脂肪酶的概述与应用Word文件下载.docx

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酯酶（EC3.1.1.1）作用的底物是水溶性的，并且其最适底物是由短链脂肪酸（≤C8）形成的酯。

脂肪酶是重要的工业酶制剂品种之一，可以催化解脂、酯交换、酯合成等反应，广泛应用于油脂加工、食品、医药、日化等工业。

不同来源的脂肪酶具有不同的催化特点和催化活力。

其中用于有机相合成的具有转酯化或酯化功能的脂肪酶的规模化生产对于酶催化合成精细化学品和手性化合物有重要意义。

脂肪酶是一种特殊的酯键水解酶，它可作用于甘油三酯的酯键，使甘油三酯降解为甘油二酯、单甘油酯、甘油和脂肪酸。

酶是一种活性蛋白质。

因此，一切对蛋白质活性有影响的因素都影响酶的活性。

酶与底物作用的活性，受温度、pH值、酶液浓度、底物浓度、酶的激活剂或抑制剂等许多因素的影响。

脂肪酶在微生物中有广泛的分布，其产生菌主要是霉菌和细菌。

已经公布的适用于甘油三酯加工的不同来源的脂肪酶有33种，其中18种来自霉菌，7种来自细菌。

脂肪酶可将甘油酯（油、脂）水解，在不同阶段可释放出脂肪酸、甘油二酯、甘油单酯及甘油。

水解生成的脂肪酸，可以用标准的碱溶液滴定，以滴定值表示酶活力。

二脂肪酶的结构解析

1、分子结构

研究表明,来源不同的脂肪酶,其氨基酸组成数目从270～641不等,其分子量为29000～100000。

迄今为止,人们已经对多种脂肪酶进行克隆和表达,

并利用X-衍射等手段和定向修饰等技术测定了酶的氨基酸组成、晶体结构、等电点等参数,确定了组成脂肪酶活性中心的三元组（triad）结构。

表1列出了几种常见的脂肪酶的结构特征参数。

正如下表所示,多数酶都有变种（如CCL（A）和CCL（B）、GCLⅠ和GCLⅡ等）,不过这些不同变种的酶具有绝大多数相同的氨基酸序列,其氨基酸组成数目完全相同,不同的只是个别氨基酸的差异。

一般而言,不仅构成活性中心的三元组氨基酸种类相同,而且位置不变;

其分子量和等电点略有不同。

2、脂肪酶催化中心三元组

研究表明，尽管不同来源的脂肪酶有不同的氨基酸组成（残基数目、分子量、三维空间结构等）,但由于生物的同源性和进化过程的保守性,其催化中心拥有相似或相同的特征区His-X-Y-Gly-Z-Ser-W-Gly或Y-Gly-His-Ser-W-Gly（W、X、Y、Z指非特异性氨基酸）。

如图1所示，绝大多数脂肪酶的活性中心都由Ser和His参与组成,His、Ser与另一种氨基酸残基（如CCL和GCL的Glu、RML和hPL的Asp等）一起构成脂肪酶催化活性中心的三元组（triad）。

如图2所示

3、立体结构

具体参数方法：

三．脂肪酶的纯化与表达

●pPIC9k-mRCL表达质粒的构建

1.以华根霉基因组DNA为模板使用PCR方法扩增RCL（华根霉脂肪酶全基因）成熟肽，扩增的基因片段纯化后克隆到载体pMD19-TVector中，转化E.coli.DH5α及进行重组质粒的筛选，由此构建重组质粒pMD19-mRCL。

2.由质粒pMD19-mRCL切下目的基因片段，连入表达载体pPIC9k构建表达质粒pPIC9k-mRCL。

（1）质粒双酶切

克隆的质粒pMD19-mRCL和酵母表达质粒pPIC9k分别被AvrⅡ和NotI双酶切，得到pMD19-mRCL质粒双酶切的800bb左右的小片段以及pPIC9k质粒的双酶切线性质粒大片段，回收目的条带。

