LC经验总结文档格式.docx

LC经验总结文档格式.docx

《LC经验总结文档格式.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《LC经验总结文档格式.docx（15页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

①用部分装液法进样时，进样量应不大于定量环体积的50%（最多75%），并要求每次进样体积准确、相同。

②用完全装液法进样时，进样量一般定量环体积的3~5倍，这样才能完全置换定量环内的流动相，消除管壁效应，确保进样的准确度及重复性。

　　六通阀使用和维护：

①样品溶液进样前必须用0.45μm滤膜过滤，以减少微粒对进样阀的磨损。

②转动阀芯时不能太慢，更不能停留在中间位置，否则流动相受阻，使泵内压力剧增，甚至超过泵的最大压力;

再转到进样位时，过高的压力将使柱头损坏。

③为防止缓冲盐和样品残留在进样阀中，每次分析结束后应冲洗进样阀。

通常可用水冲洗，或先用能溶解样品的溶剂冲洗，再用水冲洗。

　　三.色谱柱　　柱的使用和维护:

　　①　避免压力和温度的急剧变化及任何机械震动。

温度的突然变化或者使色谱柱从高处掉下都会影响柱内的填充状况;

柱压的突然升高或降低也会冲动柱内填料，因此在调节流速时应该缓慢进行。

　　②　应逐渐改变溶剂的组成，特别是反相色谱中，不应直接从有机溶剂直接改变为水相。

　　③　一般说来色谱柱不能反冲，只有生产者指明该柱可以反冲时，才可以反冲除去留在柱头的杂质。

否则反冲会迅速降低柱效。

　　④　选择使用适宜的流动相（尤其是pH），以避免固定相被破坏。

有时可以在进样器前面连接一预柱，分析柱与预柱填料相似。

　　⑥　经常用强溶剂冲洗色谱柱，清除保留在柱内的杂质。

在进行清洗时，对流路系统中流动相的置换应以相混溶的溶剂逐渐过渡，每种流动相的体积至少应是柱体积的5倍以上。

　　四.检测器　　UV检测器是HPLC中应用最广泛的检测器，主要性能指标:

1）噪音和漂移：

在仪器稳定之后，记录基线1小时，基线带宽为噪音，基线在1小时内的变化为漂移。

它们反映检测器电子元件的稳定性，及其受温度和电源变化的影响，如果有流动相从色谱柱流入检测器，那么它们还反映流速（泵的脉动）和溶剂（纯度、含有气泡、固定相流失）的影响。

　　2）灵敏度（sensitivity）：

表示一定量的样品物质通过检测器时所给出的信号大小。

　　3）检测限.检测器灵敏度的高低，并不等于它检测最小样品量或最低样品浓度能力的高低，因为在定义灵敏度时，没有考虑噪声的大小，而检测限与噪声的大小是直接有关的。

检测限是检测器的一个主要性能指标，其数值越小，检测器性能越好。

　　检测器的故障及排除　　1）流动池内有气泡　　如果有气泡连续不断地通过流动池，将使噪音增大，如果气泡较大，则会在基线上出现许多线状"

峰"

，这是由于系统内有气泡，需要对流动相进行充分的除气。

　　2）流动池被污染　　无论参比池或样品池被污染，都可能产生噪音或基线漂移。

可以使用适当溶剂清洗检测池，要注意溶剂的互溶性;

如果污染严重，就需要依次采用1mol/L硝酸、水和新鲜溶剂冲洗，或者取出池体进行清洗。

检测器对温度有一定的敏感度。

紫外检测器一般在温度波动超过±

0.5℃时，就会造成基线漂移起伏。

流动相：

理想的液相色谱流动相溶剂应具有低粘度、与检测器兼容性好、易于得到纯品和低毒性等特征。

反相色谱的流动相通常以水作基础溶剂，再加入一定量的能与水互溶的极性调整剂，如甲醇、乙腈、四氢呋喃等。

极性调整剂的性质及其所占比例对溶质的保留值和分离选择性有显著影响。

一般情况下，甲醇-水系统已能满足多数样品的分离要求，且流动相粘度小、价格低，是反相色谱最常用的流动相。

但现在多采用乙腈-水系统做初始实验，因为与甲醇相比，乙腈的溶剂强度较高且粘度较小，并可满足在紫外185~205nm处检测的要求。

　　溶剂的截止波长：

将溶剂装入1cm的比色皿，以空气为参比，逐渐降低入射波长，溶剂的吸光度A=1时的波长称为溶剂的截止波长。

也称极限波长。

第二篇常见问题：

高效液相色谱仪的几个使用问题

1.色谱柱中的流动相会排干吗?

