高效液相色谱法快速测定淫羊藿中6种主要黄酮成分概要文档格式.docx

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黄酮中图分类号:

TQ463文献标志码:

Adoi:

10.3969/jissn.1671-9646（X.2011.01.003

DeterminationofSixMainFlavonoidsinHerbaEpimediumRapidly

byHighPerformanceLiquidChromatography

JiangHuajun,LiYinhua,*LiuZhonghua,HuangZhiqiang,ChangQiu,LinHaiyan

（NationalResearchCenterofEngineering&

TechnologyforUtilizationofFunctionalIngredientsfromBotanicals,Hu'

nan

AgriculturalUniversity,Changsha,Hu'

nan410128,China

Abstract:

ARP-HPLCmethodhasbeenestablishedforquicklydeterminationofsixmainflavonoidsinHerbaEpimedium.ThesamplesareseparatedonWelchromTMC18（200mm×

4.6mm,5μmwithmobilephaseconsistedofacetonitrile-water.Thecolumntemperatureis35℃,thewavelengthis270nmandtheflowrateis1.0mL/min.TheresultsshowthatsixFlavonoidsreachbaselineseparationwithin27min.Thismethodhasadvantagesofusinglittleanalytictime,agoodstabilityandaccuracyofoperation,hassomereferencesvalueforestablishingstandardizationqualitycontrolmethodofEpimediumherb.Keywords:

highperformanceliquidchromatography（HPLC;

Epimedium;

Flavonoid

0引言

淫羊藿为小檗科（Berberidaceae淫羊藿属（Epimedium植物,是历史悠久的传统中药,始载于《神农本草经》,具有补肾阳、强筋骨、祛风湿等功效,用于治疗遗精阳萎、筋骨痰软、风湿痹痛、更年期综合症、高血压、骨质疏松等疾病[1]。

淫羊藿种类繁多,仅药典规定的就有5种[2]。

由于淫羊藿药材大多选用野生资源,种类繁多,各产区品种混杂,质量参差不齐,且药材质量控制体系不完善,使得淫羊藿在医药方面的应用受到了极大的限制。

《中国药典》规定淫羊藿苷为淫羊藿药材的质量控制指标[2]。

然而,淫羊藿含有数十种类黄酮成分,各主要黄酮都有不同的生物活性。

淫羊藿次苷类虽然含量较低,但近年来研究表明,它具有多种生物活性。

蔡曼玲等人[3]发现淫羊藿苷、淫羊藿次苷Ⅰ、淫羊藿次苷Ⅱ、朝藿定B、朝藿定C等5种黄酮类物质能显著提高细胞基质钙,促进体外培养成骨细胞增殖和增加矿化结节钙。

林新等人[4]发现,淫羊藿次苷Ⅱ体外对人鼻咽癌KB细胞、人红白血病K562细胞以及HL-60细胞有抑制作用,具有较好的抗癌活性。

Keun-SungLee等人[5]研究表明,淫羊藿次苷Ⅱ具有抑制COX-2/PGE2途径和诱导细胞凋亡的作用,因而成为很好的抗肿瘤化疗药物。

王婷等人[6]发现,淫羊藿次苷Ⅱ对人乳腺癌细胞株（MCF-7和人肝癌细胞株（HepG2的生长均表现出增殖抑制作用。

AnlunMa等人[7]发现,淫羊藿次苷Ⅱ对T细胞和B细胞具有特异的免疫抑制作用,而且能够有效防止

收稿日期:

2010-10-12

基金项目:

湖南省科技重大专项基金（07FJ1005。

作者简介:

蒋华军（1985-,男,湖南人,硕士,研究方向:

色谱分析工作。

E-mail:

jhj5429@。

*为通讯作者:

刘仲华,教授,博士生导师。

第1期（总第232期农产品加工·

学刊

No.12011年1月AcademicPeriodicalofFarmProductsProcessingJan.

