美国药典29微生物限度检查Word文档下载推荐.docx
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或（3）适当地将
（1）和
（2）结合使接种物可以生长。
可在培养基中加入0.5%的大豆卵磷脂和4.0%的聚山梨酸酯-20以中和供试品中的所存在的抑菌成分。
或者用酪蛋白水解物-大豆卵磷脂-聚山梨酸酯-20-培养基按前述方法重复试验以确认对供试品中的保护剂或其他抗菌剂的中和作用。
若产品中含有抑菌成分，而该产品又是可溶的，可采用无菌检查项下产品的无菌检查法中的薄膜过滤法。
如果在加入灭活剂或大大增加稀释剂的体积后仍不能使上述培养物恢复存活，而且该产品不适合采用薄膜过滤法，可以作如下推断：
所接种微生物的分离培养失败是由于该产品的抑菌活性。
此信息表明该产品未被指定（上述给定）的微生物所污染（此信息表明该产品大概不会被上述给定的微生物所污染）。
应继续进行监测以建立该产品的抑菌谱和杀菌活性范围。
缓冲液和培养基
培养基既可以按以下处方配制，也可以使用生产者或销售商推荐的，与该配方相类似的脱水培养基。
按以下程序配制培养基：
将可溶性固体溶解在水中，必要时可加热促使其完全溶解，用HCl或NaOH溶液调节培养基的pH使其在使用时达到规定值。
在25±
2℃时测定pH值。
如果配方中有琼脂，则琼脂的含水量不应超过15%，配方中的水均应为纯水。
PH7.2磷酸盐缓冲液
储备液—在1000ml容量瓶中将磷酸二氢钾KH2PO434g（monobasicpotassiumphosphate）溶于约500ml水中，用NaOHTS（约175ml）调节pH至7.2±
0.1。
加水至刻度，混匀。
分装，灭菌。
冷藏保存备用。
培养基
除非另有规定，培养基均应采用高压蒸汽灭菌方式（见灭菌项<
1211>
下，蒸汽灭菌），灭菌时间取决于待灭菌的培养基的体积。
.酪蛋白胨-大豆卵磷脂-聚山梨醇酯20液体培养基
PancreaticDigestofCasein酪蛋白胰酶消化物（胰酪胨）
20g
SoyLecithin大豆卵磷脂
5g
Polysorbate20聚山梨醇酯20
40mL
Water水
960mL
将酪蛋白胨、大豆卵磷脂溶解在960ml水中，在温度为48-50°
C水浴中加热约30分钟使其完全溶解。
加40ml聚山梨醇酯20混合，按所需量分装。
.大豆-酪蛋白水解物琼脂培养基
PancreaticDigestofCasein酪蛋白胰酶水解物（胰酪胨）
15.0g
PapaicDigestofSoybeanMeal大豆木瓜酶水解物
5.0g
SodiumChlorideNaCl
Agar琼脂
1000mL
灭菌后pH7.3±
0.2。
.大豆-酪蛋白水解物培养基
按无菌检查项<
71>
下大豆-酪蛋白水解物培养基的配制方法进行。
.甘露醇-盐琼脂培养基
PepticDigestofAnimalTissue动物组织胃酶水解物
BeefExtract牛肉浸取物
1.0g
D-MannitolD-甘露醇
10.0g
75.0g
PhenolRed酚红
0.025g
将上述成分混合后，加热并不停不断地搅动，煮沸1分钟使之完全溶解。
灭菌后pH7.4±
0.2.
