生物工程复习题文档格式.docx
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三、填空题：
1、植物细胞大规模培养方式主要有：
分批培养法，连续培养法，半连续培养法和固定化培养法
2、诱导植物细胞融合的因素主要有：
PEG诱导；
NaNO3诱导；
高钙和高PH诱导；
高钙和高PH及PEG结合诱导
3、一般认为形成的器官的类型受培养基中两类激素的相对浓度的控制，较高浓度的生长素有利于根的形成而抑制芽的形成，相反，较高浓度的细胞分裂素则促进芽的形成而抑制根的形成。
4、植物原生质体发育及植株再生途径主要有：
细胞壁再生；
细胞分裂和生长；
愈伤组织形成与分化；
植株再生
5、制备植物原生质体过程中，酶解去细胞壁时，为保证原生质体的稳定性，常加入渗透稳定剂（①糖溶液系统：
包括甘露醇、山梨醇、蔗糖和葡萄糖等；
②盐溶液系统：
包括KCl、MgS04和KH2PO4等）;
细胞质膜稳定剂（葡萄糖硫酸钾、MES、CaCl•2H2O、KH2PO4等）.
6、植物原生质体制备需要的酶：
纤维素酶和果胶酶
7、常用的生长素有_吲哚乙酸___、_萘乙酸___、_2,4-D__、_吲哚丁酸__等，常用的细胞分裂素__激动素__、__6-苄基氨基嘌呤__、_玉米素_
8、由愈伤组织再生植株有两条途径：
一步成苗（原生质体形成的愈伤组织直接转移到分化培养基上可一步成苗）和两步法成苗（即首先将愈伤组织培养于含低浓度生长素培养基上，让其增殖和调整状态，再其转移到分化培养基上分化成苗）
四、问答题
1、植物细胞实验室培养方法有哪几种？
①液体浅层培养法：
将悬浮在培养液中的细胞过滤得到游离单细胞和小细胞团，培养在浅层液体培养基中。
用途：
主要用来增殖细胞。
特点：
有利于有毒物质的扩散；
有利于气体交换；
不利于定点观察；
单细胞生长、分裂后，难以得到单细胞系；
②固体平板培养法：
将制备好的单细胞悬浮液，按照一定的细胞密度，与融化的琼脂培养基均匀混合，并平铺一薄层在培养皿底上的培养方法。
是为了分离单细胞无性系，研究其生理、生化的遗传上的差异而设计的一种单细胞培养技术。
广泛应用于细胞、原生质体及融合产物的培养。
可以定点观察；
分离单细胞系比液体浅层培养容易；
培养细胞气体交换不畅；
③看护培养：
指用一块活跃生长的愈伤组织来看护单个细胞，并使其生长和增殖的方法。
诱导形成单细胞系。
效果好，易于成功；
简便易行；
不能在显微镜下直接观察细胞的生长过程；
④微室培养：
主要用来观察细胞生长、分裂、形成细胞团的过程。
能在显微镜下追踪单细胞分裂增殖形成细胞团的全过程；
培养基少，营养和水分难以保持，pH值变动幅度大，培养细胞仅能短期分裂。
⑤其它单细胞培养技术：
饲养层培养基技术：
将饲养细胞先用射线辐射处理，然后将饲养细胞和培养细胞混合植板，经过照射的细胞对于培养细胞起到一个饲养作用；
双层滤纸植板培养方法。
2、植物细胞培养的植株再生步骤有哪些？
A.器官发生：
（由茎尖、腋芽、原球茎、块茎、鳞茎等器官发生）
B.胚状体方式（somaticembryo）：
由外植体经胚状体形成完整植株可分三个不同发育阶段：
1）外植体细胞脱分化：
外植体发生细胞分裂，或进而形成愈伤组织。
这一阶段同不定芽方式一样。
2）胚状体形成：
在植物有性生殖中，精于和卵子结合形成合子，合子进一步发育成胚。
但在组织培养条件下胚状体的发育过程是：
细胞经脱分化后，发生持续细胞分裂增殖，并依次经过原胚期、球形胚期、心形胚期、鱼雷形胚期和子叶期，进而成为成熟的有机体。
