1、显微镜直截了当计数法:比较直观,我们能够直截了当显微观看,多人工作计数。耗时较短,且工作量较小,同时我系其他实验组采纳此方法计数,可供参考。3:光电比浊法:尽管绘制标准曲线要求较高,然而工作量较小,且一次绘制好标准曲线好后,以后能够用,准确率较高。比较三种方法,我倾向于第一种和第三种,二者相比较,能够校正方案。实验步骤:打开30W紫外灯预热30min,使其功率达到稳固。1取斜面菌苔一环于2OmL麦汁中混匀,28活化培养14h。2取4mL培养液以3000r/min的速度离心15min,弃上清液加入4mL生理盐水洗涤,在电磁振荡仪上震荡10min左右,重复2次,制成5mL悬液,用血球计数板在显微镜
2、下直截了当计数,调整细胞浓度。3取诱变前的1mL菌悬液进行适当稀释,分离出3个合适的稀释度倾注琼脂平板,约为10-3、10-4、10-5,每一个梯度3个平板,每一个平板加0.2mL菌液,进行培养后平板计数法,作为对比。4取菌悬液5mL移入无菌培养皿中,加入一无菌磁力转子,置于磁力搅拌器上。5 30W紫外灯下30cm处照耀,调整照耀时刻。此次预设为0,30,45,60,90,120,180,600.(单位s)6取一定稀释梯度的紫外照耀菌液0.1(视具体情形而定)用无菌涂布棒涂布平均,每组做三个平行线培养记录菌落数,运算各照耀时刻下的致死率。(选在75%-80%)。致死率=未经照耀菌落数-紫外照耀
3、菌落数未经紫外照耀菌落数7挑取平板上生长迅速菌落比较大的菌株进行斜面培养,然后重复1-5,再重复第5步,挑取平板上生长迅速、菌落比较大的菌株进行斜面培养,连续进行5次,28培养20h左右,运算其突变率和致死率。(上述时刻等数字视为参考数值)1.2.3.1初筛诱变后选择在麦芽汁固体培养基上生长良好,菌落呈中等大小、乳白色、表面光滑和边缘整齐的菌落移接斜面供复筛。1.2.3.2复筛供复筛的菌株进行500ml三角瓶低温发酵,测定发酵液中的双乙酰含量并以此作为复筛的标准。同时测定发酵液中双乙酰含量最低的几株酵母的其它性能。双乙酰含量测定:初筛获得的菌株经500ml三角瓶内装300ml 120Bx麦芽汁
4、发酵8d后,测定发酵液中的双乙酰含量,选择发酵液中双乙酰含量低的菌株进行二次发酵,将双乙酰含量明显降低的4 株菌分不编号为FB-E1、FB-E2、FB-E3 和FB-E4 。结果见表1 表1 发酵液中双乙酰含量的比较菌株 F B FB-E1 FB-E2 FB-E3 FB-E4双乙酰含量 (mg/L) 0.1233 0.0706 0.0926 0.0776 0.0870降低率(%) 0 42.7 24.9 37.1 29.4(此处绘制表格样式视为参考)降低前驱物质-乙酰乳酸的生产量措施:改良酵母菌种 提升麦汁中-氨基氮含量,能够抑制合成酶的活性2加速双乙酰的还原提升酵母的细胞密度(增大酵母菌的接
5、种量)提升还原温度(封罐后高温还原)限制后期酵母的出芽率(封罐)国标中关于啤酒中双乙酰的量的要求二级啤酒:0.2mg/L 一级啤酒:0.13mg/L方法:国标GB4927-2001检测培养条件:恒温12度发酵栓培养8d后检测发酵液中双乙酰的含量。原理:双乙酰的测定方法采纳比色法。邻苯二胺比色法是连二酮类都能发生显色反应的方法,因此,此法测得之值为双乙酰与戊二酮的总量,结果偏高。但此法快速简便。用蒸汽将双乙酰从样品中蒸馏出来,加邻苯二胺,形成2,3二甲基喹喔琳,其盐酸盐在335nm波长下有一最大吸取峰,可进行定量测定。1仪器:带有加热套管的双乙酰蒸馏器,蒸汽发生瓶(2000mL或3000mL)或