（2）连接

载体DNA与目的DNA片段混合连接。

（3）转化E.coli.DH5α及重组质粒的筛选

重组质粒pPIC9K-mRCL的构建

●重组蛋白在巴斯德毕赤酵母GS115中的初步表达

1.巴斯德毕赤酵母感受态细胞的制备

2.巴斯德毕赤酵母的电转化

对质粒线性化，回收酶切产物；

再与巴斯德毕赤酵母感受态细胞混匀，电转化得到含目的基因的重组巴斯德毕赤酵母

3.重组巴斯德毕赤酵母的鉴定

可用浓度梯度进行抗性筛选

4.巴斯德毕赤酵母表达脂肪酶

甲醇诱导重组蛋白的表达

巴斯德毕赤酵母表达系统的优点（选择的原因）：

1.毕赤酵母是需氧酵母菌，在有氧条件下能高密度生长，因此有利于扩大生产获得高浓度细胞，从而进行高效表达

2、通过质粒整合到毕赤酵母基因组的外源基因结构稳定，不易丢失；

且外源基因能以高拷贝数整合到毕赤酵母基因组中，能够筛选到高表达菌株

3、毕赤酵母甲醇氧化酶（alcoholoxidase，AOX）基因的强启动子特别适用于外源基因的调控表达

4、毕赤酵母自身分泌到培养基中蛋白很少，使得分泌性的外源蛋白容易从培养基的基质中分离

5、毕赤酵母对外源蛋白产物进行N一乙酰糖基化修饰的结构为高甘露糖型，糖链平均为8～14个甘露糖基，更接近于高等生物，且聚糖末端不含1，3连接的甘露糖残基（有强的免疫原性），因而适用于临床应用

6、使用方便、简单，而且成本较低

4.表达后的纯化步骤：

●对象:

重组巴斯德毕赤酵母

●过程：

1.摇瓶甲醇诱导培养

2.脂肪酶的分离纯化

（1）10KD超滤膜浓缩

将mRCL发酵液离心后弃掉沉淀，上清液用微孔滤膜过滤，微滤后的溶液用10KD超滤膜浓缩。

浓缩酶液用缓冲液透析过夜。

（2）强阳离子交换柱层析

将透析液上样到已用上述缓冲液预平衡的强阳离子交换柱层析（Ф1.6cm×

20cm），用相同缓冲洗脱未吸附蛋白。

后用NaCl浓度梯度缓冲液阶段洗脱吸附蛋白，一定的洗脱速率和时间分部收集，集中脂肪酶活性组分，用缓冲液透析。

3）疏水色谱柱层析

将透析后的酶液继续用疏水柱层析（Ф1.6cm×

20cm）层析，用相同缓冲液洗脱除去未吸附蛋白。

然后用硫酸铵浓度梯度差缓冲液阶段洗脱吸附蛋白，最后用H2O洗脱，一定的洗脱速率和时间分部收集，集中脂肪酶活性组分，透析除盐。

4）得到脂肪酶活性组分mRCL

四．脂肪酶的化学修饰

设计思路

脂肪酶作为一种水解酶，不仅催化水解反应而且催化有机相中酯合成和酯交换反应。

有机相酶催化技术自20世纪80年代开创以来，已获得了巨大的发展，广泛应用于食品、医药、化妆品等行业。

近几年来人们为了提高酶在有机相中的溶解性及稳定性，在酶的化学手段修饰和生物学手段修饰方面开展了许多工作[1－6]。

而化学修饰是提高和改变酶催化性能的有效方法。

Basri等[7]用氨基酯的盐酸盐对脂肪酶进行化学修饰，发现修饰酶在有机溶剂中的溶解度、热稳定性和催化酯化反应活性都有很大提高。

TatsuoMaruyama等[8]用硬脂酸修饰了脂肪酶，发现虽然水解活性下降，但酯化活性明显提高。

从文献来看，就化学修饰改善酶催化功能方面而言，以前主要研究了修饰酶在有机相（均相）中的稳定性、催化活性等问题，而涉及非均相界面催化的研究甚少。

表面活性剂是一类兼具亲油基和亲水基的两亲物质，它能富集于界面从而显著地改变界面性质。

修饰原理

当水溶性的酶分子中引入长链烷基后，便具有了类似于表面活性剂的两亲结构。

因此与未经修饰的酶相比，修饰后的酶疏水性增强，界面活性提高，从而有利于在有机相或界面催化化学反应，这对于酶的实际应用具有重要意义。

本文从界面化学的角度对用N-羟基琥珀酰亚胺活化的硬脂酸修饰的Lipolase脂肪酶的界面化学性质进行了研究，重点考察了修饰酶降低表/界面张力的能力及界面催化活性。

1实验材料与方法

1.1化学试剂及仪器

化学试剂：

Lipolase100L，诺维信（中国）生物技术有限公司生产；

N-羟基琥珀酰亚胺，为生化试剂；

硬脂酸及其他试剂，为国产分析纯试剂，购自中国医药（集团）上海化学试剂公司。

仪器：

冷冻干燥仪（79340018917z-01，USA），紫外可见分光光度计（UVIKON，Germany），元素分析仪（VarioEL，Germany），表面张力仪（DCA315，USA），界面张力仪（DVT30，Germany）及LB成膜装置LB5000（KSV5000，Finland）。