　　不少做色谱分离试验的人遇到过这样的情形：

不慎未及时补充流动相，泵将溶剂瓶中的流动相吸干了，HPLC系统由此而停止工作了。

如此情况是否会损坏色谱柱?

泵是否已将色谱柱中所有流动相都排干了?

色谱柱还能使用吗?

事实上，如果泵将溶剂瓶中的流动相吸干，并不会造成色谱柱的损坏。

即使泵中充满了空气，泵也不会将空气排入色谱柱。

因为泵只能输送液体，而不能输送空气。

相比之下，另一个更可能发生的情况是忘记盖上色谱柱两端的密封盖或盖子太松而使色谱柱变干。

同样，整个色谱柱干涸的情况不太容易发生，多半可能只是色谱柱两端的几个毫米变干了，因挥发掉所有溶剂是色谱柱变干需要相当长的时间。

即使色谱柱真的变干了，也不一定就不可救药了。

可以尝试用一种完全脱气的、表面张力低的溶剂（如经氦气脱气的甲醇）冲洗色谱柱以除去气体。

较低的表面张力有助于浸润填料表面;

已脱气的溶剂应该能够溶解并去除滞留在填料中的气体。

色谱柱大约需要（以1mL/min的流速）冲一个小时或更多的时间被彻底浸润，恢复到正常状态。

2.使用PEEK（polyetheretherketone）管路和接头需要注意什么问题?

　　如果经常需要改变流路或更换不同品牌的色谱柱，使用PEEK材料制成的管路和接头会非常方便。

PEEK管路容易连接;

PEEK接头不仅无需工具，手拧即可固定，而且容易调节锥箍之外的管路长度，方便与不同品牌或规格的色谱柱相连接。

使用此类材料的管路需要注意的是：

PEEK对卤代烷烃和四氢呋喃的兼容性不好。

虽然未观察到上述溶剂溶解PEEK材料的明显迹象，但PEEK遇到上述溶剂会变脆。

另一个西药考虑的因素是压力限。

不锈钢管可耐受6000psi的压力，但PEEK管只能耐受近4000psi（但多数HPLC应用系统压力不会超过3000psi）。

　　使用PEEK接头时则无需担心接头耐溶剂性能，因为接头几乎或很少与溶剂直接接触。

但手拧固定的PEEK接头压力限低于不锈钢管，因而压力太高时，可能会使接头在管路上滑动而产生死体积或漏液。

3.如何预防液相泵的故障:

要保持泵的良好操作性能,必须维护系统的清洁,保证溶剂和试剂的质量,对流动相进行过滤和脱气.下面列出预防泵故障的几项措施:

1）.用高质量试剂和HPLC级溶剂;

2）、过滤流动相和溶剂;

3）、脱气;

4）、每天开始使用时放空排气，工作结束后从泵中洗去缓冲液;

5）、不让水或腐蚀性溶剂滞留泵中;

6）、定期更换垫圈;

7）、需要时加润滑油;

8）、查阅有关泵操作手册中的其它建议。

处于良好操作状态的泵，应该能使色谱图上的基线平稳;