我们把由愈伤组织的类似薄壁组织细胞不经有性过程而直接产生类似胚的这一结构，称为胚状体。
3）胚状体再发育成完整植株：
在外观上，这种方式和不定芽均有光滑、圆形突起的形状。
3、植物细胞融合过程如何？
融合特点是什么？
融合过程：
①凝聚作用阶段，其间两个或两个以上的原生质体的质膜彼此靠近；
②在很小的局部区域质膜紧密粘连，彼此融合，在两个原生质体之间细胞质呈现连续状态，或是出现桥；
③由于细胞质桥的扩展，融合完成，形成球形的异核体或同核体。
无物种限制；
杂种含双亲性质
4、PEG融合与电融合的基本原理是什么？
各有何特点？
①PEG融合:
原理：
PEG是一种带负电性的高分子化合物，在原生质体融合中起到一种桥梁作用，可以使原生质体凝聚。
在洗脱过程中，PEG将被洗掉，导致质膜表面电荷重排。
粘连的质膜大面积紧密相连，电荷的重排队导致一个原生质体的负性电荷部位与另一原生质体的正性电荷部位相连而导致融合。
优点：
是融合成本低，勿需特殊设备；
融合子产生的异核率较高；
融合过程不受物种限制。
缺点：
是融合过程繁琐，PEG可能对细胞有毒害。
②电融合：
交流电场使原生质体表面电荷偶极化，沿着电极排列，形成串珠；
施加直流电场后，形成串珠的原生质体在质膜接触处发生穿孔，开始遗传物质的交流
①是不存在对细胞的毒害问题；
②是融合效率高；
③是融合技术操作简便。
基因工程
一．专业符号
Tetr四环素抗性R/M体系限制与修饰现象
Ampr氨苄青霉素抗性pBR322质粒载体
M13单链DNA噬菌体载体cosmid科斯质粒
IPTG异丙基-β-D硫代半乳糖苷DNAligaseDNA连接酶
EcoRI限制性酶切位点host宿主
Plasmid质粒Ori复制起始位点
vector载体cDNA反转录互补DNA
southernblotDNA印迹转移技术MCS多克隆位点
二．名词解释
1.生物工程bioengineering：
利用生物有机体（包括微生物和动、植物）或其组成部分（包括器官、组织、细胞、细胞器）和组织成分（包括DNA、RNA、蛋白质、酶、多糖、抗体等），形成新的技术手段来发展新产品和新工艺的一种技术体系。
2.基因工程
：
是指按照人们的意愿，在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其他载体分子，构成遗传物质的新组合，并使之转入到原先没有这类分子的宿主细胞内，形成能持续稳定繁殖的新物种。
其目的是为人类提供有用产品及服务。
3.同聚物加尾法：
利用末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）转移核苷酸的特殊功能，将同种核苷酸（dNTP）加到DNA分子单链延伸末端的3′-OH上。
如果在目的基因两侧加polydA，则在载体两侧加polydT。
长度一般10-40个残基。
4.DNA接头：
是一类人工合成的一头具有某种限制酶粘性末端，另一头为平末端的特殊的双链寡核苷酸短片段。
5.R/M体系：
大多数的细菌对于噬菌体的感染都存在一些功能性障碍，即所谓的寄主控制的限制（restriction）和修饰（modification）现象，简称R/M体系。
（作用：
一是保护自身的DNA不受限制，二是破坏外源DNA使之迅速降解。
）
6.同尾酶：
与同裂酶对应的一类限制酶，它们虽来源各异，识别的靶子序列也各不相同，但都产生出相同的粘性末端，称为同尾酶。
7.启动子：
