1、大青叶子 采摘于海南大学东坡湖畔 实验步骤: 准备工作及波长的确定样品60烘干粉碎机粉碎,过20目筛,装入试剂瓶中备用。根据查阅文献总黄酮在波长为510nm处吸收值最大。 参照品芦丁标准溶液的制备精密称取120 干燥至恒重的芦丁标准样品置于100mL烧杯中,用60%乙醇溶解后定容至25mL 容量瓶中,摇匀,即可得mL的芦丁标准溶液。 标准品的测量及绘制标准曲线精密吸取芦丁标准溶液、 ,分别置于10mL 容量瓶中,并定容至刻度线。得到ml、ml、ml、ml、ml、ml、ml的标准品溶液,分别取1ml到试管中各加5 %亚硝酸钠溶液 摇匀,放置6min ,加10%硝酸铝溶液 摇匀,放置6min ,加
2、1mol /L氢氧化钠溶液4mL ,再用60%乙醇溶液稀释至刻度,放置15min 后,分别在510nm 处测定其吸光度(Tai,Cai&Dai,2011)。(以试剂空白做参比)以吸光度A 为纵坐标,浓度c为横坐标,绘制标准曲线。用最小二乘法进行线性拟合,得c与A 的线性回归方程以及相关系数R2。序号浓度(ug/ml)吸光度1215330445560675790表1-1: 芦丁标准曲线测定数据图1-2:芦丁标准曲线样品的测试取黄酮提取液, 取提液2ml至10ml的比色管中用60%的乙醇定容至刻度线则稀释5倍。取稀释好的溶液4份1ml置入10ml的比色管中,其中一份用60%的乙醇定容,作为参比溶液
3、。其余各份各加5%亚硝酸钠溶液 摇匀,放置6min ,加10%硝酸铝溶液 摇匀,放置6min ,加1mol 氢氧化钠溶液4mL ,再用60%乙醇溶液稀释至刻度,放置15min后,分别在510nm处测定其吸光度。代入标准曲线回归方程可得浓度数据(以芦丁为参比),三次结果取平均值。经换算后得样品中总黄酮含量。样品总黄酮含量(mg/g)=X*n*V1/( V *W)式中:X测出的浓度,mg/ mL;(直接代入,不用换算。)n稀释倍数,量纲为1;VI样液总体积,mL;V测定时取样体积,mL;W样品质量,g。2.总分含量的测定ALZO4型电子分析天平:上海梅特勒一托利多仪器有限公司;DELA犯O型pH计
4、:723可见分光光度计:上海菩华科技仪器有限公司;DK一512型电热恒温水浴锅:上海森信实验仪器有限公司;容量瓶(250mL,10OmL,25mL)、比色管管(10mL);烧杯、移液管、吸耳球。试剂及药品基准纯,购于上海分析试剂厂,置50真空干燥箱真空中干燥4 h。乙醇为工业级,蒸馏水,其他试剂均为分析纯。 FolinCiocalteu比色法测定总酚酸含量 FolinCiocalteu试剂的配制称取20 g钨酸钠和5 g钼酸钠于圆底烧瓶中,用140 ml蒸馏水溶解,加入10ml 85的磷酸溶液和20 ml浓盐酸,文火回流10 h,然后加入3 g硫酸锂及15 ml双氧水,加热沸腾15 min至亮
5、黄色,不得带微蓝和绿色。冷却,移入250 ml容量瓶中,定容,贮于棕色瓶中,4冰箱保存。 对照品溶液制备准确称取1500 mg干燥的没食子酸,加蒸馏水适量,超声溶解,放冷,以蒸馏水定容至50ml,制成mL没食子酸的溶液,作为对照品溶液。将mL的没食子酸标准溶液分别配制成mL,mL,mL,mL,mL,mL、mL、mL的溶液,分别取1mL置于10mL的容量瓶中,加入2 ml福林试剂,充分摇匀,加入075ml 碳酸钠溶液混匀,以蒸馏水稀释至刻度。振荡一下,静置2h(Guo&Wei,2011)。同时制作空白管。为消除供试品溶液本身颜色的干扰,同时制作不加显色剂的对照管。于765 nm波长处测定吸光度值