文章编号:

1671-9646（201101-0011-03

农产品加工·

学刊2011年第1期

大鼠体内心脏移植造成的免疫排斥作用。

PARKJun-Seong等人[8]利用酶促反应,将淫羊藿苷成功转化成淫羊藿次苷Ⅱ,并在中试中取得了良好的效果。

淫羊藿苷和淫羊藿次苷在植物体内也可能相互转化。

所以在药材质量控制过程中,应该综合考察淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和淫羊藿次苷等主要黄酮的含量,客观地反映淫羊藿的内在质量。

当前,测定淫羊藿类黄酮多限于淫羊藿苷,也有学者同时测定过淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B和朝藿定C,但均未涉及淫羊藿次苷的测定。

本文建立了反相高效液相色谱法快速测定淫羊藿中6种主要黄酮类成分,旨在为淫羊藿药材的质量控制资源利用提供快速简便的测定方法。

1试验部分

1.1主要仪器

ShimadzuLC-10ATVP型高效液相色谱仪,LC-solution型色谱工作站,Millipore型超纯水器,KQ3200型超声波提取器,MettlerToledoAG104型电子天平。

1.2试剂与样品

乙腈为色谱纯,朝藿定A,朝藿定B,朝藿定C,淫羊藿苷、淫羊藿次苷Ⅰ,淫羊藿次苷Ⅱ,上海融禾医药科技有限公司提供。

淫羊藿提取物及原料,湖南飞拓植物制品有限公司提供。

1.3色谱条件

WelchromTMC18（200mm×

流动相A为水,流动相B为乙腈;

梯度洗脱程序:

0~12min,28%乙腈维持不变,12~18min,28%乙腈线性升至52%乙腈,保持12min后,于2min内降至28%乙腈,35min停止;

1mL/min;

270nm;

进样量:

10μL。

1.4对照品溶液的制备

分别精密称定朝藿定A,朝藿定B,朝藿定C,淫羊藿苷和淫羊藿次苷Ⅰ,淫羊藿次苷Ⅱ标准品适量,用甲醇溶解定容,配成质量浓度均为0.4mg/mL的对照品储备液,过0.45μm有机系微孔滤膜,备用。

1.5供试品溶液的制备

1.5.1淫羊藿提取物

精密称取淫羊藿样品,用甲醇配制成适当浓度的溶液,并过0.45μm有机系微孔滤膜,滤液作为供试品溶液,待用。

1.5.2淫羊藿药材

取样品粉末（过3号筛约0.2g,精密称定,置于50mL量瓶中,加体积分数为70%的乙醇至刻度,称质量,超声功率300W,频率25kHz,处理30min,制冷;

再称质量,用体积分数为70%的乙醇补足减失的质量,摇匀,滤过,取续滤液过0.45μm有机系微孔滤膜,即得[9]。

2结果与讨论

2.1标准曲线与线性范围

分别吸取上述对照品溶液0.2,0.5,1.0,2.0,5.0,10.0mL,用甲醇稀释,定容至10mL,配成一系列不同浓度的标准溶液。

分别取各标准溶液10μL依次进样,每个样品浓度进样2次,记录色谱图。

以峰面积平均值为纵坐标,进样量为横坐标,绘制标准曲线。

6种类黄酮的回归方程和线性范围见表1。

由表1可知,6种黄酮在一定范围内均呈良好的线性关系,相关系数均在0.99以上。

2.2精密度与稳定性试验

将6种类黄酮标准品溶液按“1.3”中的色谱条件进行HPLC分析,重复进样5次。

结果发现,朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷和淫羊藿次苷Ⅰ、淫羊藿次苷Ⅱ保留时间的相对标准偏差（RSD依次为0.11%,0.15%,0.13%,0.12%,0.18%,0.16%,峰面积的RSD值依次为0.18%,0.15%,0.14%,0.16%,0.22%,0.21%,说明本方法重复性良好。

按“1.5.1”中的样品处理方法制备样品溶液,低温避光冷藏,每隔2h按“1.3”中的色谱条件进样分析1次,连续分析12h,计算各组分峰面积的RSD值。

结果表明,朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷和淫羊藿次苷Ⅰ和淫羊藿次苷Ⅱ的RSD分别为:

1.53%,1.82%,2.06%,0.96%,2.48%,1.98%。

表明样品溶液在12h内稳定。

2.3检测限和定量限试验

将6种标准品配成低浓度溶液进样,以S/N≥10为定量限,S/N≥3为检测限,信噪比为3∶1时,朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、淫羊藿次苷Ⅰ,淫羊藿次苷Ⅱ的检测限分别为:

1.44,1.81,0.83,1.81,0.07,0.04ng,信噪比为10∶1,朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、淫羊藿次苷Ⅰ,淫羊藿次苷Ⅱ的定量限分别为:

7.21,8.28,10.35,9.03,0.43,0.49ng。

表16种类黄酮的回归方程和线性范围

黄酮回归方程校正系数R

线性范围/mg·

L-1朝霍定A

朝霍定B

朝霍定C

淫羊霍苷

淫羊霍次苷Ⅰ

淫羊霍次苷Ⅱ

Y=162.5X-1.9947

Y=170.98X-0.6481

Y=144.76X-0.4671

Y=207.27X-0.4812

Y=216.91X+1.4503

Y=266X+2.1976

0.9975

0.9933

0.9909

0.9926

0.9949

0.9953

7.36~3687.68~38410.56~5287.68~3847.36~36810.08~504

·

12·

2011年第1期

2.4回收率试验

精密称量已知含量的同一批淫羊藿原料6份,加入适量标样,再按“1.5.2”的原料处理方法,进行HPLC分析,以峰面积的平均值算出加标回收率。

6种黄酮的回收率测定见表2。

2.5样品测定

取2批提取物和2批淫羊藿叶片原料,按上述“2.3”供试品溶液制备方法及“2.1”色谱条件进行测定,以外标法计算含量。

样品测定结果见表3,提取物1的色谱见图1,淫羊藿原料2的色谱见图2。

3结论

（1建立了RP-HPLC法快速测定淫羊藿中6种主要黄酮成分的方法,通过优化方法,将母核相同、极性相似的朝藿定A,朝藿定B和朝藿定C达到基线分离,并且同时测定出极性差异较大的黄酮类成分朝藿定类和淫羊藿次苷类。

此方法快速、准确、稳定,对淫羊藿药材的质量控制和资源筛选具有一定的参考价值。

（2首次将淫羊藿次苷列入药材质量控制指标,近年来研究表明,淫羊藿次苷对促进成骨细胞增殖、提高免疫力、协同抗癌方面均有疗效。

因此,今后应该深入开展淫羊藿次苷的生物活性、药理及代谢方面的研究,全面阐述淫羊藿中各种活性成分对药材质量控制的意义。

参考文献:

裴利宽.淫羊藿药材HPLC、IR指纹图谱法鉴别和质量研究[D].北京:

中国协和医科大学,2006.

药典委员会.中华人民共和国药典（一部[M].北京:

化学工业出版社,2005.

蔡曼玲,季晖,李萍,等.5种淫羊藿黄酮成分对体外培养成骨细胞的影响[J].中国天然药物物,2004,2（7:

235-238.

林新,李文魁,罗崇念,等.淫羊藿次苷Ⅱ对三种肿瘤细胞株增殖的抑制作用[J].中国药理学与毒理学杂志,1997,11（3:

183.

Keun-SungLee,Hyo-JeonqLee.Cyclooxygenase-2/prostaglandinE2pathwaymediatesicarisideⅡinducedapoptosisinhumanPC-3prostatecancercells[J].Cancerletters,2009,280（1:

93-100.

王婷,张金超,陈瑶,等.6种淫羊藿黄酮抗氧化和抗肿瘤活性的比较[J].中国中药杂志,2007,32（8:

715-717.

MaAnlun,QiShijie,XuDasheng,etal.Baohuoside-1,anovelimmunosuppressivemoleculeinhibitslymphocyteactivationinvitroandinvivo[J].TransPlantation,2004,78（6:

831-838.

ParkJunSeong,HyeYoonPark.StatisticallyDesignedEnzymaticHydrolysisforOptimizedProductionofIcarisideIIasaNovelMelanogenesisInhibitor[J].Journalofmicro-biologyandbiotechnology,2008,18（1:

110-117.国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部[M].北京:

化学工业出版社,2010.

表26种黄酮的回收率测定

黄酮Backgroud

/μg

Added/μg

朝霍定A朝霍定B朝霍定C淫羊霍苷淫羊霍次苷Ⅰ淫羊霍次苷Ⅱ

584.70

890.70

3664.30

2412.90

19.89

302.50

1803.2

1881.6

2587.2

2469.6

Found

2321.0

2758.4

6151.5

4277.3

1845.0

2774.9

回收率

/%

97.2

99.5

98.4

99.6

101.2

100.1

表3样品测定结果

图2淫羊藿原料2的色谱

样品名称湖南飞拓样品1湖南飞拓样品2

2.758

5.021

13.739

20.671

0.776

1.280

1.074

2.425

5.684

44.739

1.377

0.658

甘肃原料1

0.147

0.232

0.845

0.560

0.028

0.197

甘肃原料2

0.294

0.448

1.842

1.213

0.010

0.152

[1]

[2]

[3]

[4]

[5]

[6]

[7]

[8]

[9]

图1提取物1的色谱

蒋华军,等:

高效液相色谱法快速测定淫羊藿中6种主要黄酮成分·

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