是基因的一个组成部分，控制基因表达（转录）的起始时间和表达程度，是位于结构基因5′端上游的一段DNA序列，能够指导全酶同模板正确结合，活化RNA聚合酶，启动基因转录。
8.多克隆位点：
指多个限制性内切酶的单一切点。
由许多限制酶切点组成，往往是人工合成的一段外源基因的插入部位的DNA序列。
9.同裂酶：
识别顺序与切割方式均相同者，为之同裂酶。
10.衔接物连接法（linker）：
将衔接物的5′末端和待克隆的DNA片段的5′末端用多核苷酸激酶处理使之磷酸化，然后通过T4DNA连接酶的作用是两者连接起来，接着用适当的限制酶消化具衔接物的DNA分子和载体分子，由此使两者都产生出彼此互补的粘性末端。
11．插入灭活效应：
外源性DNA克隆到插入型的λ载体分子上会使噬菌体的某些生物功能丧失，即所谓插入灭活效应。
12.蛋白质工程:
是指通过蛋白质化学、晶体学和动力学的研究，获取关于蛋白质物理、化学等各方面的信息，在此基础上，对编码该蛋白质的基因进行有目的的改造，并通过基因工程等手段将其进行表达和分离纯化，最终得到比天然蛋白质更好的产物。
13.免疫分析法:
利用抗原-抗体反应来检测含目的基因的重组转化体或嗜斑的技术称为免疫分析法。
条件：
只要目的基因在宿主中表达相应蛋白质，并能获得相应抗体，即可用本技术检测相应DNA。
14.感受态细胞:
能从其周围摄入DNA的细胞称为感受态细胞。
基因工程中，宿主细胞需经人工处理成能吸收重组DNA分子的敏感状态，才能用于转化，这种敏感细胞称为人工感受态细胞。
15.原位杂交技术:
根据核酸杂交原理，利用基因探针检出培养板上重组转化体菌落位置的技术称之为原位杂交技术。
16.标记营救：
SV40DNA为载体的取代克隆方式分为早期基因区域取代及晚期基因区域取代两种类型。
晚期基因区域取代方式是以外源DNA片段取代晚期基因区域，构成的重组DNA在宿主中可以复制，但不能产生重组病毒颗粒，因而采用早期基因缺失的SV40病毒突变种作为辅助病毒与晚期取代重组DNA或和感染宿主，则晚期区域取代重组DNA可获得标记营救，辅助病毒产生的晚期基因产物与重组病毒的早期基因产物一起可形成完整病毒颗粒。
17.衔接物：
是指用化学方法合成的一段由10-12个核苷酸组成，具有一个或数个限制酶识别位点的平末端的双链寡核苷酸段片断。
18.基因文库：
所谓基因组文库是将基因组DNA通过限制性内切酶部分酶解后所产生的基因组DNA片段随机地同相应的载体重组、克隆，所产生的克隆群体代表了基因组DNA的所有序列。
19.转化
Transformation:
自然的转化是指将携带某种遗传信息的DNA分子引入宿主细胞，通过同源重组作用。
获得具有新遗传性状的生物细胞的过程。
基因工程操作中的转化是泛指将重组DNA转入宿主中的方法。
20.回文结构：
位点上核苷酸顺序通常呈双重旋转对称结构，即呈回文结构。
21.安慰诱导物:
在M13体系中，已将Lac阻遏基因的Iq突变引入宿祖细胞。
该Iq突变基因可产生出10余倍超量的阻遏物。
这些阻遏物的存在可以抑制Lac操纵子的表达。
IPTG是一种乳糖类似物，再无乳糖的条件下，他可以诱导细胞合成半乳糖苷酶。
因此，IPTG被称为β半乳糖苷酶的安慰诱导物。
22.DNA接头法（adaptor）：
当它的平末端与平末端的外源DNA片段连接后，便会使后者成为具有粘性末端的新的DNA分子，而易于连接重组。
23.DNA-蛋白质筛选法:
DNA-蛋白质筛选法是用来专门检测同DNA特异结合的蛋白质因子的中的外源DNA编码一种能专门同某一特定DNA序列结合的DNA结合蛋白质.
