黄酮标准曲线绘制的实验报告Word下载.docx
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大青叶子采摘于海南大学东坡湖畔
实验步骤:
准备工作及波长的确定
样品60℃烘干粉碎机粉碎,过20目筛,装入试剂瓶中备用。
根据查阅文献总黄酮在波长为510nm处吸收值最大。
参照品芦丁标准溶液的制备
精密称取120℃干燥至恒重的芦丁标准样品置于100mL烧杯中,用60%乙醇溶解后定容至25mL容量瓶中,摇匀,即可得mL的芦丁标准溶液。
标准品的测量及绘制标准曲线
精密吸取芦丁标准溶液、、、、、、,分别置于10mL容量瓶中,并定容至刻度线。
得到ml、ml、ml、ml、ml、ml、ml的标准品溶液,分别取1ml到试管中各加5%亚硝酸钠溶液摇匀,放置6min,加10%硝酸铝溶液摇匀,放置6min,加1mol/L氢氧化钠溶液4mL,再用60%乙醇溶液稀释至刻度,放置15min后,分别在510nm处测定其吸光度(Tai,Cai&
Dai,2011)。
(以试剂空白做参比)
以吸光度A为纵坐标,浓度c为横坐标,绘制标准曲线。
用最小二乘法进行线性拟合,得c与A的线性回归方程以及相关系数R2。
序号
浓度(ug/ml)
吸光度
1
2
15
3
30
4
45
5
60
6
75
7
90
表1-1:
芦丁标准曲线测定数据
图1-2:
芦丁标准曲线
样品的测试
取黄酮提取液,取提液2ml至10ml的比色管中用60%的乙醇定容至刻度线则稀释5倍。
取稀释好的溶液4份1ml置入10ml的比色管中,其中一份用60%的乙醇定容,作为参比溶液。
其余各份各加5%亚硝酸钠溶液摇匀,放置6min,加10%硝酸铝溶液摇匀,放置6min,加1mol氢氧化钠溶液4mL,再用60%乙醇溶液稀释至刻度,放置15min后,分别在510nm处测定其吸光度。
代入标准曲线回归方程可得浓度数据(以芦丁为参比),三次结果取平均值。
经换算后得样品中总黄酮含量。
样品总黄酮含量(mg/g)=X*n*V1/(V*W)
式中:
X—测出的浓度,mg/mL;
(直接代入,不用换算。
)
n—稀释倍数,量纲为1;
VI—样液总体积,mL;
V—测定时取样体积,mL;
W—样品质量,g。
2.总分含量的测定
ALZO4型电子分析天平:
上海梅特勒一托利多仪器有限公司;
DELA犯O型pH计:
723可见分光光度计:
上海菩华科技仪器有限公司;
DK一512型电热恒温水浴锅:
上海森信实验仪器有限公司;
容量瓶(250mL,10OmL,25mL)、比色管管(10mL);
烧杯、移液管、吸耳球。
试剂及药品
基准纯,购于上海分析试剂厂,置50℃真空干燥箱真
空中干燥4h。
乙醇为工业级,蒸馏水,其他试剂均为分析纯。
Folin—Ciocalteu比色法测定总酚酸含量
Folin—Ciocalteu试剂的配制
称取20g钨酸钠和5g钼酸钠于圆底烧瓶中,用140ml蒸馏水溶解,加入10ml85%的磷酸溶液和20ml浓盐酸,文火回流10h,然后加入3g硫酸锂及15ml双
氧水,加热沸腾15min至亮黄色,不得带微蓝和绿色。
冷却,移入250ml容量瓶中,定容,贮于棕色瓶中,4℃冰箱保存。
对照品溶液制备
准确称取15.00mg干燥的没食子酸,加蒸馏水适量,超声溶解,放冷,以蒸馏水定容至50ml,制成mL没食子酸的溶液,作为对照品溶液。
将mL的没食子酸标准溶液分别配制成mL,mL,mL,mL,mL,mL、mL、mL的溶液,分别取1mL置于10mL的容量瓶中,加入2ml福林试剂,充分摇匀,加入0.75ml%碳酸钠溶液.混匀,以蒸馏水稀释至刻度。
振荡一下,静置2h(Guo&
Wei,2011)。
同时制作空白管。
