度。

（9）运算：

双乙酰（mg／L）＝A335×

2.4（用20mm石英比色皿时，吸光度与双乙酰的换算系数）

注：

若用20mm的石英比色皿则换算系数则为1.2

1.2.4不同菌株的发酵性能测试（CO2失重法）

将发酵摇瓶置于26度恒温环境中，每天称重1次（直至日失重小于0.5g为止），因每瓶用于发酵的麦芽汁体积相同，因此只需运算发酵后单位时刻内CO2的开释量，发酵6d，以CO2产生量为纵坐标，发酵时刻为横坐标，绘制C02产生量曲线。

1.2.6不同菌株发酵发酵液中残留总糖含量测定

从8个发酵后的发酵瓶中各取0.2mL发酵液并稀释500倍，用硫酸-苯酚法测定发酵液中残留总糖的含量。

附录：

硫酸-苯酚法

1）葡萄糖标准液的配制

准确称取干燥恒重的葡萄糖20mg，蒸馏水准确定容500mL得到0.04mg/L的葡萄糖液。

2）试剂

1）浓硫酸：

分析纯，95.5%

2）80%苯酚：

80克苯酚（分析纯重蒸馏试剂）加20克水使之溶解，可置冰箱中避光长期储存。

3）6%苯酚：

临用前以80%苯酚配制。

（每次测定均需现配）

4）15%三氯乙酸（15%TCA）：

15克TCA加85克水使之溶解，可置冰箱中长期储存。

5）5%三氯乙酸（5%TCA）：

25克TCA加475克水使之溶解，可置冰箱中长期储存。

6）6mol/L氢氧化钠：

120克分析纯氢氧化钠溶于500ml水。

7）6mol/L盐酸

表1标准曲线的制作步骤

管号012345678

葡萄糖0.00.40.60.81.01.21.41.61.8

蒸馏水2.01.61.41.21.00.80.60.40.2

苯酚液1.01.01.01.01.01.01.01.01.0

浓硫酸5.05.05.05.05.05.05.05.05.0

取8支洁净的具塞试管按表2方法操作,摇匀后放置5min,置沸水浴中加热15min,取出迅速冷却至室温,以0号作为空白调零,在最大吸取波长处测定吸光度。

以葡萄糖浓度X为横坐标（ug/mL），吸光度Y为纵坐标，从而来绘制标准曲线。

1．制作标准曲线：

准确称取标准葡聚糖（或葡萄糖）20mg于500ml容量瓶中，加水至刻度，分不吸取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8,各以蒸馏水补至2.0ml，然后加入6%苯酚1.0ml及浓硫酸5.0ml,摇匀冷却，室温放置20分钟以后于490nm测光密度，以2.0ml水按同样显色操作为空白，横坐标为多糖微克数，纵坐标为光密度值，得标准曲线。

2．样品含量测定：

①取样品1克（湿样）加1mL15%TCA（三氯醋酸）溶液研磨，再加少许5％TCA溶液研磨，倒上清液于10毫升离心管中，再加少许5％TCA溶液研磨，倒上清液，重复3次。