三、填空题
1.基因工程载体的必备条件:
A.具有有效运载能力;
B.携带外源性目的基因前后在宿主内功能自主复制;
C.在宿主内能控制外源基因表达活动;
D.鉴定方便，装卸手续简单;
E.能携带大小不同的外源性目的基因、载体分子量要小,载力要大;
F.容易控制、安全可靠、稳定性好.
2.常用的将重组DNA转入宿主细胞的方法
①CaCl2处理后的细菌转化与转染；
②高压电穿孔法；
③聚乙二醇介导的原生质体转化；
④磷酸钙或DEAE-葡聚糖介导的转染；
⑤原生质体融合；
⑥脂质体法；
⑦细胞核的显微注射法；
⑧激光打孔技术。
3.基因工程
基本步骤
①获得目的基因；
②在体外，将带有目的基因的外源DNA片段连接到能自我复制并具有选择性标记的载体分子上，形成重组DNA分子；
③将重组DNA分子转移到适当的宿主细胞中，并与之一起增殖；
④从大量细胞繁殖群体中，筛选出获得重组DNA分子的宿主细胞克隆；
⑤从这些筛选出来的宿主细胞克隆中，提取出已经得到扩增的目的基因，供进一步分析研究用；
⑥将目的基因克隆到表达载体上，导入宿主细胞，使之在新的遗传背景下实现功能表达，产生出人类所需要的物质。
4.E.coli表达系统中常用的强启动子
LacTrpλPLλPR
5.目的
基因制备方法
①基因分离的物理方法；
②鸟枪法；
③cDNA文库的建立与基因分离；
④基因组文库法；
⑤基因的化学合成；
⑥聚合酶链式反应技术（PCR）。
6.外源基因在宿主细胞中高效表达的关键因素
①有效的转录起始；
②mRNA的稳定性；
③有效地翻译启始；
④遗传密码应用的偏倚性；
⑤mRNA的加工；
⑥mRNA序列上终止密码的选择；
⑦表达质粒拷贝数及稳定性；
⑧外源基因的稳定性。
7.PCR主要步骤：
高温变性；
低温退火；
适温延伸。
8.常用的克隆载体
ColE1质粒载体；
pSC101质粒载体；
pBR322质粒载体；
pUC质粒载体；
λ噬菌体DNA克隆载体；
科斯质粒载体；
单链DNA噬菌体M13载体。
9.DNA片段的连接方法
平头双链DNA分子的连接（T4DNA连接酶）；
粘性末端DNA片段的连接（DNA连接酶）；
平末端DNA片段的连接（同聚物加尾法，衔接物连接法，DNA接头连接法）。
10.真核病毒载体的优点:
①有很高的拷贝数；
②强大的启动子，可保证外源基因的高效表达；
③可保证糖基化。
11.原核表达系统中，主要表达方式
非融合蛋白的胞内表达；
融合蛋白的胞内表达；
分泌表达。
1.基因获得的方法有哪些？
各有哪些特点？
①基因分离的物理方法：
根据DNA分子的两条链存在着G≡C，A=T碱基配对。
如DNA分子中某段的G≡C碱基对含量高，则其热稳定性就高，其溶解温度（Tm）就高。
通过控制溶解温度使富A=T区解链变性，而富G≡C区仍维持双链。
当利用单链核酸酶S，酶去除解开的单链部分，得到富G≡C区的DNA片段。
②鸟枪法（Shotgun）又称霰弹法:
A.优点：
操作简单，命中率较高;
B.缺点：
盲目性大，阳性片段不一定正好是基因，样本多，可能会漏。
③cDNA文库的建立与基因的分离:
是以mRNA为模版，用反转录酶合成互补DNA的方法。
cDNA文库最关键的特征是它只包括在特定的组织或细胞类型中已经被转录成mRNA的那些基因序列。
④基因组文库法:
从基因组文库所分离获得的基因序列包含有内含子，因此不能直接在原核细胞中表达，但更适合作为如转基因动物等的真核表达系统。
⑤基因的化学合成:
优点:
A.可以合成细菌偏爱的密码子;
B.可以定向改变个别氨基酸;
C.可以在两端加上需要的限制酶切点;
D.可以通过自动化仪器合成.缺点：
必须对基因的结构序列清楚。
⑥聚合酶链反应技术（PCR）:
A.操作简单;
B.通用性好;
C.成功率高.