为消除供试品溶液本身颜色的干扰,同时制作不加显色剂的对照管。
于765nm波长处测定吸光度值。
标准曲线的制备
吸光度()
9
12
18
21
表3-1:
没食子酸标准曲线测定数据
图3-1:
没食子酸标准曲线
样品的测定
取提液2ml至10ml的比色管中用60%的乙醇定容至刻度线则稀释5倍。
取稀释后溶液1ml四份,分别置于10mL比色管中,加入2ml福林试剂,充分摇匀,加入0.75ml%碳酸钠溶液.混匀,以蒸馏水稀释至刻度。
振荡一下,静置2h。
总酚酸含量计算:
多酚含量(mg/100g)=
3.清除DPPH·
的能力的测定
.实验仪器、药品及试剂
容量瓶(250mL,10OmL,25mL)、比色管(10mL);
(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl,二苯代苦味肼基自由基);
Vc(Ascrobicacid,维生素C,抗坏血酸)为分析纯;
无水乙醇,蒸馏水
配制DPPH溶液
配制试剂,放入冰箱4℃进行冷藏,以备用。
参照品Vc标准溶液的制备
准确称取到100mL的烧杯中用无水乙醇溶解后,置于50mL的容量瓶中定容至刻度线及可以得到2mmol/L的母液,分别量1、2、3、4、5、6ml至10ml的比色管中用无水乙醇定容至刻度线,则可以得到L、L、L、L、1mmol/L、L的溶液。
从以上比色管中分别取溶液置于试管中再加入的DPPH,反应30min,在517nm测出吸光值(Thoo&
Ho,2010),用无水乙醇代替待测液作为对照,用无水乙醇作空白,重复三组。
清除率=[(Ac-Ai)/Ac]×
100%
式中,Ac:
mL无水乙醇加DPPH溶液的吸光度;
Ai:
mL待测液加溶液的吸光度。
标准曲线的绘制
测试数据及标准曲线的绘制
C(mmol/L)
清除率/%
VC标准曲线测定数据
VC含量与吸光度的关系
VC含量与清除率的关系
样品的测定
取提液4ml至10ml的比色管中用60%的乙醇定容至刻度线则稀释倍。
取稀释后溶液三份,分别置于10mL试管中,再分别加入配置好的DPPH溶液,摇匀,反应30min后,分别在517nm处测定其吸光度。
代入标准曲线回归方程可得浓度数据(以Vc为参比),三次结果取平均值。
经换算后得样品自由基清除率。
4.清除ABTS+自由基能力的测定
+自由基的配制
准确称取于50mL的容量瓶中,用无水乙醇定容,摇匀,浓度7mmol/L;
7mmol/LABTS+.与L的高硫酸钾等体积混合,在室温、避光黑暗的条件下静置过夜反应12~16h,形成ABTS+自由基储备液。
该储备液在室温,避光的条件下稳定。
用前用无水乙醇稀释成工作液,于波长734nm处测得其吸光度为(±
),再装入棕色试剂瓶中,放入冰箱4℃进行冷藏,以备用。
标准曲线的绘制
参照品Vc标准溶液的制备及测试
准确称取到100mL的烧杯中用无水乙醇溶解后,置于50mL的容量瓶中用无水乙醇定容至刻度线及可以得到1mmol/L的母液,分别量1、2、3、4、5、6、7、8ml至10ml的比色管中用无水乙醇定容至刻度线,则可以得到L、L、L、L、L、L、L、L的溶液。
从以上比色管中分别取溶液置于试管中再加入的DPPH,反应30min,在517nm测出吸光值,用无水乙醇代替待测液作为对照(Zhu&
Lian,2011),用无水乙醇作空白,重复三组。
mL无水乙醇加ABTS+自由基溶液的吸光度;
mL待测液加+自由基溶液的吸光度。
C(mmol/l)
8
表4-1:
Vc浓度与吸光值和清除率的数据
图4-1Vc浓度与其吸光值的关系
图4-2:
Vc浓度与其清除ABTS能力的关系
5.还原能力的测定
实验试剂
磷酸盐缓冲溶液(配成l);