最后一次将残渣一起到入离心管。

注意：

总的溶液不要超出10毫升。

（既不要超出离心管的容量）。

②离心，转速3000转/分钟，共三次。

第一次15分钟，取上清液。

后两次各5分钟取上清液到25毫升锥形比色管中。

最后滤液保持18毫升左右。

③水浴，在向比色管中加入2毫升6mol/L盐酸之后摇匀，在96℃水浴锅中水浴2小时。

④定容取样。

水浴后，用流水冷却后加入2毫升6mol/L氢氧化钠摇匀。

定容至25毫升的容量瓶中。

吸取0.2ml的样品液，以蒸馏补至2.0ml，然后加入6%苯酚1.0ml及浓硫酸5.0ml,摇匀冷却室温放置20分钟以后于490nm测光密度。

每次测定取双样对比。

以标准曲线运算多糖含量。

1.2.7不同菌株产酒精能力（酒精度）测试

快速氧化法

乙醇在酸性条件下,通过量的、一定浓度的重铬酸钾作用，氧化生成醋酸。

再将剩余的的重铬酸钾经硫代硫酸钠还原。

由反应过程中，通过消耗的硫代硫酸钠的量运算酒精含量。

试剂：

重铬酸钾溶液、硝酸溶液、碱性碘化钾溶液、淀粉溶液、硫代硫酸钠标准溶液

在蒸馏器的接收瓶中，加入10.00ml重铬酸钾溶液和25ml硝酸溶液。

并将空气冷凝器的出口插入此溶液中。

在蒸馏瓶中加入12ml水和1.00ml试样。

接好装置，迅速加热至沸，并连续煮沸3分钟，蒸馏即告完成。

在同意瓶中，加入300ml水、10ml碱性碘化钾溶液及10ml淀粉溶液，在电磁搅拌器搅拌下，用硫代硫酸钠标准溶液滴定至淡青色的淀粉终点。

通过如下公式运算酒精含量。

酒精（%，V/V）=（20.00-0.6575V）/Vs

式中V——硫代硫酸钠标准溶液滴定量

Vs——试样取样量

方法二：

2.2蒸馏—密度瓶法

2.2.1仪器

全玻璃蒸馏器（500mL）、恒温水浴（精度±

0.1℃）、容量瓶（100mL）、移液管（100ml）分析天平（感量0.1mg）、天平（感量0.1g）、25ml附温度计密度瓶

2.2.2操作方法

用100mL容量瓶准确量取试样100ml，置于蒸馏瓶中，用50ml水分三次冲洗容量瓶，洗液并入蒸馏瓶中，加玻璃珠数粒，装上蛇型冷凝管，用原100ml容量瓶接收馏出液（外加冰浴）,慢慢加热蒸馏，收集约96ml馏出液（蒸馏应在30-60分钟内完成），取下容量瓶，调温到20℃，补水定容，混匀。

用25mL附温度计密度瓶测试样馏出液20℃的相对密度，按照相对密度查表，得到试样馏出液的酒精度（%，V/V），即为试样的酒精度。

2.3蒸馏装置

2.3.2试剂

重铬酸钾溶液、优级纯无水乙醇

2.4操作方法

2.4.1标准曲线的制备

吸取1ml无水乙醇于100ml容量瓶中，稀释至刻度，混匀。

分不吸取此稀释液0、1、2、3、4、5、6、7ml于50ml容量瓶中，各加15.0ml重铬酸钾溶液，加水至刻度，混匀。

此标准系列相当于试样中含有0.0、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00、7.00（V/V）的酒精。

以空白标准作参比，在波长610nm，用1cm比色皿测定其余各标准的吸光度。

用吸光度对酒精浓度作图，绘标准曲线。

2.4.2试样的测定

在500ml蒸馏烧瓶中，加入100.0ml试样。

按1.2方法进行蒸馏，最后加适量水将蒸馏液补足为100.0ml。

吸取1.0ml蒸馏液于50ml容量瓶中，按标准曲线的制备的操作测定其吸光度，由标准曲线查出酒精含量（%、V/V）。

1.2.8α-氨基氮含量的测定

水合茚三酮是一种氧化剂，可使氨基酸脱羧氧化，而本身被还原成还原型水合茚三酮。

还原型水合茚三酮再与末还原的水合茚三酮及氨反应，生成蓝紫色缩合物，颜色深浅与游离α–氨基氮含量成正比，可在570nm下比色测定。

（1）样品稀释适当稀释样品至含1~3μgα–氨基氮/mL（麦汁一样稀释100倍，啤酒50倍，啤酒应先除气）。

（2）测定取9支10mL比色管，其中3支吸入2mL甘氨酸标准溶液，另3支各吸入2mL试样稀释液，剩下3支吸入2mL蒸馏水。

然后各加显色剂1mL，盖玻塞，摇匀，在沸水浴中加热l6分钟。

取出，在20℃冷水中冷却20分钟，分不加5mL碘酸钾稀释液，摇匀。

在30分钟内，以水样管为空白，在570nm波长下测各管的光密度。

运算：

α–氨基氮含量（μg/mL）=（样品管平均O.D./标准管平均O.D.）×

2×

稀释倍数

讲明：

式中

（样品管平均O.D./标准管平均O.D.）：

表示样品管与标准管之间的α–氨基氮之比；

标准管的α–氨基氮浓度（μg/mL），即（0.1072×

14/75）×

100；

α-氨基氮的测定（茚三酮法）

1、实验试剂

a显色剂

100克磷酸氢二钠（Na2HPO4.12H2O）

60克磷酸二氢钾（KH2PO4）

5.00克水合茚三酮

3.00克果糖

用水溶液溶解后稀释至1升（此溶液在低温下用棕色瓶可储存2周，pH应为6.6-6.8。

操作时能够按比例配成100ml）。

b稀释溶液：

2克碘酸钾溶于600ml水中，再加入96%乙醇400ml.

c标准溶液：

溶107.2mg甘氨酸于100ml水中，0℃贮藏。

用时按要求稀释。

该溶液含有200mgα-氨基氮/升。

2、实验操作

取糖化的麦芽汁1.00ml（或者是其他的合适量，使稀释后的浓度为1-3mgα-氨基氮/升），放入100ml的容量瓶中，稀释到刻度，摇匀。

标准甘氨酸溶液稀释液：

取1.00ml标准溶液，在100ml的容量瓶中稀释到刻度。

取麦芽汁稀释溶液、水、标准的甘氨酸溶液（三个）稀释液各2.00ml，放入比色管中，（水用于空白对比），各比色管中分不加入1.00ml的显色剂，摇匀，在沸水中加热16min。

