酒曲中产酒酵母菌的筛选及发酵能力的测定Word格式.docx

1、3实验材料：酒曲 4种子培养基豆芽汁培养基：黄豆芽 100g； 葡萄糖 50g；琼脂 20g； 水 1000ml；PH 自然。5发酵培养基A 酵母抽提物0.75 g，B 蛋白胨0.75 g，C 硫酸铵0.25 g，D 磷酸二氢钾0.125 g，E 硫酸镁0.09 g， F 氯化钙0.07 g，G 葡萄糖25 g， H 蒸馏水250mL。四、方法步骤1、产酒酵母菌株的初选（1）实验器材的准备与灭菌1）清洗培养皿、锥形瓶数个，在干燥箱中干燥2）检查并接通高压蒸汽灭菌锅，打开电源，在锅内加水，直至水位显示为高水位，设定温度为121，加热时间30min。3）取出培养皿、锥形瓶，放置降温、用牛皮纸包裹放

2、置在内锅层，加盖，并将盖上的螺栓以两两对称的方式同时旋转拧紧，防止漏气。4）通电，在0.1Mpa，121，30min灭菌。5）灭菌时间到后，切断电源，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力降至0时，打开排气阀，旋松螺旋，打开盖子，取出灭菌物品。（2）培养基、无菌水的制备与灭菌1）培养基的配方如下：培养基成分 黄豆芽 100g 葡萄糖 50g 琼脂 20g 水 1000ml PH 自然2）配制方法 称新鲜黄豆芽100g，置于烧杯中，再加入1000ml水，小火煮沸30min，用纱布过滤，补足失水，即制成10豆芽汁。配制时，按每1000ml10豆芽汁加入50g葡萄糖，煮沸后加入20g琼脂，继续加热融

3、化，补足失水。分装、加塞、包扎，制备斜面试管。与包扎好的的无菌水一起高压蒸汽灭菌0.1MPa灭菌30min。（3）倒平板：将灭菌好的培养基在无菌条件下倒入平板培养基，作为酵母菌的固体培养基备用。（4）样品菌悬液制备1、取样：用分析天平准确称取1g酒曲2、制备悬液：取1g样品并用9ml无菌水溶解，振荡约20min，使样品与水充分混匀，将细胞分散。用一支无菌吸管从中吸取1ml酒曲悬液加入装有9ml无菌水的试管中，吹吸3次，让菌液混合均匀，即成10-2稀释液；再换一支无菌吸管吸取10-2稀释液1 ml，移入装有9ml无菌水的试管中，也吹吸三次，即成l0-3稀释液；以此类推，连续稀释，制成10-1、1

4、0-2、10-3、10-4、10-5等一系列稀释菌液。具体步骤可以参照下图土壤菌悬液稀释：（5）平板涂布：用1mL移液管分别从各菌悬液试管中取菌悬液1mL于平板培养基上，用涂棒涂布均匀，每个稀释梯度做三个平板；（6）培养：恒温培养箱28培养1-2天；（7）观察细菌生长情况、结构状态和部落分布情况并记录，由于本次试验采用涂布平板法，无法准确知道酵母菌的含量。（8）酵母形态的观察从长出菌落的平板培养基上挑出酵母菌，用美蓝染色法取对数生长期的菌体进行制片，在放大10倍及40倍的显微镜下观察酵母形态，用测微尺测量酵母细胞的大小，并进行死活鉴别。酵母菌是单细胞的真核生物，细胞核和细胞质有明显分化，个体比

5、细菌大得多。酵母菌的形态通常有球形、卵圆状、椭圆状、柱状或香肠状等多种形状。酵母菌是通过芽殖进行繁殖，因此有时可以观察到带有芽的菌株。酵母菌的菌落一般为乳白色的，湿润的圆滑菌落。（9）酵母菌的分离纯化采用划线法将确定为酵母菌的菌落挑出，并在无菌条件下用接种环连续划线到平板培养基上，然后恒温培养箱28培养1-2天。（10）斜面接种，将划线培养基取出，从中挑取单菌落在无菌条件下接种到斜面培养基上，然后恒温培养箱28培养1-2天。2、酵母菌的扩培（1）制备种子液培养基 葡萄糖 50g； 水1000ml； PH自然。配制时，按每1000ml10豆芽汁加入50g葡萄糖，继续加热融化，补足失水。分装、加塞