2.cDNA文库的建立有哪些步骤?
A.分离表达目的基因的组织或细胞;
B.从组织和细胞中制备总RNA和mRNA;
C.第一条cDNA链的合成;
D.第二条cDNA链的合成;
E.cDNA上接头的加入;
F.双链cDNA与载体的连接;
G.从众多的重组体中筛选出特定的基因.
3.限制酶命名原则是什么?
凡能识别并切割双螺旋DNA分子内特定核苷酸顺序的酶统称为限制酶。
命名原则：
属——种——株——分离序号
例如：
EcoRⅠ属：
Escherichia种：
coli株：
R分离序号：
Ⅰ
第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；
第二，第三个字母是该细菌的种名，用小写；
第四个字母代表株；
用罗马数字表示发现的先后次序。
**4.外源基因在宿主细胞高效表达的关键问题及其解决方案
A.有效的转录起始与基因的高效表达：
选择强的可调控的启动子;
B.mRNA的稳定性与基因高效表达：
①利用RNase缺失的受体菌;
②mRNA的5′端与3′端的正确加工，提高mRNA的稳定性;
C.有效地翻译启始与基因的高效表达:
①首选AUG为起始密码子；
②正确的SD序列；
③SD序列与起始密码子之间的距离以9±
3为宜；
④除SD序列外，处于起始密码5′端的核苷酸应为A和U；
⑤如果在起始密码AUG后的序列是GCAU或AAAA，能使翻译效率提高；
⑥在翻译起始区周围的序列应不形成明显的二级结构;
D.遗传密码应用的偏倚性与基因高效表达:
真核细胞与原核细胞对遗传密码的偏倚性不同，在不同表达系统中，使用偏倚性密码，尤其对于基因编码序列的5′端使用偏倚性密码，能有效提高表达效率;
E.mRNA的加工与基因高效表达:
绝大多数较高等的真核基因含有内含子，这些内含子在mRNA的加工过程中，在细胞核中被加工去除而产生成熟的mRNA。
但许多哺乳动物类细胞中外源基因的表达需要内含子存在，如果在转基因动物中表达外源基因时，最好用基因组基因而非cDNA;
F.mRNA序列上终止密码的选择:
①首选UAA;
②用一串连的终止密码，而不是只是一个终止密码，以保证翻译有效终止;
G.表达质粒拷贝数及稳定性与基因高效表达:
一般来讲：
①质粒拷贝数多，基因表达水平高；
②表达质粒拷贝数及稳定性与基因高效表达;
H.外源蛋白的稳定性与基因高效表达:
①通过组建融合基因，产生融合蛋白；
②产生可分泌的蛋白质；
③以包含体的形式表达；
④选择合适的宿主表达系统。
5.假如用大肠杆菌生产人的β-珠蛋白，必须经过几个基本步骤（参考填空题3题）
获得目的基因序列（过程，方法）——设计引物——（PCR扩增，文库法，cDNA）——选择载体——宿主——筛选——发酵培养——分离纯化。
6.平末端DNA片段的连接有哪些方法，各有什么特色？
A.同聚物加尾法:
优点：
是连接任何两段DNA分子的普遍性方法；
插入的片段难以回收。
无法控制外源基因插入方向；
B.衔接物连接法:
克隆后还可回收原插入片断；
如果待克隆的DNA片段或基因的内部也含有与所加的衔接物相同的限制位点，这样在酶切消化衔接物产生粘性末端的同时，也会把所克隆的基因切成不同的片段，从而对后继的亚克隆及其他操作造成麻烦。
C.DNA接头连接法：