保留时间的重复性好。

在等度洗脱时压力波动小于2%。

梯度洗脱时压力变化应是缓慢和平稳的。

为了使故障发生后尽快排除，平时应常备密封、单向阀（入口与出口）、泵头装置、各式接头、保险丝等部件，以及更换工具。

第三篇故障排除

HPLC故障及排除方法诊状 

可能的原因 

解决方法

（一）保留时间变化 

1.柱温变化 

柱恒温 

2.等度与梯度间未能充分平衡 

至少用10倍柱体积的流动相平衡柱 

3.缓冲液容量不够 

用>

25mmol/L的缓冲液 

4.柱污染 

每天冲洗柱 

5.柱内条件变化 

稳定进样条件,调节流动相 

6.柱快达到寿命 

采用保护柱

（二）保留时间缩短 

1.流速增加 

检查泵,重新设定流速 

2.样品超载 

降低样品量 

3.键合相流失 

流动相PH值保持在3~7.5检查柱的方向 

4.流动相组成变化 

防止流动相蒸发或沉淀 

5.温度增加 

柱恒温

（三）保留时间延长 

1.流速下降 

管路泄漏,更换泵密封圈,排除泵内气泡 

2.硅胶柱上活性点变化 

用流动相改性剂,如加三乙胺,或采用碱至钝化柱 

同前

（二）3 

同前

（二）4 

5.温度降低 

同前

（二）5

（四）出现肩峰或分叉 

1.样品体积过大 

用流动相配样,总的样品体积小于第一峰的15% 

2.样品溶剂过强 

采用较弱的样品溶剂 

3.柱塌陷或形成短路通道 

更换色谱柱,采用较弱腐蚀性条件 

4.柱内烧结不锈钢失效 

更换烧结不锈钢,加在线过滤器,过滤样品 

5.进样器损坏 

更换进样器转子

（五）鬼峰 

1.进样阀残余峰 

每次用后用强溶剂清洗阀,改进阀和样品的清洗 

2.样品中未知物 

处理样品 

3.柱未平衡 

重新平衡柱,用流动相作样品溶剂（尤其是离子对色谱） 

4.三氟乙酸（TFA）氧化（肽谱） 

每天新配,用抗氧化剂 

5.水污染（反相） 

通过变化平衡时间检查水质量，用HPLC级的水

（六）基线噪声 

1.气泡（尖锐峰） 

流动相脱气,加柱后背压 

2.污染（随机噪声） 

清洗柱,净化样品,用HPLC级试剂 

3.检测器灯连续噪声 

更换氘灯 

4.电干扰（偶然噪声） 

采用稳压电源,检查干扰的来源（如水浴等） 

5.检测器中有气泡 

流动相脱气,加柱后背压

（七）峰拖尾 

1.柱超载 

降低样品量,增加柱直径采用较高容量的固定相 

2.峰干扰 

清洁样品,调整流动相 

3.硅羟基作用 

加三乙胺,用碱致钝化柱增加缓冲液或盐的浓度降低流动相PH值,钝化样品 

4.同前（四）4 

同前（四）4 

5.同前（四）3 

5.同前（四）3 

6.死体积或柱外体积过大 

连接点降至最低,对所有连接点作合适调整,尽可能采用细内径的连接管 

7.柱效下降 

用较低腐蚀条件,更换柱,采用保护柱

（八）峰展宽 

1.进样体积过大 

同（四）1 

2.在进样阀中造成峰扩展 

进样前后排出气泡以降低扩散 

3.数据系统采样速率太慢 

设定速率应是每峰大于10点 

4.检测器时间常数过大 

设定时间常数为感兴趣第一峰半宽的10% 

5.流动相粘度过高 

增加柱温,采用低粘度流动相 

6.检测池体积过大 

用小体积池,卸下热交换器 

7.保留时间过长 

等度洗脱时增加溶剂含量也可用梯度洗脱 

8.柱外体积过大 

将连接管径和连接管长度降至最小 

9.样品过载 

进小浓度小体积样品

第四篇压力异常解决

压力异常操作压力的变化往往是故障的征兆。

从下表中找出所观察到的现象，并在右侧的列表中参考相应的解决方法。

