四环素人工抗原的合成与鉴定Word格式.docx

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【关键词】四环素（TC）羧基化偶联人工抗原

　　四环素类抗生素（TCs）是一类由链霉菌产生的宽谱抗生素,对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌均具有较强的抗击能力。

因其高效、廉价且能直接通过口服起效的特性,被普遍应运于禽畜养殖业中,既能预防医治疾病,也能起增进生长的作用。

1998年,欧洲动物卫生联盟的一份调查显示,在欧盟15国中,四环素类抗生素的利用量占了整个禽畜业中抗生素利用量的65％［1］。

在国内,四环素类抗生素也一样被大量普遍的用于禽畜养殖业中。

人长期低剂量的摄入四环素类抗生素可能会产生各类慢性和蓄积性疾病,要紧表此刻对胃、肠、肝脏的损害,和牙齿的染色,还会造成过敏反映、二重感染、致畸胎等,同时可能会致使人体肠道中菌群平稳的失调和耐药性细菌的产生。

为此,我国规定畜禽肉中四环素的最大残留量不得超过100ppb,禽蛋中不超过200ppb［2］。

目前,我国用于检测四环素类抗生素的ELISA试剂盒要紧靠国外入口,价钱昂贵,因此急需开发拥有自主知识产权的试剂盒或免疫传感器,而其关键之一确实是制备具有优良免疫原性的四环素完全抗原。

咱们通过对载体蛋白BSA进行羧基化,大大提高了其表面活性羧基的数量,同时对四环素进行衍生化,取得活泼的重氮化中间产物,再与BSA及sBSA偶联,制备四环素完全抗原并对其进行比较。

　　1材料和方式

　　材料UV-2100紫外扫描仪为北京瑞利公司产品;

NicoletNexus傅立叶变换红外光谱仪为美国热电公司产品;

WATERSPlatformZMD4000型高效液相色谱质谱联用仪为美国WATERS公司产品;

950mL/L盐酸四环素标准品购于中国药品生物制品检定所;

牛血清白蛋白（BSA）为北京博奥生物技术Sigma公司入口分装;

丁二酸酐（Succinicanhydride）、N-氯丁二酰亚胺（NCS）、水合肼（Hydrazinehydrate）均为美国Sigma公司产品;

其他试剂均为分析纯;

PBS缓冲液为mol/L,,所用水均为SZ-97自动三重纯水蒸馏器制得。

　　方式

　　BSA的羧基化（sBSA）取20mLmol/L的NaCl溶液,用mol/L的NaOH溶液调pH值至,冷却至4℃,加入1gBSA充分溶解后,缓慢加入75mg丁二酸酐,用mol/L的NaOH调pH值至,维持4℃磁力搅拌1h,随后于PBS缓冲液中透析3d,及时换液,最后冷冻干燥得粉末状固体,于-20℃下保留备用［3,4］。

　　TC半抗原的衍生化与鉴定TC在酸碱条件下都比较活泼,容易形成差向异构化四环素或降解［5］,因此通过两步衍生化,封锁其活性基团,形成一种活泼的重氮化中间产物,再与BSA偶联。

（1）四环素衍生物4-氧代脱-甲氨基四环素4,6-半缩酮（C20H17O9N）（TC1）的合成:

称取400mg标准品,溶解于20mL超纯水中,滴加适量mol/L的盐酸溶液,使盐酸四环素充分溶解。

室温条件下,加入280mgNCS粉末,磁力搅拌数分钟后有沉淀析出。

反映30min后,过滤,得粗产物,加入5mL超纯水洗涤,然后加入10mL乙醚萃取,放掉基层水相,反复操作3次,以有效去除杂质。

最后将萃取液置于通风厨中,自然挥发搜集产物,取少量进行HPLC-MASS鉴定［6］。

（2）四环素衍生物4-腙-脱甲基-四环素（C20H19O8N3）（TC2）的合成:

取220mg上步反映所得的TC1溶于15mL950mL/L的乙醇中,室温下缓慢加入50μL水合肼,立刻析出沉淀,磁力搅拌1h。

过滤得粗产物,加入8mL乙醇洗涤,反复3次,搜集产物,取少量进行HPLC-MASS鉴定［7］。

　　TC-BSA和TC-sBSA完全抗原的合成与鉴定取2份通过纯化后的TC2各50mg溶于20mL的超纯水盐酸溶液中,别离加入250mgBSA和sBSA,摇匀后缓慢加入20mgEDC,磁力搅拌1h,反映终止后［8］,以PBS缓冲液为洗脱液,4℃下SephadexG-25柱凝胶过滤,归并278nm处的搜集液,最后冷冻干燥,所得粉末保留于-20℃冰箱中备用［9］。