K3Fe(CN)6溶液(配成1%);
三氯乙酸(配成10%);
FeCl3(配成%);
没食子酸
无水乙醇
试剂的配制
磷酸盐缓冲溶液L):
准确称取的磷酸氢二钠至100mL的烧杯中用蒸馏水溶解后,置于100mL的容量瓶中用蒸馏水定容,即可得到L的磷酸氢二钠,同样的方法配制L的磷酸二氢钠。
准确量取的L磷酸氢二钠溶液和的L磷酸二氢钠溶液至烧杯中,用pH校正既可以得到磷酸盐缓冲溶液L)。
标准溶液的配制及测试
用没食子酸做标准曲线其浓度范围在50—300ug/ml,准确称取50mg没食子酸到100mL烧杯中用无水乙醇溶解后,置于容量瓶中用无水乙醇定容至刻度线,得到ml的母液,在分别取1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL至10mL的容量瓶中用无水乙醇定容至刻度先,得到50ug/ml、100ug/ml、150ug/ml、200ug/ml、250ug/ml、300ug/ml的溶液,取不同浓度的待测液或样品1ml于试管中,依次加入磷酸盐缓冲溶液(l)和1%K3Fe(CN)6溶液后混合均匀,混合液于50℃水浴20min,再加入10%的三氯乙酸。
于(3000r/min)离心10min,取的上清液再依次加蒸馏水和%的FeCl3混合均匀,静置10min在700nm处测定吸光值,通过在700nm下的吸收值来测量提取物的还原能力,吸光值越高表明还原力越强,EC50的计算是吸光值为时的浓度(Roy&
Laskar,2011)。
Testset
gallicacidconcentrationug/ml
Absorbency
50
100
150
200
250
300
表5-1:
没食子酸的质量浓度和吸光值的数据
图5-1:
没食子酸的质量浓度与其吸光值的关系
6.超氧自由自测定
1实验试剂
Tris-Hcl缓冲液(配制50mmol/L)
邻苯三酚(配制3mmol/L)
VC
..1试剂的配制
Tris-HCl(50mmol/L)缓冲溶液:
取三羟甲基氨基甲烷(Tris),蒸馏水溶解定容至50mL容量瓶;
取分析纯盐酸溶液至100mL的容量瓶中用蒸馏水定容至刻度,即得L盐酸溶液;
分别取配置好的Tris50mL和L盐酸溶液于100mL容量瓶中,蒸馏水定容至刻度,用pH计进行校正即可以得到Tris-HCl(50mmol/L)缓冲溶液。
邻苯三酚:
配制10mmol/L的稀盐酸,取分析纯盐酸溶液至1000mL的容量瓶中用蒸馏水定容至刻度线;
取焦性没食子酸,至25mL的容量瓶中用10mmol/L的稀盐酸溶液定容至刻度线。
标准溶液的配置及测试
精密称取Vc标准样品置于100mL烧杯中,用纯净水溶解后定容至100mL容量瓶中,即可得mL的Vc标准溶液。
将mL的Vc标准溶液分别配制成mL,mL,mL,mL,mL,mL,mg/mL,mg/mL,mg/mL,mg/mL,mg/mL的溶液,分别加入的Tris-HCl(50mmol/L)缓冲溶液于10mL的试管中,再加入1mL不同浓度样品或待测液,25℃反应10min,再加入25℃预热的邻苯三酚(3mmol/L用10mmol/L的盐酸配制),迅速摇匀,于325nm出测定,加入邻苯三酚即开始计时,每隔30s读取一次,至5min,做好记录。
邻苯三酚的自氧化速率以无水乙醇代替样品,Tris-HCl缓冲溶液作空白。
清除率%=[(△Ac-△Ai)/△Ac]×
式中,△Ac:
邻苯三酚自氧化速率;
△Ai:
加入待测液后邻苯三酚自氧化速率。
吸光值
自氧化速率
抑制率
时间min
1st
5th
邻苯三酚
浓度ug/ml
0
120
表6-1:
Vc的质量浓度与吸光值和抑制率的的数据
图6-1:
Vc的质量浓度与其清除超氧自由基关系