6、者锥形瓶,平底烧瓶,容量瓶25mL2试剂和溶液盐酸溶液(4moL/L),邻苯二铵溶液:10g/L(称取邻苯二铵0.1g用盐酸溶液溶解并定容至10mL摇匀,放于阴暗处,注意此溶液即用即配)消泡剂 3实验步骤(1)把双乙酰蒸馏器安装好,把夹套蒸馏器下端的排气夹子打开。(2)将内装2.5mL蒸馏水的容量瓶(或量筒)放于冷凝器下,使出口尖端浸没在水面下,外加冰水冷却。(3)加热蒸汽发生器至沸,通汽加热夹套,备用。(4)于100mL量筒中加入24滴消泡剂,再注入5左右未除气啤酒100mL。(5)待夹套蒸馏器下端冒大汽时,打开进样口瓶塞,将啤酒迅速注入蒸馏器内,再用约10mL蒸馏水冲洗量筒,同时倒入,迅速
7、盖好进样口塞子,用水封口。(6)待夹套蒸馏器下端再次冒大汽时,将排气夹子夹住,开始蒸馏,到馏出液接近25mL时取下容量瓶,用水定容至25mL,摇匀(蒸馏应在3分钟内完成)。(7)分不吸取馏出液10mL于两支比色管中。一管作为样品管加入0.5mL邻苯二胺溶液,另一管不加作空白,充分摇匀后,同时置于暗处放置20-30分钟,然后于样品管中加2mL4N盐酸溶液,于空白管中加2.5mL4N盐酸溶掖,混匀。(8)在335nm波长处,用1cm比色皿以空白作对比测定样品吸光度。(9)运算:双乙酰(mgL)A3352.4(用20mm石英比色皿时,吸光度与双乙酰的换算系数)注:若用20mm的石英比色皿则换算系数则
8、为1.21.2.4不同菌株的发酵性能测试(CO2失重法)将发酵摇瓶置于26度恒温环境中,每天称重1次(直至日失重小于0.5g为止),因每瓶用于发酵的麦芽汁体积相同,因此只需运算发酵后单位时刻内CO2的开释量,发酵6d,以CO2 产生量为纵坐标,发酵时刻为横坐标,绘制C02产生量曲线。1.2.6不同菌株发酵发酵液中残留总糖含量测定从8个发酵后的发酵瓶中各取0.2mL发酵液并稀释500倍,用硫酸-苯酚法测定发酵液中残留总糖的含量。附录:硫酸-苯酚法1)葡萄糖标准液的配制准确称取干燥恒重的葡萄糖20mg,蒸馏水准确定容500mL得到0.04mg/L的葡萄糖液。2)试剂1)浓硫酸:分析纯,95.5%2
9、)80%苯酚:80克苯酚(分析纯重蒸馏试剂)加20克水使之溶解,可置冰箱中避光长期储存。3)6%苯酚:临用前以80%苯酚配制。(每次测定均需现配)4)15%三氯乙酸(15%TCA):15克TCA加85克水使之溶解,可置冰箱中长期储存。5)5%三氯乙酸(5%TCA):25克TCA加475克水使之溶解,可置冰箱中长期储存。6)6mol/L 氢氧化钠:120克分析纯氢氧化钠溶于500ml水。7)6mol/L盐酸表1 标准曲线的制作步骤管号 0 1 2 3 4 5 6 7 8葡萄糖 0.0 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8蒸馏水 2.0 1.6 1.4 1.2 1.0 0
10、.8 0.6 0.4 0.2苯酚液 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0浓硫酸 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0取8支洁净的具塞试管按表2方法操作,摇匀后放置5min,置沸水浴中加热15min,取出迅速冷却至室温,以0号作为空白调零,在最大吸取波长处测定吸光度。以葡萄糖浓度X为横坐标(ug/mL),吸光度Y为纵坐标,从而来绘制标准曲线。1制作标准曲线:准确称取标准葡聚糖(或葡萄糖)20mg于500ml容量瓶中,加水至刻度,分不吸取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8,各以蒸馏水补至2.0ml,然后
