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各组分对应的峰面积和理论踏板数均较高，同时更能保证检测结果的真实性、准确
性、重复性，阴性无干扰，专属性强，结果较满意。
1仪器与试药
气相色谱仪Agilent6890型（FID检测器）;
Agilent色谱工作站;
HP-5弹性石英毛细管柱
（柱长30m，内径0.25mm，膜厚度0.25聚乙二醇（PEG）-20M毛细管柱（柱长30m，内
径0.32mm，膜厚度0.5麝香祛痛搽剂样品:
武汉马应龙药业集团股份有限公司产品
（批号080402，080403，080413），襄樊隆中药业有限责任公司产品（批号080101，
080201，080401），绍兴华通制药有限公司产品（批号C03A0753，C03A0809），李时珍
医药集团有限公司产品（批号2009020001）。
麝香酮对照品，中国药品生物制品研究所
产品（批号110719-200512）;
无水乙醇为分析醇。
2方法与结果
2.1色谱条件色谱柱为HP-5弹性石英毛细管柱（柱长30m，内径0.25mm，膜厚度
2
0.25聚乙二醇（PEG）-20M毛细管柱（柱长30m，内径0.32mm，膜厚度0.5柱温：
程序
升温：
初温130℃，保持5min后，每分钟升高0.8℃至180℃，保持2min后，再以每
分钟升高20℃至220℃保持5min;
检测器为FID检测器;
检测器温度：
250℃;
进样口
温度220℃;
流速1.0ml/min;
理论板数按麝香酮计算应不低于20000。
2.2色谱条件的确定
2.2.1色谱柱的确定取供试品（绍兴华通制药有限公司，批号：
C03A0753）按供试品制
备方法制备得供试品溶液，用聚乙二醇（PEG）-20M毛细管柱（柱长30m，内径0.32
mm，膜厚度0.5m）进样。
结果表明，用聚乙二醇（PEG）-20M毛细管柱（柱长30m，内
径0.32mm，膜厚度0.5m）能收获较好的分离效果，得到准确高效的分析结果。
故选
用：
聚乙二醇（PEG）-20M毛细管柱（柱长30m，内径0.32mm，膜厚度0.5m）。
2.2.2程序升温条件的确定将2.3.1项下制得供试品溶液按程序升温：
初温130℃，
保持3min后，每分钟升高1.5℃至180℃，再以每分钟升高20℃至220℃保持5min;
流速1ml/min。
结果表明，在该方案下，供试品中各组分出峰时间较合适，分离效果
较好，而且各组分对应的峰面积和理论踏板数均较高。
通过试验，确定色谱条件为：
色谱柱：
聚乙二醇（PEG）-20M毛细管柱（柱长30m，内
径0.32mm，膜厚度0.5检测器为FID检测器;
进样器温度：
220℃;
分流进样（分流比1∶1）;
程序升温：
初温130℃，保持5min后，每分钟升高0.8℃至
3
180℃，保持2min后，再以每分钟升高20℃至220℃保持5min;
流速1ml/min;
进样
量：
1l。
2.3溶液的制备
2.3.1供试品溶液的制备针对麝香酮的脂溶性，采用石油醚（30～60℃）提取的方法，
这样组分的转移率较高，同时操作简便。
但是因为本品麝香酮的处方量过低;
必须进行
富集的过程。
因为样品为50%的乙醇制剂，与石油醚（30～60℃）会发生混溶，因此加入
4倍量的水，再置于分液漏斗中用石油醚（30～60℃）提取2次，100ml/次，石油醚
（30～60℃）液自然挥干，可使麝香酮成分不会损失。
取本品50ml，加水200ml，摇匀。
置于分液漏斗中，用石油醚（30～60℃）提取2
次，100ml/次。
合并石油醚，自然挥干。
残渣用无水乙醇2ml溶解，取上清液作为供
试品溶液。
tips:
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仅供参阅！
4
通脉醒脑滴丸对线栓法致脑缺血再灌注大鼠细胞凋亡线粒体的信号转导
作者：
陈小睿，唐光曦，孟宪丽，黄雷雷，李佳川
【摘要】目的探讨中药复方制剂通脉醒脑滴丸防治脑缺血卒中可能的机理。
方法
选用大鼠线栓阻断大脑中动脉法复制脑缺血再灌注模型，运用免疫组化方法，测定脑
组织bcl-2、Bax、Cyt-C和Caspase-3的表达，考察药物对Caspase-3细胞凋亡通路的
作用。