一类人工合成的一头具有某种限制酶粘性末端，另一头为平末端的特殊的双链寡核苷酸短片段。
当它的平末端与平末端的外源DNA片段连接后，便会使后者成为具有粘性末端的新的DNA分子，而易于连接重组；
各个DNA接头分子的粘性末端之间，会通过互补碱基间的配对作用，形成如同DNA衔接物一样的二聚体分子，失去接头的本来意义。
（克服的方法是将5‘末端的磷酸修饰移去，其结果为暴露出的5’-OH所取代。
如此一来，虽然两个接头分子粘性末端之间仍具有互补碱基配对的能力，但终因DNA连接酶无法在5‘-OH和3’–OH之间形成磷酸二酯键而不会产生出稳定的二聚体分子。
）
7.蛋白质工程的主要步骤有哪些？
①分离纯化需改造的目的蛋白；
②了解其一级结构及高级结构，了解其结构-功能关系；
③获取编码该蛋白的基因序列；
④设计改造方案；
⑤对基因序列进行改造；
⑥将经过改造的基因序列重组入表达载体，进行表达；
⑦分离纯化表达产物，并对其功能进行检测。
补充：
1．限制酶：
2．基因工程新技术：
蛋白质工程，反义药物，RNAi技术，新生物技术疫苗。
3.核酸疫苗制备：
①目的抗原基因的选择和获得（构建cDNA文库，PCR扩增，人工合成）；
②选择合适的表达载体；
③对在表达载体上的基因序列进行测定。
4.基因文库的构建：
①随机酶切成较大的DNA片段（10~30Kb，平均20Kb），对这些片段进行分离；
②重组入适当载体（噬菌体）；
③转化进宿主菌（E.coli），扩增，构建成基因文库；
④从基因组文库中筛选出含有目的基因组的重组子。
5.PCR技术：
是指在四种脱氧核苷三磷酸（dNTP）存在下，以寡聚核苷酸为引物，以单链DNA为模板，经DNA聚合酶催化，合成DNA互补链达到基因扩增目的的过程。
PCR反应的必要条件：
须知基因两端的部分序列
PCR反应中的几个关键因素：
TaqDNA聚合酶；
引物的长度；
模板。
6.科斯质粒：
是人工构建的，含有λDNA的粘性（cos）末端序列、质粒复制起始区及质粒一个抗药性标记的、兼具质粒与λ噬菌体DNA载体双重性质的特殊载体。
酶工程
一、专业符号及名词解释
1.NADPH还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸
2.DEAE二乙氨乙基葡聚糖
3.DNP二硝基苯酚
4.errorpronePCR易错PCR
5.DNAshufflingDNA改组
6.IU酶活力国际单位
7.Katal酶活力单位
8.酶工程
指通过化学方法、酶学方法和DNA重组技术改善自然酶的组成、结构和性质，以提高酶的催化效率、降低成本并在大规模工业化生产中进行应用的技术
9.酶的活力单位
酶在最适条件下，单位时间内，酶催化底物的减少量或产物的生成量
（IU：
指在特定条件下，1min内生成1μmol产物的酶量）
10.酶的比活力
每毫克酶蛋白所含的酶活力单位数酶的比活力=酶活力单位数/毫克酶蛋白
11.固定化酶（Immobilizedenzyme）
通过物理和化学的方法将酶束缚在一定空间内且仍具有催化活性的酶制剂
12.固定化细胞（Immobilizedcell）
指被限制
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