11、加入6%苯酚1.0ml及浓硫酸5.0ml,摇匀冷却,室温放置20分钟以后于490nm测光密度,以2.0ml水按同样显色操作为空白,横坐标为多糖微克数,纵坐标为光密度值,得标准曲线。2样品含量测定:取样品1克(湿样)加1mL15%TCA(三氯醋酸)溶液研磨,再加少许5TCA溶液研磨,倒上清液于10毫升离心管中,再加少许5TCA溶液研磨,倒上清液,重复3次。最后一次将残渣一起到入离心管。注意:总的溶液不要超出10毫升。(既不要超出离心管的容量)。离心,转速3000转/分钟,共三次。第一次15分钟,取上清液。后两次各5分钟取上清液到25毫升锥形比色管中。最后滤液保持18毫升左右。水浴,在向比色管中加
12、入2毫升6mol/L 盐酸之后摇匀,在96水浴锅中水浴2小时。定容取样。水浴后,用流水冷却后加入2毫升6mol/L 氢氧化钠摇匀。定容至25毫升的容量瓶中。吸取0.2ml的样品液,以蒸馏补至2.0ml,然后加入6%苯酚1.0ml及浓硫酸5.0ml,摇匀冷却室温放置20分钟以后于490nm测光密度。每次测定取双样对比。以标准曲线运算多糖含量。1.2.7不同菌株产酒精能力(酒精度)测试快速氧化法乙醇在酸性条件下,通过量的、一定浓度的重铬酸钾作用,氧化生成醋酸。再将剩余的的重铬酸钾经硫代硫酸钠还原。由反应过程中,通过消耗的硫代硫酸钠的量运算酒精含量。试剂:重铬酸钾溶液、硝酸溶液、碱性碘化钾溶液、淀粉
13、溶液、硫代硫酸钠标准溶液在蒸馏器的接收瓶中,加入10.00ml重铬酸钾溶液和25ml硝酸溶液。并将空气冷凝器的出口插入此溶液中。在蒸馏瓶中加入12ml水和1.00ml试样。接好装置,迅速加热至沸,并连续煮沸3分钟,蒸馏即告完成。在同意瓶中,加入300ml水、10ml碱性碘化钾溶液及10ml淀粉溶液,在电磁搅拌器搅拌下,用硫代硫酸钠标准溶液滴定至淡青色的淀粉终点。通过如下公式运算酒精含量。酒精(%,V/V)=(20.00-0.6575V)/Vs式中V硫代硫酸钠标准溶液滴定量Vs试样取样量方法二:2.2 蒸馏密度瓶法2.2.1 仪器 全玻璃蒸馏器(500mL)、恒温水浴(精度0.1)、容量瓶(10
14、0mL)、移液管(100 ml)分析天平(感量0.1mg)、天平(感量0.1g)、25 ml附温度计密度瓶2.2.2 操作方法用100mL容量瓶准确量取试样100ml,置于蒸馏瓶中,用50ml水分三次冲洗容量瓶,洗液并入蒸馏瓶中,加玻璃珠数粒,装上蛇型冷凝管,用原100ml容量瓶接收馏出液(外加冰浴),慢慢加热蒸馏,收集约96ml馏出液(蒸馏应在30-60分钟内完成),取下容量瓶,调温到20,补水定容,混匀。用25mL附温度计密度瓶测试样馏出液20的相对密度,按照相对密度查表,得到试样馏出液的酒精度(%,V/V),即为试样的酒精度。2.3 蒸馏装置2.3.2 试剂重铬酸钾溶液、优级纯无水乙醇2
15、.4操作方法2.4.1标准曲线的制备吸取1ml无水乙醇于100ml容量瓶中,稀释至刻度,混匀。分不吸取此稀释液0、1、2、3、4、5、6、7ml于50 ml容量瓶中,各加15.0 ml重铬酸钾溶液,加水至刻度,混匀。此标准系列相当于试样中含有0.0、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00、7.00(V/V)的酒精。以空白标准作参比,在波长610nm,用1cm比色皿测定其余各标准的吸光度。用吸光度对酒精浓度作图,绘标准曲线。2.4.2试样的测定在500ml蒸馏烧瓶中,加入100.0ml试样。按1.2方法进行蒸馏,最后加适量水将蒸馏液补足为100.0ml。吸取1.0ml蒸馏液于