1.2硬脂酸琥珀酰亚胺酯的制备

活化后的硬脂酸易于与酶表面的氨基反应，因此先将硬脂酸活化。

将硬脂酸溶入适量N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中，并加入一定比例的N-羟基琥珀酰亚胺和二环己基碳酰亚胺。

三者摩尔比为1∶2.25∶2.25[9－10]。

磁力搅拌反应8h，反应温度为30℃。

反应结束后过滤，滤液用乙醚萃取。

蒸去乙醚得到白色固体，然后用无水乙醇反复洗涤后经真空干燥即得。

1.3Lipolase脂肪酶的化学修饰

在磁力搅拌下，将Lipolase100L用透析袋于去离子水中透析2天，冷冻干燥得到白色固体酶晶体。

固体酶置于5℃冰箱中储存备用。

300mg固体酶溶于20mL磷酸二氢钾–硼砂缓冲液（pH=7.4），将200mg硬脂酸琥珀酰亚胺酯溶于5mLDMF后逐滴加入酶溶液。

10℃下反应10h。

反应完毕后，混合物在4000r/min下离心15min除去未反应的酯，重复操作两次。

上清液用透析袋于去离子水中透析一周后冷冻干燥，干燥后的产物即为修饰酶。

1.4：

修饰度的测定

由于在Lipolase表面引入烷基，所以修饰酶中酶含量降低，而酶中含氮量固定，故修饰后总含氮量降低。

测定酶修饰前后的含氮量，其差值相对含量定义为修饰度。

酶的平均含氮量由元素分析仪测定。

实验测得未修饰酶的平均含氮量为14.2%。

1.5Lipolase脂肪酶酶活测定

水解活力采用橄榄油乳化液法测定[11－12]；

酯化活力按M.Basri等的方法进行[13]。

界面水解活力的测定按如下方法进行：

在50mL锥形瓶中加入10mL一定浓度的酶溶液（浓度：

0.1～1g/L），37℃预热5min，再加入2mL橄榄

油，低速磁力搅拌，橄榄油在Lipolase的催化下在界面水解。

生成的脂肪酸的量采用酸碱滴定法测定。

1.6Lipolase脂肪酶水溶液的表/界面张力测定

Lipolase脂肪酶水溶液的表面张力采用吊片法测定[14]。

正己烷-酶水溶液体系的界面张力采用滴体积法测定[15]。

1.7Lipolase脂肪酶LB膜的制备

选择水–异丙醇-氯仿为铺展剂[16－18]，三者体积比为5∶6∶1。

亚相为用超纯水配制的5%KCl盐溶液。

用微量注射器将酶溶液铺展于亚相表面，待溶剂挥发30min后用LB成膜装置压膜，压膜速率为3cm/min，同时得到∏-A曲线。

2结果与讨论

2.1Lipolase脂肪酶的水解活性

图1为温度对Lipolase催化橄榄油水解酶活的影响。

由图1知，Lipolase最适水解温度约为37℃，

虽然修饰后水解酶活有所降低，但并不改变

Lipolase的最佳水解温度，这与文献报道一致[8]。

相同温度下的酶活随修饰度的增加而下降。

修饰酶中酶的质量分数下降、修饰过程中酶的活力损失等均可能是水解酶活降低的原因之一；

由于硬脂酸的引

入使得Lipolase酶活部位的空间结构发生变化也可能导致Lipolase失活。

五．脂肪酶的应用

1、酶在食品工业

酶在食品工业中具有广泛而重要的作用,近年来人们对脂肪酶的研究取得了很大的进展,已引起了全世界的广泛关注。

目前,脂肪酶在非水体系中反应的研究在国外已取得突破性进展,脂肪酶的应用已深入到食品工业中的多个领域,国内脂肪酶在非水介质中的酶促反应亦成为近几年的研究热点,并取得一些可喜的成果。

当前,由于固定化酶的方法过于复杂,效率低、成本高,或使用了有毒的化学试剂而不符合食品加工所必须满足的经济和安全的标准,所有这些都限制了固定化脂肪酶技术在食品工业中的应用,但随着生物技术以及材料、化工等各相关学科的发展,相信固定化脂肪酶的工作会有新的突破。