6、、包扎，分别装到三个三角瓶中，每个装100ml 高压蒸汽灭菌0.1MPa灭菌30min。（2）种子培养基接种将灭菌好的种子培养基取出，待温度降至室温，分别从三根斜面培养基中接种环12环酵母菌到种子培养基中（注：无菌条件下），恒温培养箱30培养1天，即可使用。3、酵母菌的发酵试验（1）制备发酵培养基发酵培养基： 酵母抽提物0.75 g，B 蛋白胨0.75 g，C 硫酸铵0.25 g，D 磷酸二氢钾0.125 g，E 硫酸镁0.09 g， F 氯化钙0.07 g，G 葡萄糖25 g， 蒸馏水250mL。PH自然。配制1000mL发酵培养基配置好后，冷却后分装到9个250ml锥形瓶中（每瓶装100m

7、l）。在121条件下高压灭菌30分钟。（2）种子液扩大培养将灭菌好，冷却的培养液取出，从种子培养基中取10ml种子液转移到发酵培养液中（无菌条件），每个种子液做三个发酵培养。贴上标签，放入恒温培养箱30培养12天.（3）酒精蒸馏与含量的测定:4、比重计测定法测定产酒精能力：（1）.材料：酒精比重计。100ml量筒。温度计。（2）操作：蒸馏：装好全套蒸馏装置，用容量瓶量取100ml发酵液，放入250ml的蒸馏瓶中，加50ml水。迅速安装到冷凝管上进行蒸馏，并将此容量瓶用水洗净后，置冷凝管下端收集馏出液100ml，停止蒸馏，摇匀备用。测定：将酒精比重计慢慢放入酒精发酵液的蒸馏液中，手持温度计插在比

8、重计杆旁，待温度稳定后，酒精停稳时读数，读数应以弯月面下缘为准，观察视线要与弯月面下缘相平。校正：根据所量的酒精度和温度、查表校正为28时酒精度。0.6479发酵糖转化为酒精的转化系数五、实验结果与分析1.实验测得的数据：种子液A种子液B种子液C发酵液一23发酵液二发酵液三发酵液温度28272.换算成酒精浓度的数据：2.94.03.计算过的发酵率的数据：种子液A（%）种子液B（%）种子液C（%）44.7561.74不同酿酒酵母菌株的代谢过程有差异, 对可发酵性糖的利用程度不同，可能会导致最终的酒精生成率有较大差别。各酿酒酵母菌株的发酵及产酒情况见上表。由表可知,发酵48小时后，用蒸馏的方法测得

9、的酒精含量整体偏低，可能是由于实验过程中污染杂菌，或者是操作不当使大量酿酒酵母菌体死亡，故在发酵时期所获得的酒精含量不高。本试验通过从酒曲提取酿酒酵母，并分别对多株酿酒酵母的产酒精能力进行测定和比较, 初步筛选出生长较好的3株酵母菌。通过酒精发酵试验表明, 2号、3号菌株的产酒精能力良好,但由于实验操作过程中的失误或酵母菌本身的原因，导致菌种的产酒精能力普遍偏低，也说明了其诱变后提高的空间很大。分析以上结果可知, 酿酒酵母的2号菌的产酒精能力强，这为酵母菌的进一步诱变处理，得到更高的产酒精能力提供了理论依据。可以对2号菌株进行诱变处理，进一步提高酵母的产酒精的能力。六、实验感想此次实验从最开始的查资料，确定方案，再到配制培养基，菌种的分离、纯化、培养、鉴定，以及后来的酒精蒸馏提取，测产酒精能力等过程中或多或少的遇到了一些问题，平常理论的时候，我们可以把它想象的很简单，但实践起来却处处是问题。从这次实验中，我深切的体会到，查资料的重要性。在实验前，要根据实际，通过查资料，确定最合理的实验方案。此外，更加明白了动手才是硬道理，做实验要有自己的主见，要善于发现问题，发现问题后要学会分析问题，解决问题。这次实验能顺利完成，要感谢肖连冬和程爽老师的关心指导，同时也要谢谢同组同学的相互讨论与帮助。