结果通脉醒脑滴丸下调神经细胞的促凋亡基因Bax、Caspase-3和CytC表达。
结论研究初步证实通脉醒脑滴丸对脑缺血损伤的保护作用，可能与负调Caspase-3介导
的细胞凋亡通路有关。
【关键词】通脉醒脑滴丸;
脑缺血;
再灌注
脑缺血卒中作为临床常见的危重急症，一直备受关注。
目前认为对脑缺血的治疗核
心在于对神经元损伤的保护以及溶栓再通。
是否能在脑缺血卒中发生后，尽可能延缓
细胞凋亡组织坏死的进程，减轻神经元的损伤，是考察药物对脑缺血保护作用的要
5
点。
本实验选用大鼠线栓法致局灶性脑缺血再灌注模型，采用免疫组织化学方法检测脑
组织神经细胞bcl-2、Bax、Cyt-C、Caspase-3的表达，探求药物是否可通过影响bcl-2
或Bax的表达，影响Cyt-C在线粒体膜的聚集，进一步影响凋亡因子Caspase-3的表
达，发挥其对抗缺血脑组织损伤和神经细胞凋亡的作用。
1材料
1.1药物受试药物：
通脉醒脑滴丸，成都润华堂药业有限公司产品，批号：
070530。
规格：
10mg/粒。
用法用量：
口服，88粒/d，分4次服用。
主治缺血性中风引起的半
身不遂、口眼歪斜、言语不利、偏身麻木等。
阳性对照药物：
尼莫地平片，山西亚宝
药业集团股份有限公司产品，批号：
070109。
20mg/片。
用于治疗
缺血性脑血管病，口服，30～120mg/d。
1.2试剂RabbitAnti-Caspase-3，北京博奥生物技术有限公司产品;
CytochromeC（A-
8）SC-13156，北京中杉金桥生物技术有限公司产品;
Bax（P-19）SC-526，北京中杉金桥生
物技术有限公司产品;
bcl-2GM88702，基因有限公司产品;
ChemMateEnvisionHRP鼠/
兔GK500705，基因有限公司产品;
其它实验室常备试剂均为国产分析纯。
6
1.3仪器Leicarm2135石蜡切片机，德国;
Olympus-BX40型光学显微镜，日本
Olympus公司产品;
MIAS2000型计算机图像工作系统，电子科大金盘多媒体科技有限
公司产品;
LD2-5医用离心机，北京医用离心机厂产品;
WH-2型微量旋涡混合仪，上海
沪西分析仪器厂产品;
DHW-600型不锈钢电热恒温水箱，北京国华医疗器械厂产
品;
202-2型干燥箱，上海市实验仪器总厂产品。
其它实验室常备器皿、耗材均为国产
优质品。
1.4动物SD大鼠，SPF级，质量（30020）g，雌雄各半，由四川省医学科学院实验动
物研究所提供，合格证号：
SCXK（川）2004-15。
2方法
2.1分组及给药选取健康SD大鼠18只，雌雄各半，随机将大鼠分为模型组、给药
组、假手术组3组，每组6只。
其中给药组给予通脉醒脑滴丸73.85mg/kg;
模型组和假
手术组给予等体积蒸馏水。
灌胃给药，1次/d，连续给药7d。
于第7天给药1h后，假
手术组大鼠仅在麻醉状态下分离右侧颈总动脉，不予阻断血流。
模型组和给药组参照
下述方法，复制线栓法致大鼠脑缺血再灌注模型。
参照文献方法[1～3]，第7天给药1h后，腹腔注射10%水合氯醛3.5ml/kg（350
mg/kg）将大鼠麻醉，分离右侧颈总动脉（CCA）、颈外动脉（ECA）和颈内动脉（ICA），在距
CCA分叉部4mm处剪一小口，将拴线插入到ICA，实现对大脑中动脉（MCA）的阻
7
断。
固定线栓。
逐层缝合切口并消毒。
MCA阻断2h后，拔出线栓，进行再灌注。
假
手术组大鼠仅在麻醉状态下分离右侧颈总动脉，不予插入线栓阻断血流。
再灌注24h后，各组大鼠10%水合氯醛3.5ml/kg（350mg/kg）腹腔注射麻醉，仰卧位
固定，剪开胸壁，暴露心脏，将灌流装置的针头刺入左心室，止血钳固定，剪开右心
耳，生理盐水250ml快速灌流冲洗至肺叶和肝脏变白，换用4%多聚甲醛磷酸盐缓冲
液250ml灌注固定，30min后断头取脑，置于4%多聚甲醛中低温避光固定24h。
心
脏灌流前1h给药1次。
常规制备石蜡切片，HE染色项下，采用DAKOEnVision显色系统，光镜100视野
下寻找海马结构，400视野下，运用电子科技大学金盘科技有限公司MIAS2000型计
算机图像工作系统，对染色结果进行检测，每张片选取不重叠的10个视野，每个视野
选20个细胞，统计阳性表达的细胞数和阳性面积百分比。
2.2统计方法运用SPSS13.0统计软件进行统计分析。