6、。 标准曲线的制备吸光度()9121821表3-1:没食子酸标准曲线测定数据图3-1:没食子酸标准曲线 样品的测定 取提液2ml至10ml的比色管中用60%的乙醇定容至刻度线则稀释5倍。取稀释后溶液1ml四份,分别置于10mL比色管中,加入2 ml福林试剂,充分摇匀,加入075ml 碳酸钠溶液混匀,以蒸馏水稀释至刻度。振荡一下,静置2h。总酚酸含量计算:多酚含量(mg/100g)= 3.清除 DPPH的能力的测定.实验仪器、药品及试剂容量瓶(250mL,10OmL,25mL)、比色管(10mL);(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl,二苯代苦味肼基自由基);Vc(Asc
7、robic acid,维生素 C,抗坏血酸)为分析纯;无水乙醇,蒸馏水 配制DPPH溶液 配制试剂,放入冰箱4进行冷藏,以备用。 参照品Vc标准溶液的制备 准确称取到100mL的烧杯中用无水乙醇溶解后,置于50mL的容量瓶中定容至刻度线及可以得到2mmol/L的母液,分别量1、2、3、4、5、6ml至10ml的比色管中用无水乙醇定容至刻度线,则可以得到L、L、L、L、1mmol/L、L的溶液。从以上比色管中分别取溶液置于试管中再加入的DPPH,反应30min,在517nm测出吸光值(Thoo&Ho,2010),用无水乙醇代替待测液作为对照,用无水乙醇作空白,重复三组。 清除率=(Ac-Ai)/
8、Ac100%式中,Ac: mL 无水乙醇加 DPPH 溶液的吸光度;Ai: mL 待测液加 溶液的吸光度。 标准曲线的绘制测试数据及标准曲线的绘制C(mmol/L)清除率/%VC标准曲线测定数据VC含量与吸光度的关系VC含量与清除率的关系 样品的测定 取提液4ml至10ml的比色管中用60%的乙醇定容至刻度线则稀释倍。取稀释后溶液三份,分别置于10mL 试管中,再分别加入配置好的DPPH溶液,摇匀,反应30min后,分别在517nm处测定其吸光度。代入标准曲线回归方程可得浓度数据(以Vc为参比),三次结果取平均值。经换算后得样品自由基清除率。4. 清除ABTS+自由基能力的测定+自由基的配制准
9、确称取于50mL的容量瓶中,用无水乙醇定容,摇匀,浓度7mmol/L;7mmol/LABTS+.与L的高硫酸钾等体积混合,在室温、避光黑暗的条件下静置过夜反应1216h,形成 ABTS+ 自由基储备液。该储备液在室温,避光的条件下稳定。用前用无水乙醇稀释成工作液,于波长734nm处测得其吸光度为(),再装入棕色试剂瓶中,放入冰箱4进行冷藏,以备用。标准曲线的绘制参照品Vc标准溶液的制备及测试 准确称取到100mL的烧杯中用无水乙醇溶解后,置于50mL的容量瓶中用无水乙醇定容至刻度线及可以得到1mmol/L的母液,分别量1、2、3、4、5、6、7、8ml至10ml的比色管中用无水乙醇定容至刻度线
10、,则可以得到L、L、L、L、L、L、L、L的溶液。从以上比色管中分别取溶液置于试管中再加入的DPPH,反应30min,在517nm测出吸光值,用无水乙醇代替待测液作为对照(Zhu&Lian,2011),用无水乙醇作空白,重复三组。 mL 无水乙醇加 ABTS+ 自由基溶液的吸光度; mL 待测液加 + 自由基溶液的吸光度。C(mmol/l)8表4-1:Vc浓度与吸光值和清除率的数据图4-1Vc浓度与其吸光值的关系图4-2:Vc浓度与其清除ABTS能力的关系5.还原能力的测定实验试剂磷酸盐缓冲溶液(配成 l);K3Fe(CN)6溶液(配成1%);三氯乙酸(配成10%);FeCl3(配成%);没食