.Baird–Parker琼脂培养基
YeastExtract酵母浸取物
LithiumChloride氯化锂
20.0g
Glycine甘氨酸
12.0g
SodiumPyruvate丙酮酸钠
950mL
边加热边搅拌，煮沸一分钟。
灭菌，冷却至45
C-50
C,加入10ml灭菌的1%亚碲酸钾溶液、50ml蛋黄乳化液，轻轻混合均匀，倾注平皿。
（卵黄乳化液制备：
将蛋壳表面消毒，无菌条件下打开蛋壳，将完整的蛋黄分离至无菌量筒中。
加入无菌盐水TS，使蛋黄与盐水比为3:
7。
转移至一无菌搅拌杯中高速搅拌5秒钟。
）灭菌后pH6.8±
.Vogel–Johnson琼脂培养基
Mannitol甘露醇
DibasicPotassiumPhosphate磷酸氢二钾
16.0g
25.0mg
将固溶体（固体溶液）煮沸1分钟，灭菌，冷却至45
C—50
C，加入灭菌的1%亚碲酸钾溶液。
灭菌后pH7.2±
.Cetrimide琼脂培养基
PancreaticDigestofGelatin明胶胰酶水解物
MagnesiumChloride氯化镁
1.4g
PotassiumSulfate硫酸钾
13.6g
CetylTrimethylammoniumBromide（Cetrimide）
溴化十六烷基三甲胺
0.3g
Glycerin甘油（丙三醇）
10.0mL
将所有的固态成分溶于水后，加入甘油，边搅动边加热，煮沸1分钟使之完全溶解。
.用于荧光检测的假单胞菌琼脂培养基
PancreaticDigestofCasein酪蛋白胰酶消化物
PepticDigestofAnimalTissue动物组织胃酶消化物
AnhydrousDibasicPotassiumPhosphate
无水磷酸氢二钾（K2HPO4）
1.5g
MagnesiumSulfate（MgSO4）硫酸镁
Glycerin甘油
将固态成分溶于水后，加入甘油，边搅动边加热，煮沸1分钟使之完全溶解。
.用于检测绿脓菌素的假单胞菌琼脂培养基
PancreaticDigestofGelatin明胶胰酶消化物
AnhydrousMagnesiumChloride
无水氯化镁（MgCl2）
AnhydrousPotassiumSulfate
无水硫酸钾（K2SO4）
.乳糖培养基
BeefExtract牛肉浸提物
3.0g
Lactose乳糖
灭菌后尽快冷却，灭菌后pH6.9±
.亚硒酸盐-胱氨酸培养基
PancreaticDigestofCasein酪蛋白胰酶消化物
4.0g
SodiumPhosphate磷酸钠
SodiumAcidSelenite亚硒酸钠
L-CystineL-胱氨酸
10.0mg
最终pH:
7.0±
0.2
混合，加热使之溶解用流动蒸汽加热15分钟，不要高压灭菌。
.连四硫酸盐培养基
PancreaticDigestofCasein酪蛋白胰酶水解物
2.5g
BileSalts胆盐
CalciumCarbonate碳酸钙
SodiumThiosulfate硫代硫酸钠
30.0g
将固溶体（固体溶液）加热至沸腾。
用时加由5g碘化钾和6g碘溶于20ml水中配制而成的溶液，之后加入10ml千分之一的亮绿溶液，混合，加入亮绿溶液后不要加热。
.亮绿琼脂培养基
YeastExtract酵母浸提物
SodiumChloride氯化钠
Sucrose蔗糖
80mg
BrilliantGreen亮绿
12.5mg
将固溶体（固体溶液）煮沸1分钟，使用前高压灭菌，将培养基融化，倒入平皿中，令其冷却。
灭菌后pH6.9±
.木糖-赖氨酸-去氧胆酸盐琼脂培养基
Xylose木糖
3.5g
L-LysineL-赖氨酸
7.5g
13.5g
SodiumDesoxycholate去氧胆酸钠
6.8g
FerricAmmoniumCitrate枸橼酸铁胺
800mg
7.4±
边搅拌便加热固态物与水的混合物至沸点，勿过度加热或高压灭菌。
立即转移至约50˚C水浴中，冷却后立即倒入平皿中。
.亚硫酸铋琼脂培养基
Dextrose右旋葡萄糖
FerrousSulfate硫酸亚铁
300mg
BismuthSulfiteIndicator亚硫酸铋指示剂
8.0g
25mg
7.6±
.三糖铁琼脂培养基
PancreaticDigestofCasein酪蛋白胰酶水解物（胨）
PancreaticDigestofAnimalTissue动物组织胰酶水解物
Dextrose葡萄糖
FerrousAmmoniumSulfate硫酸亚铁铵
200mg
13.0g
.麦康凯琼脂培养基
17.0g
BileSaltsMixture胆盐混合物
NeutralRed中性红
30mg
CrystalViolet结晶紫
1.0mg
将固态物与水混合煮沸1分钟令其充分溶解，灭菌后pH7.1±
.LevineEosin亚甲兰琼脂培养基（伊红美兰琼脂培养基）
PancreaticDigestofGelatin明胶胰酶水解物
2.0g
EosinY伊红（曙红）
400mg
MethyleneBlue亚甲兰（美兰）
65mg
将明胶胰酶消化物、磷酸氢二钾及琼脂溶解在温水中，冷却。
用时融化，按下述比例加入其余组分并混合：
每100ml琼脂液中加入5ml20%乳糖溶液2ml2%伊红溶液以及2ml0.3%（1/300）的亚甲兰溶液。
最终配好的培养基可能不是澄清透明的。
灭菌后pH7.1±
.Sabouraud葡萄糖琼脂培养基
40g
MixtureofequalpartsofPepticDigestofAnimalTissueandPancreaticDigestofCasein动物组织胃酶水解物与酪蛋白胰酶水解物的等量混合物
10g
15g
混合；
煮沸使之完全溶解。
灭菌后pH5.6±
.马铃薯葡萄糖琼脂培养基
Cook300gofpeeledanddicedpotatoesin500mLofwaterpreparedbydistillation,filterthroughcheesecloth,addwaterpreparedbydistillationtomake1000mL,andaddthefollowing:
将300克去皮的马铃薯片加入500ml蒸馏水蒸煮，用cheesecloth（纱布）过滤,加蒸馏水至1000ml，然后加入下述成分
Glucose葡萄糖
加热溶解，灭菌。
灭菌后pH5.6±
倾倒平皿之前，在熔融后冷却至45
C的培养基中加入无菌10%酒石酸溶液调节pH3.5±
0.1。
勿将pH3.5的培养基再次加热。
检验量
各专项试验一次试验所用的供试品量为10mL或10g.
