酒曲中产酒酵母菌的筛选及发酵能力的测定Word格式.docx
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3．实验材料：
酒曲
4．种子培养基
豆芽汁培养基：
黄豆芽100g；
葡萄糖50g；
琼脂20g；
水1000ml；
PH自然。
5．发酵培养基
A
酵母抽提物0.75g，
B
蛋白胨0.75g，
C
硫酸铵0.25g，
D
磷酸二氢钾0.125g，
E
硫酸镁0.09g，
F
氯化钙0.07g，
G
葡萄糖25g，
H
蒸馏水250mL。
四、方法步骤
1、产酒酵母菌株的初选
（1）实验器材的准备与灭菌
1）清洗培养皿、锥形瓶数个，在干燥箱中干燥
2）检查并接通高压蒸汽灭菌锅，打开电源，在锅内加水，直至水位显示为高水位，设定温度为121℃，加热时间30min。
3）取出培养皿、锥形瓶，放置降温、用牛皮纸包裹放置在内锅层，加盖，并将盖上的螺栓以两两对称的方式同时旋转拧紧，防止漏气。
4）通电，在0.1Mpa，121℃，30min灭菌。
5）灭菌时间到后，切断电源，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力降至0时，打开排气阀，旋松螺旋，打开盖子，取出灭菌物品。
（2）培养基、无菌水的制备与灭菌
1）培养基的配方如下：
培养基成分
黄豆芽
100g
葡萄糖
50g
琼脂
20g
水
1000ml
PH
自然
2）配制方法
①称新鲜黄豆芽100g，置于烧杯中，再加入1000ml水，小火煮沸30min，用纱布过滤，补足失水，即制成10％豆芽汁。
②配制时，按每1000ml10％豆芽汁加入50g葡萄糖，煮沸后加入20g琼脂，继续加热融化，补足失水。
③分装、加塞、包扎，制备斜面试管。
④与包扎好的的无菌水一起高压蒸汽灭菌0.1MPa灭菌30min。
（3）倒平板：
将灭菌好的培养基在无菌条件下倒入平板培养基，作为酵母菌的固体培养基备用。
（4）样品菌悬液制备
1、取样：
用分析天平准确称取1g酒曲
2、制备悬液：
取1g样品并用9ml无菌水溶解，振荡约20min，使样品与水充分混匀，将细胞分散。
用一支无菌吸管从中吸取1ml酒曲悬液加入装有9ml无菌水的试管中，吹吸3次，让菌液混合均匀，即成10-2稀释液；
再换一支无菌吸管吸取10-2稀释液1ml，移入装有9ml无菌水的试管中，也吹吸三次，即成l0-3稀释液；
以此类推，连续稀释，制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5等一系列稀释菌液。
具体步骤可以参照下图土壤菌悬液稀释：
（5）平板涂布：
用1mL移液管分别从各菌悬液试管中取菌悬液1mL于平板培养基上，用涂棒涂布均匀，每个稀释梯度做三个平板；
（6）培养：
恒温培养箱28℃培养1-2天；
（7）观察细菌生长情况、结构状态和部落分布情况并记录，由于本次试验采用涂布平板法，无法准确知道酵母菌的含量。
（8）酵母形态的观察
从长出菌落的平板培养基上挑出酵母菌，用美蓝染色法取对数生长期的菌体进行制片，在放大10倍及40倍的显微镜下观察酵母形态，用测微尺测量酵母细胞的大小，并进行死活鉴别。
酵母菌是单细胞的真核生物，细胞核和细胞质有明显分化，个体比细菌大得多。
酵母菌的形态通常有球形、卵圆状、椭圆状、柱状或香肠状等多种形状。
酵母菌是通过芽殖进行繁殖，因此有时可以观察到带有芽的菌株。
酵母菌的菌落一般为乳白色的，湿润的圆滑菌落。
（9）酵母菌的分离纯化
采用划线法将确定为酵母菌的菌落挑出，并在无菌条件下用接种环连续划线到平板培养基上，然后恒温培养箱28℃培养1-2天。
（10）斜面接种，将划线培养基取出，从中挑取单菌落在无菌条件下接种到斜面培养基上，然后恒温培养箱28℃培养1-2天。
2、酵母菌的扩培
（1）制备种子液培养基
葡萄糖
50g；
水1000ml；
PH自然。
②配制时，按每1000ml10％豆芽汁加入50g葡萄糖，继续加热融化，补足失水。
③分装、加塞、包扎，分别装到三个三角瓶中，每个装100ml
④高压蒸汽灭菌0.1MPa灭菌30min。
（2）种子培养基接种
将灭菌好的种子培养基取出，待温度降至室温，分别从三根斜面培养基中接种环1~2环酵母菌到种子培养基中（注：
无菌条件下），恒温培养箱30℃培养1天，即可使用。
3、酵母菌的发酵试验
（1）制备发酵培养基
发酵培养基：
酵母抽提物0.75g，B
蛋白胨0.75g，C
硫酸铵0.25g，D磷酸二氢钾0.125g，E硫酸镁0.09g，F
氯化钙0.07g，G
葡萄糖25g，蒸馏水250mL。
PH自然。
配制1000mL发酵培养基
配置好后，冷却后分装到9个250ml锥形瓶中（每瓶装100ml）。
在121℃条件下高压灭菌30分钟。
（2）种子液扩大培养
将灭菌好，冷却的培养液取出，从种子培养基中取10ml种子液转移到发酵培养液中（无菌条件），每个种子液做三个发酵培养。
贴上标签，放入恒温培养箱30℃培养1~2天.