16、50 ml容量瓶中,按标准曲线的制备的操作测定其吸光度,由标准曲线查出酒精含量(%、V/V)。1.2.8-氨基氮含量的测定 水合茚三酮是一种氧化剂,可使氨基酸脱羧氧化,而本身被还原成还原型水合茚三酮。还原型水合茚三酮再与末还原的水合茚三酮及氨反应,生成蓝紫色缩合物,颜色深浅与游离氨基氮含量成正比,可在570nm下比色测定。(1)样品稀释 适当稀释样品至含13g氨基氮/mL(麦汁一样稀释100倍,啤酒50倍,啤酒应先除气)。(2)测定 取9支10mL比色管,其中3支吸入2mL甘氨酸标准溶液,另3支各吸入2mL试样稀释液,剩下3支吸入2mL蒸馏水。然后各加显色剂1 mL,盖玻塞,摇匀,在沸水浴中加
17、热l 6分钟。取出,在20冷水中冷却20分钟,分不加5mL碘酸钾稀释液,摇匀。在30分钟内,以水样管为空白,在570nm波长下测各管的光密度。运算:氨基氮含量(g/mL)=(样品管平均O.D./标准管平均O.D.)2稀释倍数讲明:式中(样品管平均O.D./标准管平均O.D.):表示样品管与标准管之间的氨基氮之比;标准管的氨基氮浓度(g/mL),即(0.107214/75)100; -氨基氮的测定(茚三酮法) 1、实验试剂 a显色剂 100克磷酸氢二钠(Na2HPO4.12H2O) 60克磷酸二氢钾(KH2PO4) 5.00克水合茚三酮 3.00克果糖 用水溶液溶解后稀释至1升(此溶液在低温下用
18、棕色瓶可储存2周,pH应为6.6-6.8。操作时能够按比例配成100ml)。b稀释溶液:2克碘酸钾溶于600ml水中,再加入96%乙醇400ml. c标准溶液:溶107.2mg甘氨酸于100ml水中,0贮藏。用时按要求稀释。该溶液含有200mg-氨基氮/升。2、实验操作 取糖化的麦芽汁1.00ml(或者是其他的合适量,使稀释后的浓度为1-3mg-氨基氮/升),放入100ml的容量瓶中,稀释到刻度,摇匀。标准甘氨酸溶液稀释液:取1.00ml标准溶液,在100ml的容量瓶中稀释到刻度。取麦芽汁稀释溶液、水、标准的甘氨酸溶液(三个)稀释液各2.00ml,放入比色管中,(水用于空白对比),各比色管中分
19、不加入1.00ml的显色剂,摇匀,在沸水中加热16min。(现在应该预备20的水浴) 20水浴中冷却20min。加入5.00ml的碘酸钾稀释溶液,摇匀,在30min内于570nm处测定吸光度值。3、运算游离的-氨基氮(毫克/升麦芽汁)=2100样品溶液吸光度值 / 标准溶液平均吸光度1.2.9絮凝性的测定良好的絮凝性不仅能够减少发酵液的澄清时刻,降低酵母分离的能源消耗,还可防止酵母细胞长时刻悬浮于发酵液中致使细胞自溶,有损啤酒风味。取发酵度试验沉淀的酵母,通过洗涤和离心,称取10 g置于带刻度的锥形离心管内,使其悬浮在10 mL pH45的醋酸缓冲液(O.5l g硫酸钙,68g冰醋酸用水稀释到
20、1 L)中,静置5min后,将此悬浮液重新连续摇动,使酵母重新全部悬浮起来,静置观看酵母凝聚沉降速度。表2 不同菌株絮凝性的比较本斯值(ml) 3.0 2.8 3.0 2.8 3.2分不称取不同菌株酵母在离心管中摇匀,静置沉降时,形成一清晰界面逐步下降。酵母在沉降时形成一清晰界面,讲明该酵母是凝集性酵母,从图2可见发酵度较高的菌株凝集性能稍差(做本试验时,室温若超过20,这对酵母的凝集性可能稍有阻碍)。1.2.10还原性糖的测定斐林试剂比色法测定还原糖(临时不采纳)二、材料、仪器设备及试剂1. 分光光度计;2.分析天平(感量110000);3.水浴锅;4. 具塞刻度试管;5.刻度吸管;6.容量
