小麦空间诱变后代粒重相关基因的遗传与变异Word文档格式.docx
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SSRmarkers
目录
第一章综述1
1.1小麦分子标记的概况1
1.1.1小麦分子标记的方法1
1.1.2小麦分子标记的研究现状3
1.2小麦产量性状的遗传研究3
1.3小麦产量性状相关的QTL分析4
1.4研究目的及意义5
1.5本研究的技术路线图6
第二章小麦航天诱变材料粒重相关基因的QTL分析7
2.1实验材料与仪器7
2.1.1植物材料7
2.1.2试剂7
2.1.3仪器设备9
2.1.4引物选取10
2.2小麦粒重相关QTL的扩增10
2.2.1基因组DNA的提取10
2.2.1.1CTAB提取液的配制10
2.2.1.2DNA的提取10
2.2.2PCR扩增11
2.3SDS-PAGE检测11
2.3.1变形聚丙烯酰胺凝胶电泳实验步骤11
2.4结果与分析13
2.4.1供试株系遗传变异情况13
2.4.2航天诱变材料SSR多态性分析15
2.4.2.1SSR多态性引物筛选15
2.4.2.2SSR突变位点的检测15
2.4.2.3SSR位点突变的多发性16
2.4.2.4SSR位点突变与小麦性状变异的关联分析16
第三章讨论与结论17
参考文献18
附录20
外文文献20
文献翻译22
致谢24
第一章综述
1.1小麦分子标记的概况
1.1.1小麦分子标记的方法
长期以来，育种家一直利用传统的育种方法，同过对植物的表型选择进行育种，虽然这种方法更加的形象直观，但具有很大的局限性，仅仅通过传统育种方法以达到小麦产量的较大突破比较困难。
结合分子方面的有关技术进行分子育种则很好地解决了这一问题。
人们对小麦分子标记方法的探究也在不断地进行。
随着分子标记技术的发展，促进高密度遗传连锁图谱的构建和QTL的全基因组范围检测。
现在，随着生物技术的不断发展，分子标记方法已经产生了三代几十个种类。
分别是基于Southern杂交技术的标记，以限制性片段长度多态性标记（RFLP）为代表；
基于PCR的分子标记技术，有、随机扩增多态性（RAPD）、扩增片段长度多态性（AFLP）简单重复序列多态性（SSR）等；
基于SNP的标记技术，以单核苷酸多态性（SNP）技术为基础。
这些标记技术具有以下特点：
SSR标记技术又叫微卫星技术，在PCR基础上所产生的，SSR序列是由多个核苷酸小片段经过多次重复而组成的一定长度的序列。
大量存在于很多生物的基因组中。
它主要是通过不同的生物特异的引物的设计，从基因组DNA进行PCR扩增。
最后利用特定的技术去鉴定扩增出来的片段的差异。
该技术能够有效地筛选出不同生物个体微卫星DNA的差异。
而且一般来说，SSR引物都具有一定的共显性特征，能够准确区分不同个体的基因型，符合孟德尔式遗传规律。
同时其检测手段具有方便，稳定性强的优点，是研究小麦遗传规律的很好工具。
现在，SSR标记已在目的基因的标记和定位麦遗传连锁图谱的构建、染色体片段的鉴定、遗传多样性分析和标记辅助选择、品种鉴定等方面得到广泛的应用。
Stephenson等[1]在小麦遗传连锁图谱中定位到53个SSR标记位点,其中在A组21个、B组19个、D组13个。
Korzun等[2]用65个与四倍体小麦衍生系MG4323与栽培四倍体小麦Messapiu杂交的重组自交系的单株为材料,通过六倍体小麦第5同源群的二核苷酸串联SSR标记位点完善了硬粒小麦5A和5B染色体的遗传连锁图谱。
RAPD标记技术是Williams等在1990年建立，这一技术较有效地改进了RFLP技术上的不足,其特定的观察多态性的方法，已在分子研究的多个方面得到广泛应用。