A、 

没有压力显示，没有流动相流动原因 

解决方法1、电源问题 

1、接通电源，开机2、保险丝被烧坏 

2、更换保险丝3、控制器设定不正确或设定失败 

3、a、采取恰当的设定b、修理或更换控制器4、柱塞杆折断 

4、更换柱塞杆5、泵头内有空气 

5、溶剂脱气、启动泵抽出空气6、流动相不足 

6、a、补充流动相b、更换入口滤头7、单向阀损坏 

7、更换单向阀8、漏液 

8、拧紧或更换手紧接头B、 

流动相流动正常，但没有压力显示原因 

解决方法1、仪表损坏 

1、更换仪表2、压力传感器损坏 

2、更换压力传感器C、 

压力持续偏高原因 

解决方法1、流速设定过高 

1、调整流速设定2、柱前筛板堵塞 

2、a、在允许情况下反冲色谱柱b、更换筛板c、更换色谱柱3、流动相使用不当或缓冲盐的结晶沉淀 

3、a、使用恰当的流动相b、冲洗色谱柱4、色谱柱选择不当 

4、选择恰当的色谱柱5、进样阀损坏 

5、清洗或更换进样阀6、柱温过低 

6、提高温度7、控制器失常 

7、修理或更换控制器8、保护柱阻塞 

8、清洗或更换保护柱9、在线过滤器阻塞 

9、清洗或更换在线过滤器D、 

压力持续偏低原因 

解决方法1、流速设定过低 

1、调整流速2、系统漏液 

2、确定漏液位置并维修3、色谱柱选择不当 

3、选择恰当的色谱柱4、柱温过高 

4、降低温度5、控制器失常 

5、维修或更换控制器E、 

压力不断上升原因 

解决方法1、见列表C 

1、见列表CF、 

压力降为零原因 

解决方法1、见列表A、B 

1、见列表A、BG、 

压力不断下降，但不回零原因 

解决方法1、见列表D 

1、见列表DH、 

压力波动原因 

解决方法1、泵中有气体 

1、a、溶剂脱气b、从泵中除去气体2、单向阀损坏 

2、更换单向阀3、泵密封损坏 

3、更换泵密封4、脱气不充分 

4、a、溶剂脱气b、改变脱气方法（使用在线脱气法等）5、系统漏液 

5、确定漏液位置并维修6、使用梯度洗脱 

6、由于流动相粘度的变化引起的压力波动漏 

液通常可以通过拧紧或更换管路接头来解决漏液的问题。

但值得注意的是过份拧紧会导致金属接头的漏液和塑料接头的磨损。

如果通过稍微拧紧接头不能解决漏液的问题，就必须将接头取下，检查是否损坏（例如，卡套损坏、密封表面有杂质）；

损坏的接头应该更换掉。

接头处漏液原因 

解决方法1、接头松动 

1、拧紧2、接头磨损 

2、更换3、接头过紧 

3、a、拧松，再重新拧紧b、更换4、接头被污染 

4、a、拆下清洗b、更换5、部件不匹配 

5、使用同一品牌的配件B、 

泵漏液原因 

解决方法1、单向阀松动 

1、a、拧紧单向阀（不必拧的过紧）b、更换单向阀2、接头松动 

2、拧紧接头（不必拧的过紧）3、混合器密封损坏 

3、a、更换混合器密封b、更换混合器4、泵密封损坏 

4、维修或更换泵密封件5、压力传感器损坏 

5、维修或更换压力传感器6、脉冲阻尼器损坏 

6、更换脉冲阻尼器7、比例阀损坏 

7、a、检查隔膜，如果漏液立即更换b、检查手紧接头，损坏的立即更换8、放空阀的损坏 

8、a、拧紧放空阀b、更换放空阀C、 

进样阀漏液原因 

解决方法1、转子密封损坏 

1、重新安装或更换进样阀2、定量环阻塞 

2、更换定量环3、进样口密封松动 

3、调整4、进样针头尺寸不合适 

4、使用恰当的进样针5、废液管中产生虹吸 

5、保持废液管高于废液液面6、废液管阻塞 

6、更换或疏通废液管D、 

色谱柱漏液原因 