在食品中也将得到更广泛的运用,对促进食品工业快速发展具有重要意义

脂肪酶在焙烤食品中的应用

随着焙烤食品工业的快速发展,消费者的食品安全和健康意识日益增强,对面粉及其制品提出了愈来愈高的要求。

要想生产出好的面粉,就需要优质的原料,而我国小麦由于品质参差不齐,要想达到焙烤食品工业的要求,就要在面粉后处理中添加食品添加剂,来弥补面粉品质的不足。

过去面包粉改良主要是化学改良剂,如溴酸钾,虽然它对面团及面包有较好的作用,但长期使用对人体有害,2005年7月1日被我国禁止使用。

随着溴酸钾被禁用,如何使用天然无害具有替代功能的产品,成为广大焙烤食品及面粉企业关注的焦点,而生物酶制剂满足了这方面的要求。

酶作为一种生物制品,在面粉改良中,具有显著的优越性:

酶本身就是活细胞产生的活性蛋白质,不会留下有毒的物质;

酶的催化作用具有高度的专一性,一种酶只对一种底物起作用,如淀粉酶只能催化淀粉的水解,而对蛋白质则无效。

酶的催化效率非常高,比一般催化剂高107~1013倍,因此用量相当少;

酶的操作条件温和,在常温、常压下就能进行。

脂肪酶是酶制剂的一种,酶的所有特性它都具有,与其它酶制剂如葡萄糖氧化酶复配后能够取代化学增筋剂溴酸钾。

它能够提高面制品的烘焙品质、改善面包质地、延长制品的货架期。

脂肪酶能催化甘油三酯水解生成甘油二酯,甘油一酯或甘油。

它对面团有强筋作用,能够提高面包的入炉急胀,增大面包体积,且对面包芯有二次增白作用。

它符合了焙烤食品工业绿色、安全、健康的发展要求,正愈来愈受到广大焙烤食品及面粉企业的欢迎,相信它在这些领域的应用具有更加广阔的前景。

脂肪酶在乳品工业中的应用

应用于乳酯水解,包括奶酪和奶粉风味的增强、奶酪的熟化、代用奶制品的生产、奶油及冰淇淋的酯解改性等。

脂肪酶作用于乳酯并产生脂肪酸,能赋予奶制品独特的风味。

脂肪酶释放的短碳链脂肪酸（C4-C6）使产品具有一种独特强烈的奶风味,而释放的中碳脂肪酸（C10-C14）使产品具有皂似的风味。

同时,由于脂肪酸参与到类似微生物反应的过程中,增加了一些新风味物质的形成,如甲基酮类、风味酯类和乳酯类等。

传统奶酪制品加工所用的脂肪酶大都来自动物组织,如猪、牛的胰腺和年幼反刍动物的消化道组织,不同来源的脂肪酶会产生不同风味特征。

脂肪酶还可使用在羊奶仿制牛奶的制品中。

对不同奶源的奶制品,脂肪酶的使用可大大改善其有的不良风味,促使新的风味的产生,并能改进乳制品的营养价值。

脂肪酶在生产酶改性奶酪制品中关键作用,酶改性奶酪中含有的游离脂肪酸比只经过普通处理的奶酪中要高10倍以上,这对于其作为风味增强剂是十分有利的。

2、在医药领域中

在医药领域中，脂肪酶是非常重要的药物作用靶点或标记物，同时也可以用来生产多不饱和脂肪酸等多种医药中间体;

3、洗涤剂

同时随着环境保护的意识越来越强，生产易于被生物降解的无污染洗涤剂已经是现代洗涤剂发展的方向，而将脂肪酶加入洗涤剂中可大大提高其去污效果，并且脂肪酶是生物产品，易被降解，不污染环境;

在皮革加工过程中需要把皮毛上脂肪去除。

以前主要是用石灰掩埋去除，但效果不明显，现在利用脂肪酶的特性将依附脂肪分解成易于祛除的脂肪酸和甘油。

用酶对各种动物皮毛进行处理，其脱脂效果明显，可提高皮革质量;

另外，脂肪酶还被用于造纸工业，主要是利用脂肪酶除去造纸出现的洽脂。

生物柴油是生物质能的一种形式，生物酶法生产生物柴油是通过脂肪酶进行酯化反应，制备相应的脂肪酸酯。

酶催化法对原料没有特殊要求，可以废油脂、高酸油脂等为原料进行生产，且产物提取简单、反应条件温和、醇用量小、甘油易回收和无废物产生，在此过程还能合成一些高价值的产品，增加经济效益。