供试液的制备程序
应根据试样的物理性状选择适宜的方法制备供试液，该制备方法还应不影响原有的微生物的种类和数量。
供试液可以是来源于供试品的全部或部分的溶液或混悬液，只要适宜于将要进行的检测程序。
对那些有着明显的溶解，但不能完全溶解的固态供试品，可将其适当地粉碎成细粉，并将其悬浮在指定的赋形剂中，按《需氧菌总数计数》、《金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌检查》以及《沙门菌属、大肠埃希菌检查》项下的规定进行。
由真溶液组成的液体供试品，或由水或浓度小于30%乙醇作为赋形剂配成的混悬液供试品以及那些几乎完全溶解于90mlpH7.2的磷酸盐缓冲液中或指定的培养基中的固态供试品，按《需氧菌总数计数》、《金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌检查》以及《沙门菌属、大肠埃希菌检查》项下的规定进行。
对于与水不混溶的液体、软膏（油膏）、乳剂、蜡制品，其混悬液制备可按下述方法进行：
加入最小量的合适的无菌乳化剂（例如：
一种聚山梨醇酯），机械搅拌，必要时温热至温度不超过45℃。
按《需氧菌总数计数》、《金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌检查》以及《沙门菌属、大肠埃希菌检查》项下的规定进行。
对于气雾剂供试品，将容器置于乙醇－干冰混合物中冷却约１小时，钻开容器，放置室温，使抛射剂释出，如有可能，可加温排出抛射剂。
按检测要求的量，依前述两个程序之一的要求将一定量的供试品以适当的方式转移。
如果不能从10个气雾剂形式的容器中获得10g或10ｍl供试品，则可将冷却的容器中的内容物全部转移到培养基中，令抛射剂释出， 用残留物进行检测。
若检测结果不确定或可疑，可从20个或更多的容器中取样重新检查。
总需氧菌计数
平皿法用于完全溶解的供试液或允许采用平皿法的半透明供试液，其他供试液采用多管法进行检查。
无论用那种方法，都必须首先准确称量或量取供试品10ｇ（当供试品为固态时）或10mL（当供试品为液态时），将其溶解或悬浮在pH7.2磷酸盐缓冲液,大豆－酪蛋白水解物液体培养基,或酪蛋白水解物－大豆卵磷脂－聚山梨醇酯20液体培养基中，使成100mL。
如果稀释级为1:
10时供试液过于粘稠，不能用移液管移取，可将供试液稀释（1：
50，或1：
100）直至可以移取。
在进行总需氧菌检查之前，应按《预试验PreparatoryTesting》项下的规定进行验证，确认不存在抑菌活性。
应在适宜稀释级的供试液制备后1小时内将其加入到培养基中用于接种培养。
平皿法
必要时，将供试液继续稀释，使加入1ml供试液培养后的菌落数在30-300个。
分别向两个无菌平皿中加入1ml终稀释级供试液，每皿注入15-20ml融化后冷却至45℃的大豆-酪蛋白水解物琼脂培养基，盖上平皿，轻轻敲打或旋转使样品与琼脂培养基混合，室温凝固。
倒置培养48-72小时后，检查菌的生长，计数菌落数。
取两个平皿每克或每毫升供试液的需氧菌数的平均值报告菌数。
如果在稀释级为1：
10的样品平皿中未发现微生物菌落，则将该结果表示为每克或每毫升样品中菌数小于10个。
多管培养法
取14支规格类似的试管，分别加入9ml大豆-酪蛋白水解物液体培养基。
将其中12支分成四组，每组3支。
除对照组3支外，在第一组（“100”）三支管中以及第四支管（管A）中加入1ml供试品溶液或混悬液，混匀。
取1ml管A中的内容物移入至另一个分组后剩余的管中（管B），混匀。
管A和管B中分别含有供试液100mg（或100uL）和10mg（或10uL）.。
向第二组（“10”）的3支试管中分别加入管A的内容物1ml，向第三组（“”）的3支试管中分别加入管B的内容物1ml，废弃管A、管B中剩余的内容物。
将各试管封严，培养。
检查各管中微生物的生长情况，对照管应澄清，含供试液的样品管参照表1整理实验数据，可以给出每克或每毫升供试液中最可能的微生物的数量。
表1.多管培养法最可能的微生物总数
ObservedCombinationsofNumbersof
TubesShowingGrowthinEachSet
每组中长菌管总数
MostProbableNumberof
MicroorganismspergorperMl
每克或每毫升供试液中最可能的微生物的数量
No.ofmg（ormL）ofSpecimenperTube
每管中的供试品量
100
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