3结果
3.1对线栓法致脑缺血再灌注大鼠脑组织神经细胞Bax表达的影响结果见表1。
表1
对线栓法致脑缺血再灌注大鼠脑组织神经细胞Bax表达的影响（s）
8
在高倍镜下，免疫组织化学染色结果显示：
大鼠脑组织神经细胞Bax蛋白主要在胞
浆出现阳性表达。
正常大鼠神经细胞Bax有一定的阳性表达，而脑缺血再灌注大鼠的
神经细胞表达则出现几乎满视野表达，染色呈棕黄或黄褐色。
从表1可见，模型组大
鼠脑组织神经细胞的Bax表达较假手术组有明显的升高（P0.01）。
通脉醒脑滴丸组较之
模型组，Bax阳性细胞表达和阳性面积比明显降低（P0.01），提示通脉醒脑滴丸具有减
少大鼠脑缺血再灌注损伤后神经细胞Bax表达的作用。
3.2对线栓法致脑缺血再灌注大鼠脑组织细胞色素C（Cyt-c）表达的影响表2对线栓
法致脑缺血再灌注大鼠脑组织神经细胞Cyt-C表达的影响（s）
在高倍镜下，免疫组织化学染色结果显示，大鼠脑组织神经细胞Cyt-C蛋白主要在
胞浆出现阳性表达。
正常大鼠神经细胞Cyt-C的有一定阳性表达，而脑缺血再灌注大
鼠的神经细胞表达则相对较高，染色呈棕黄或黄褐色。
从表2可见，模型组大鼠脑组
织神经细胞的Cyt-C表达较假手术组有明显的升高（P0.01），给药组较之模型组，Cyt-C
阳性细胞表达个数和阳性面积比明显降低（P0.01），提示通脉醒脑滴丸具有减少大鼠脑
缺血再灌注损伤神经细胞Cyt-C表达的作用。
3.3对线栓法致脑缺血再灌注大鼠脑组织神经细胞Caspase-3表达的影响结果见表3
表3对线栓法致脑缺血再灌注大鼠脑组织神经细胞Caspase-3表达的影响（s）
9
高倍镜下，免疫组织化学染色结果显示，大鼠脑组织神经细胞Caspase-3蛋白在胞浆
和胞核均出现阳性表达。
正常大鼠神经细胞Caspase-3有一定阳性表达，而模型组大鼠
几乎出现满视野的阳性表达，染色呈棕黄或黄褐色。
从表3可见，模型组大鼠脑组织
神经细胞的Caspase-3表达较假手术组有明显的升高（P0.01）。
通脉醒脑滴丸组较之模
型组，Caspase-3阳性细胞表达和阳性面积比有所降低（P0.05），提示通脉醒脑滴丸具有
减少大鼠脑缺血再灌注损伤神经细胞Caspase-3表达的作用。
3.4对线栓法致脑缺血再灌注大鼠脑组织神经细胞bcl-2表达的影响在高倍镜下，免
疫组织化学染色结果显示，正常组和给药组大鼠神经细胞bcl-2未见阳性表达，而脑缺
血再灌注大鼠的神经细胞仅出现极少量表达，平均每100个细胞约有1个阳性细胞表
达，染色呈黄褐色，分布在神经胶质细胞胞浆和胞膜。
2.3.2对照品溶液的制备取麝香酮对照品，加无水乙醇制成每毫升含0.1mg的溶液，
作为对照品溶液。
10
2.3.3阴性对照溶液的制备按处方量制备不含麝香酮的阴性样品，按供试品溶液制备
方法制备阴性对照溶液。
2.4专属性考察取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液，分别依法测定。
在该色
谱条件下，在与麝香酮对照品保留时间相同的位置不出现色谱峰，表明其他成分对麝
香酮的测定无干扰。
结果见图1～3。
图1麝香酮对照组色谱图
2.5样品测定按正文所述方法，对各厂家各批次样品进行检验，结果均呈正结果。
图
2样品色谱图图3阴性色谱图
3讨论
因为麝香酮具有脂溶性，采用石油醚（30～60℃）提取的方法，这样组分的转移率较
高，同时操作简便。
但是因为本品麝香酮的处方量过低，必须进行富集的过程。
因为
样品为50%的乙醇制剂，与石油醚（30～60℃）会发生混溶，因此加入4倍量的水，再置
于分液漏斗中用石油醚（30～60℃）提取，可使麝香酮成分不会损失。
但是富集后导致杂
质峰较多，用平温或较快的升温速率均达不到较好的分离效果，因此经过摸索将升温
速率定为每分钟升高0.8℃，在该方案下，供试品中各组分出峰时间较合适，分离效果
11
较好，而且各组分对应的峰面积和理论踏板数均较高，同时更能保证检测结果的真实
性、准确性。
【参考文献】
[1]国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部[S].北京：
化学工业出版社，2005.
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