（现在应该预备20℃的水浴）

20℃水浴中冷却20min。

加入5.00ml的碘酸钾稀释溶液，摇匀，在30min内于570nm处测定吸光度值。

3、运算

游离的α-氨基氮（毫克/升麦芽汁）=2×

100×

样品溶液吸光度值/标准溶液平均吸光度

1.2.9絮凝性的测定

良好的絮凝性不仅能够减少发酵液的澄清时刻，降低酵母分离的能源消耗，还可防止酵母细胞长时刻悬浮于发酵液中致使细胞自溶，有损啤酒风味。

取发酵度试验沉淀的酵母，通过洗涤和离心，称取1．0g置于带刻度的锥形离心管内，使其悬浮在10mLpH4．5的醋酸缓冲液（O.5lg硫酸钙，6．8g冰醋酸用水稀释到1L）中，静置5min后，将此悬浮液重新连续摇动，使酵母重新全部悬浮起来，静置观看酵母凝聚沉降速度。

表2不同菌株絮凝性的比较

本斯值（ml）3.02.83.02.83.2

分不称取不同菌株酵母在离心管中摇匀，静置沉降时，形成一清晰界面逐步下降。

酵母在沉降时形成一清晰界面，讲明该酵母是凝集性酵母，从图2可见发酵度较高的菌株凝集性能稍差（做本试验时，室温若超过20℃，这对酵母的凝集性可能稍有阻碍）。

1.2.10还原性糖的测定

斐林试剂比色法测定还原糖（临时不采纳）

二、材料、仪器设备及试剂

1.分光光度计；

2.分析天平（感量1／10000）；

3.水浴锅；

4.具塞刻度试管；

5.刻度吸管；

6.容量瓶；

7.离心机

1.斐林试剂A液：

40gCuSO4.5H2O溶解于蒸馏水定容至1L。

2.斐林试剂B液：

200g酒石酸钾钠（KNaC4H4O6.5H2O）与150gNaOH溶于蒸馏水中，并定容至1升。

A、B两液分不贮存，使用前等体积混合。

3.0.1％葡萄糖标准液：

取80℃下烘至恒重的葡萄糖0.1000g，加蒸馏水溶解，定容至100ml。

4.0.1moL/LNaOH。

5.甲基红指示剂：

0.1g甲基红溶于250mL60％乙醇中。

6.10％Pb（Ac）2。

7.饱和Na2SO4（20℃19.5g）。

三、实验步骤

2.对含蛋白质较多的样品，此间可加10％Pb（Ac）2，除去蛋白质，至不再产生白色絮状沉淀时，加饱和Na2SO4除去余外的铅离子。

3.样品测定：

吸取6ml待测液，加4ml斐林试剂，其它操作与标准曲线相同，在590nm波长下读取吸光度。

以不含样品的空白管的吸光度减去样品管的吸光度，在标准曲线上查出糖含量.

按下式运算还原糖的百分含量：

还原糖（％）＝查得的糖毫克数×

样品总体积×

稀释倍数/（测定时取用体积×

样品重×

1000）×

100

方法2：

试剂与材料（临时采纳此方法）

1.斐林试剂

甲69.3CuSO4.5H2O1000mL50mL/组

乙346g酒石酸钾钠+100gNaOH1000mL50mL/组

2、1%次甲基蓝

1g次甲基蓝+100mL水/班棕色瓶子储存

3、0.2%标准G2gG105度烘干到恒重加水到1000mL2000mL/班

4、碱式滴定管5、样品溶液：

待测G液

样品1：

稀释20倍，1000mL/班

样品2：

稀释50倍，1000mL/班6、电炉

操作方法：

1、斐林试剂标定

A取甲液5mL+乙液5mL，（注意：

甲液与乙液混合可生成氧化亚铜沉淀，应将甲液加入乙液，使开始生成的氧化亚铜沉淀重溶）置于250mL三角瓶中加入10mL水，并从滴定管加入0。

2%的标准G若干毫升（约23mL）。

（量操纵在后滴定时消耗G在0.5—1.0mL）

B电炉上加热至沸，并坚持微沸2分钟，加2滴1%次甲基溶液，趁沸以每两秒1滴的速度连续为滴加葡萄糖标准溶液用0.2%标准G滴定至蓝色消逝，有红棕色沉淀，溶液清亮为终点止。

记录耗用的G量V0，必须在1min内完成。

2、定糖预备试验

同1法取斐林试剂，加10mL样品液，摇匀于电炉上加热至沸腾，保持微沸2min,加2滴1%次甲基蓝，用0.2%G滴定至蓝色消逝。

记录耗用的G量为V1

3、样品中还原糖测定

同上法吸取斐林试剂加10mL样品液（预先稀释），补加（V0-V1）mL水，并从滴定管中预先加入（V1-1）mL0.2%G，摇匀至电炉上加热至沸，保持2min微沸，加入2滴1%次甲基蓝，连续用G滴定至蓝色消逝。

记录消耗的标准G体积为V毫升。

4、体积运算

还原糖含量（以G计）（g/mL）

=（V0-V）*0.002*1/10*n

V0----斐林试剂标定值，mL

V------样品糖液测定值，mL

0.002----标准GS液浓度，g/mL

10-----样品糖液体积，mL

n-----样品稀释倍数

方案中几处指标采纳多种方法，确实是为了提升测量数据的准确率，同时比较检测方法的容易性、工作量、试剂的种类，以确定最终的方案。