（3）酒精蒸馏与含量的测定:
4、比重计测定法测定产酒精能力：
（1）.材料：
①酒精比重计。
②100ml量筒。
③温度计。
（2）操作：
①蒸馏：
装好全套蒸馏装置，用容量瓶量取100ml发酵液，放入250ml的蒸馏瓶中，加50ml水。
迅速安装到冷凝管上进行蒸馏，并将此容量瓶用水洗净后，置冷凝管下端收集馏出液100ml，停止蒸馏，摇匀备用。
③测定：
将酒精比重计慢慢放入酒精发酵液的蒸馏液中，手持温度计插在比重计杆旁，待温度稳定后，酒精停稳时读数，读数应以弯月面下缘为准，观察视线要与弯月面下缘相平。
④校正：
根据所量的酒精度和温度、查表校正为28℃时酒精度。
0.6479－发酵糖转化为酒精的转化系数
五、实验结果与分析
1.实验测得的数据：
种子液A
种子液B
种子液C
发酵液一
2
3
发酵液二
发酵液三
发酵液温度
28℃
27℃
2.换算成酒精浓度的数据：
2.9
4.0
3.计算过的发酵率的数据：
种子液A（%）
种子液B（%）
种子液C（%）
44.75
61.74
不同酿酒酵母菌株的代谢过程有差异,对可发酵性糖的利用程度不同，可能会导致最终的酒精生成率有较大差别。
各酿酒酵母菌株的发酵及产酒情况见上表。
由表可知,发酵48小时后，用蒸馏的方法测得的酒精含量整体偏低，可能是由于实验过程中污染杂菌，或者是操作不当使大量酿酒酵母菌体死亡，故在发酵时期所获得的酒精含量不高。
本试验通过从酒曲提取酿酒酵母，并分别对多株酿酒酵母的产酒精能力进行测定和比较,初步筛选出生长较好的3株酵母菌。
通过酒精发酵试验表明,2号、3号菌株的产酒精能力良好,但由于实验操作过程中的失误或酵母菌本身的原因，导致菌种的产酒精能力普遍偏低，也说明了其诱变后提高的空间很大。
分析以上结果可知,酿酒酵母的2号菌的产酒精能力强，这为酵母菌的进一步诱变处理，得到更高的产酒精能力提供了理论依据。
可以对2号菌株进行诱变处理，进一步提高酵母的产酒精的能力。
六、实验感想
此次实验从最开始的查资料，确定方案，再到配制培养基，菌种的分离、纯化、培养、鉴定，以及后来的酒精蒸馏提取，测产酒精能力等过程中或多或少的遇到了一些问题，平常理论的时候，我们可以把它想象的很简单，但实践起来却处处是问题。
从这次实验中，我深切的体会到，查资料的重要性。
在实验前，要根据实际，通过查资料，确定最合理的实验方案。
此外，更加明白了动手才是硬道理，做实验要有自己的主见，要善于发现问题，发现问题后要学会分析问题，解决问题。
这次实验能顺利完成，要感谢肖连冬和程爽老师的关心指导，同时也要谢谢同组同学的相互讨论与帮助。
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