11、子酸无水乙醇试剂的配制 磷酸盐缓冲溶液 L):准确称取的磷酸氢二钠至100mL的烧杯中用蒸馏水溶解后,置于100mL的容量瓶中用蒸馏水定容,即可得到L的磷酸氢二钠,同样的方法配制L的磷酸二氢钠。准确量取的L磷酸氢二钠溶液和的L磷酸二氢钠溶液至烧杯中,用pH校正既可以得到磷酸盐缓冲溶液 L)。标准溶液的配制及测试用没食子酸做标准曲线其浓度范围在50300ug/ml,准确称取50mg没食子酸到100mL烧杯中用无水乙醇溶解后,置于容量瓶中用无水乙醇定容至刻度线,得到ml的母液,在分别取1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL至10mL的容量瓶中用无水乙醇定容至刻度先,得到50ug/ml、10
12、0ug/ml、150ug/ml、200ug/ml、250ug/ml、300ug/ml的溶液,取不同浓度的待测液或样品1ml于试管中,依次加入磷酸盐缓冲溶液(l)和1% K3Fe(CN)6溶液后混合均匀,混合液于50水浴20min,再加入10%的三氯乙酸。于(3000r/min)离心10min,取的上清液再依次加蒸馏水和%的FeCl3 混合均匀,静置10min在700nm处测定吸光值,通过在700nm下的吸收值来测量提取物的还原能力,吸光值越高表明还原力越强,EC50的计算是吸光值为时的浓度(Roy&Laskar,2011)。Test setgallic acid concentration u
13、g/mlAbsorbency50100150200250300 表5-1:没食子酸的质量浓度和吸光值的数据图5-1:没食子酸的质量浓度与其吸光值的关系6.超氧自由自测定1实验试剂Tris-Hcl缓冲液(配制 50mmol/L)邻苯三酚(配制3mmol/L)VC.1试剂的配制Tris-HCl( 50mmol/L)缓冲溶液:取三羟甲基氨基甲烷(Tris),蒸馏水溶解定容至50mL容量瓶;取分析纯盐酸溶液至100mL的容量瓶中用蒸馏水定容至刻度,即得L盐酸溶液;分别取配置好的Tris50mL和L盐酸溶液于100mL容量瓶中,蒸馏水定容至刻度,用pH计进行校正即可以得到Tris-HCl( 50mmol
14、/L)缓冲溶液。邻苯三酚:配制10mmol/L的稀盐酸,取分析纯盐酸溶液至1000mL的容量瓶中用蒸馏水定容至刻度线;取焦性没食子酸,至25mL的容量瓶中用10mmol/L的稀盐酸溶液定容至刻度线。标准溶液的配置及测试精密称取Vc标准样品置于100mL烧杯中,用纯净水溶解后定容至100mL 容量瓶中,即可得mL的Vc标准溶液。将mL的Vc标准溶液分别配制成mL,mL,mL,mL,mL,mL, mg/mL, mg/mL, mg/mL, mg/mL, mg/mL的溶液,分别加入的Tris-HCl( 50mmol/L)缓冲溶液于10mL的试管中,再加入1mL不同浓度样品或待测液,25反应10min,再加入25预热的邻苯三酚(3mmol/L用10mmol/L的盐酸配制),迅速摇匀,于325nm出测定,加入邻苯三酚即开始计时,每隔30s读取一次,至5min,做好记录。邻苯三酚的自氧化速率以无水乙醇代替样品,Tris-HCl缓冲溶液作空白。清除率%=(Ac-Ai)/Ac式中,Ac:邻苯三酚自氧化速率; Ai:加入待测液后邻苯三酚自氧化速率。吸光值自氧化速率抑制率时间min1st5th邻苯三酚浓度ug/ml0 120表6-1:Vc的质量浓度与吸光值和抑制率的的数据图6-1:Vc的质量浓度与其清除超氧自由基关系
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