解决方法1、尾端接头松动 

1、拧紧接头2、卡套内有填料 

2、拆下、清洗卡套、重新安装3、筛板厚度不合适 

3、使用合适的筛板（参考下表）筛板选择指导物质粒径 

筛板孔径3-4u 

0.5u5-20u 

2uE、 

检测器漏液原因 

解决方法1、流通池垫片损坏 

1、a、避免过大的背景压力（压力降）b、更换垫片2、流通池窗破碎 

2、更换窗口3、手紧接头漏液 

3、拧紧或更换4、废液管阻塞 

4、更换废液管5、流通池阻塞 

5、重新安装或更换液相色谱系统的许多问题都能在谱图上反映出来。

其中有一些问题可以通过改变设备参数得到解决；

而其他的问题必须通过修改操作程序来解决。

对于色谱柱和流动相的正确选择是得到好的色谱图的关键。

峰拖尾原因 

解决方法1、筛板阻塞 

1、a、反冲色谱柱b、更换进口筛板c、更换色谱柱2、色谱柱塌陷 

2、填充色谱柱3、干扰峰 

3、a、使用更长的色谱柱b、改变流动相或更换色谱柱4、流动相PH选择错误 

4、调整PH值。

对于碱性化合物，低PH值更有利于得到对称峰5、样品与填料表面的溶化点发生反应图 

5、a、加入离子对试剂或碱性挥发性修饰剂b、更改色谱柱B、 

峰前延原因 

解决方法1、柱温低 

1、升高柱温2、样品溶剂选择不恰当 

2、使用流动相作为样品溶剂3、样品过载 

3、降低样品含量4、色谱柱损坏 

4、见A1、A2C、 

峰分叉原因 

解决方法1、 

保护柱或分析柱污染图 

1、取下保护柱再进行分析。

如果必要更换保护柱。

如果分析柱阻塞，拆下来清洗。

如果问题仍然存在，可能是柱子被强保留物质污染，运用适当的再生措施。

如果问题仍然存在，入口可能被阻塞，更换筛板或更换色谱柱。

2、样品溶剂不溶于流动相 

2、改变样品溶剂。

如果可能采取流动相作为样品溶剂。

D、 

峰变形原因 

解决方法1、样品过载 

1、减少样品载量E、 

早出的峰变形原因 

解决方法1、样品溶剂选择不恰当 

1、a、减少进样体积b、运用低极性样品溶剂F、 

早出的峰拖尾程度大于晚出的峰原因 

解决方法1、柱外效应 

1、a、调整系统连接（使用更短、内径更小的管路）b、使用小体积的流通池G、 

K’增加时，脱尾更严重原因 

解决方法1、二级保留效应，反相模式 

1、a、加入三乙胺（或碱性样品）b、加入乙酸（或酸性样品）c、加入盐或缓冲剂（或离子化样品）d、更换一支柱子2、二级保留效应，正相模式 

2、a、加入三乙胺（或碱性样品）b、加入乙酸（或酸性样品）c、加入水（或多官能团化合物）d、试用另一种方法3、二级保留效应，离子对 

3、加入三乙胺（或碱性样品）H、 

酸性或碱性化合物的峰拖尾原因 

解决方法1、缓冲不合适 

1、a、使用浓度50-100mM的缓冲液b、使用Pka等于流动相PH值的缓冲液I、 

额外的峰原因 

解决方法1、样品中有其他组份 

1、正常2、前一次进样的洗脱峰 

2、a、增加运行时间或梯度斜率b、提高流速3、空位或鬼峰 

3、a、检查流动相是否纯净b、使用流动相作为样品溶剂c、减少进样体积J、 

保留时间波动原因 

解决方法1、温控不当 

1、调好柱温2、流动相组分变化 

2、防止变化（蒸发、反应等）3、色谱柱没有平衡 

3、在每一次运行之前给予足够的时间平衡色谱柱K、 

保留时间不断变化原因 

解决方法1、流速变化 

1、重新设定流速2、泵中有气泡 

2、从泵中除去气泡3、流动相选择不恰当 

3、a、更换合适的流动相b、选择合适的混合流动相L、 

基线漂移原因 

解决方法1、柱温波动。

（即使是很小的