21、瓶;7.离心机1. 斐林试剂A液:40gCuSO4.5H2O溶解于蒸馏水定容至1L。2.斐林试剂B液:200g酒石酸钾钠(KNaC4H4O6.5H2O)与150gNaOH溶于蒸馏水中,并定容至1升。A、B两液分不贮存,使用前等体积混合。3.0.1葡萄糖标准液:取80下烘至恒重的葡萄糖0.1000g,加蒸馏水溶解,定容至100ml。4.0.1moL/LNaOH。5.甲基红指示剂:0.1g甲基红溶于250mL60乙醇中。6.10Pb(Ac)2。7.饱和Na2SO4(2019.5g)。三、实验步骤2.对含蛋白质较多的样品,此间可加10Pb(Ac)2,除去蛋白质,至不再产生白色絮状沉淀时,加饱和Na2
22、SO4除去余外的铅离子。3.样品测定:吸取6ml待测液,加4ml斐林试剂,其它操作与标准曲线相同,在590nm波长下读取吸光度。以不含样品的空白管的吸光度减去样品管的吸光度,在标准曲线上查出糖含量.按下式运算还原糖的百分含量: 还原糖()查得的糖毫克数样品总体积稀释倍数/(测定时取用体积样品重1000)100方法2:试剂与材料(临时采纳此方法)1.斐林试剂甲69.3 CuSO4.5H2O 1000mL 50mL/组乙346g酒石酸钾钠+100gNaOH 1000mL 50mL/组2、1%次甲基蓝1g次甲基蓝+100mL水/班 棕色瓶子储存3、0.2%标准G 2gG105度烘干到恒重加水到100
23、0mL 2000mL/班4、碱式滴定管 5、样品溶液:待测G液样品1:稀释20倍,1000mL/班样品2:稀释50倍,1000mL/班 6、电炉操作方法:1、斐林试剂标定A取甲液5mL+乙液5mL,(注意:甲液与乙液混合可生成氧化亚铜沉淀,应将甲液加入乙液,使开始生成的氧化亚铜沉淀重溶)置于250mL三角瓶中加入10mL水,并从滴定管加入0。2%的标准G若干毫升(约23mL)。(量操纵在后滴定时消耗G在0.51.0mL)B电炉上加热至沸,并坚持微沸2分钟,加2滴1%次甲基溶液,趁沸以每两秒1滴的速度连续为滴加葡萄糖标准溶液用0.2%标准G滴定至蓝色消逝,有红棕色沉淀,溶液清亮为终点止。记录耗用
24、的G量V0,必须在1min内完成。2、定糖预备试验 同1法取斐林试剂,加10mL样品液,摇匀于电炉上加热至沸腾,保持微沸2min,加2滴1%次甲基蓝,用0.2%G滴定至蓝色消逝。记录耗用的G量为V13、样品中还原糖测定同上法吸取斐林试剂加10mL样品液(预先稀释),补加(V0-V1)mL水,并从滴定管中预先加入(V1-1)mL0.2%G,摇匀至电炉上加热至沸,保持2min微沸,加入2滴1%次甲基蓝,连续用G滴定至蓝色消逝。记录消耗的标准G体积为V毫升。4、体积运算还原糖含量(以G计)(g/mL)=(V0-V)*0.002*1/10*nV0-斐林试剂标定值,mLV-样品糖液测定值,mL0.002-标准GS液浓度,g/mL10-样品糖液体积,mLn-样品稀释倍数方案中几处指标采纳多种方法,确实是为了提升测量数据的准确率,同时比较检测方法的容易性、工作量、试剂的种类,以确定最终的方案。
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