　　对所合成的完全抗原进行紫外分光光度计扫描测定［10］,按下式计算偶联物的结合比［11］。

　　CaCb=ACam·

KBbm-ACbm·

KBamACbm·

KAam-ACam·

KAbm

　　式中:

Ca/Cb:

偶联物中A、B2种物质摩尔浓度比（结合比）;

ACam,ACbm:

偶联物别离在A、B最大吸收波长下的吸光值;

KAam,KBbm:

A、B在各自最大吸收波长下的摩尔消光系数;

KAbm:

A在B最大吸收峰波优势的摩尔消光系数;

KBam:

B在A最大吸收峰波优势的摩尔消光系数［12］。

　　2结果

　　四环素衍生物TC1（C20H17O9N）和TC2（C20H19O8N3）的HPLC-MASS鉴定图1和图2是TC1的HPLC-MASS谱图,TC1在液相色谱上的保留时刻为min,其余为杂质峰,通过积分计算其纯度为%;

质谱图中454和438别离TC1与K+和Na+的离子峰,计算出相对分子质量（Mr）为415,与实际Mr相符,说明TC1合成成功。

图3和图4为TC2HPLC-MASS谱图,TC2的保留时刻为min,积分得其纯度为%,杂质较多,在与载体蛋白偶联前需通过进一步纯化;

质谱图中为其阴离子峰,计算得其Mr为429,与实际Mr相符,由此判定,四环素衍生化合成成功。

　　图1TC1HPLC图（略）

　　图2TC1质谱图（略）

　　TC-BSA和TC-sBSA的HPLC分析取透析后TC-BSA和TC-sBSA做HPLC分析,取得图5和图6的色谱分析图。

图中最顶峰的出峰时刻别离为min和min,与BSA的出峰时刻类似,为TC-BSA和TC-sBSA偶联物的吸收峰。

但图5中左侧有2个比较突出的吸收峰,可能为BSA在与四环素偶联进程中自身活性氨基与活性羧基彼此交联而形成聚合物,对照图6,通过羧基化的BSA产生的聚合物明显减少,偶联物的纯度有所提高。

　　TC-sBSA和TC-BSA的红外分析比较TC-BSA和BSA的红外光谱发觉,它们在3600～3200cm-1区域和1700～1600cm-1区域具有相似的吸收,这是蛋白质中氨基酸产生的特点峰,说明合成的TC-BSA化合物具有BSA的特点官能团。

将TC-sBSA和TC-BSA的红外光谱与TC的红外光谱相较较:

在TC-sBSA和TC-BSA的红外光谱947cm-1和863cm-1处,显现了2个明显的四环素特点峰,而BSA在此处无明显吸收,说明TC-sBSA和TC-BSA具有TC的特点官能团的存在,由此说明TC-sBSA和TC-BSA人工抗原偶联成功,能够作为免疫抗原。

　　图3TC2HPLC图（略）

　　图4TC2质谱图（略）

　　图5TC-BSA的HPLCmap图（略）

　　图6TC-sBSA的HPLCmap图（略）

　　TC-BSA和TC-sBSA偶联比计算图8为各样品的紫外扫描吸收光谱分析。

分析中所用TC的浓度为50mg/L,BSA、TC-BSA和TC-sBSA的浓度均为500mg/L。

从紫外扫描结果能够看出,四环素在274nm和362nm处有2个吸收峰,与载体蛋白的紫外吸收谱图相较,TC-BSA和TC-sBSA发生了明显转变,显现了四环素的特点吸收峰,说明半抗原与载体蛋白成功地发生了偶联。

经计算,半抗原与BSA的结合比为7∶1和11∶1。

　　图7TC、BSA及偶联物红外图谱（略）

　　图8TC、BSA及偶联物紫外扫描图谱（略）

　　3讨论

　　牛血清白蛋白表面的赖氨酸ε-氨基及结尾氨基即表面活性氨基（surfacereactiveaminogroup,SRAG）数约为59个,同时也存在约100个表面活性羧基［13］。

通过BSA的羧基化,能够将BSA表面的部份活性氨基转变成活性羧基,增加其亲核反映性的同时也能够有效幸免其空间位阻,提高偶联比［4］,而且还能够减少在偶联进程中BSA自身氨基与羧基的反映造成的交联,减少副产物的产生,偶联物的HPLCmap图和偶联比的不同能够证明这点。

　　通过四环素的衍生,咱们制备了偶联比为7∶1和11∶1的2种完全抗原,第一次免疫和2次增强免疫新西兰大白兔后,耳部取血,ELISA法初步测得针对四环素分子的效价为1∶8000和1∶13000,因还需进行增强免疫,最后制备抗体的效价和其他指标另行报导,从该结果也可知,本研究中合成四环素半抗原及人工抗原的技术线路是可行的,所得产物与预期相符。

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