它的主要原理是通过随机设计一个9个碱基左右的引物，扩增不同个体的基因组DNA，最后利用一定的分离技术对不同个体特定基因位点的差异进行分析[6]。
RAPD标记已在检测外源染色体片段[7]、基因定位[8]、近缘种属的进化与起源以及品种间的遗传多样性[9]等方面得到广泛应用。
由于小麦染色体间存在部分同源性，使用随机引物扩增小麦基因组DNA时易产生非特异性扩增，使得该技术无法用于小麦的连锁遗传图构建[10]，同时RAPD标记稳定性差且在小麦中多态性低，在小麦育种研究中的应用越来越少。
限制性片段长度多态性（RFLP）是指利用多种限制酶共同作用对所研究的材料基因组进行切割，最后利用特定的技术对切割所产生的片段的差异进行比较[11]。
Smith（1989）[12]通过研究，结果表明杂交种中的杂和位点的产量与数目的决定系数达到了0.87，充分说明了通过亲本自交系的等位变异可以有效地预测杂交种的产量。
Dudley等得出的研究结果和他的结论一致，同时认为RFLP确实是白交系遗传相似性它的最好估计，同时也适合于划分玉米自交系1杂优类群。
由单词的方法，根据RFLP数据可以分为显性组共6个，其中3个分类群和美国很相似，2个优势是美国类群，类群是非常不同的，但仍然是中国玉米育种中发挥重要作用，与热带植物，提供有用的信息，为中国玉米杂种优势和杂种优势群。
这些都表明RFLP在作物育种中的有限性和可行性。
扩增片段长度多态技术（AFLP）,其方法就是利用PCR技术扩增出不同长度的片段，最后通过特定的技术对扩增出的片段进行区分，从而对特定基因进行标记[13]。
它主要是利用两种不同的限制酶对所要研究的材料的DNA进行切割，从而产生许多长度不同的酶切片段。
设计和所用的两种酶切产生的切头互补的接头序列并将之与酶切片段进行连接，得到大量的重组片段。
用特定的引物去PCR扩增重组片段而得到片段大小不一、长度不同的PCR产物，再利用特定的分离技术而进行区分。
能够产生具有共显性的AFLP图谱，符合传统的遗传模型，比着RAPD技术的特异性有着更加稳定的优点。
而且其多态性分布比较广泛并区分快速。
同时在每条染色体上都有多态性位点，目前该技术已在小麦遗传多样性研究[14]、遗传图谱构建[15]、基因定位[16]等方面得到广泛的应用。
但其过程需要酶切，因此对所提取的DNA要有着特殊的要求，同时得到的部分标记与得到的DNA指纹不一致[17]。
单核苷酸多态性（SNP）标记技术，是一种新兴的新一代标记技术。
在近年来作物的分子育种中有着广泛的应用，能到用来有效地表示不同生物个体在同一等位基因处个别碱基的差异，经常出现的单核苷酸多态性有碱基的插入缺失、碱基替换。
目前，SNP在发现的生物变异类型中最为广泛，即使在不同生物个体中序列差异不大的基因中也存在一定数量的SNP位点，这是最理想的分子标记在植物遗传研究。
作为新兴的分子标记，SNP较多的优点，首先SNP数量多分布广，同时比微卫星标记密度更高，是等位基因间序列差异最为普遍的类型；
同时它还具有二态性特点，不再以DNA序列长度的不同来检测多态性，而是能够用不同的方法进行基因的检测；
在启动子区的SNP可能影响到基因的表达，而在编码序列的SNP可能会对所编码蛋白的结构和功能造成影响，对SNP的开发和利用已经成为遗传研究的热点。
目前，检测SNP的方法很多，常用的有如下几种：
如DNA芯片技术，可以大大提高检测速度，但价格较昂贵；
测序法，对不同个体等位基因片段进行测序分析，检测序列中的碱基变异。
该法直观、准确，但工作量大，价格昂贵；
利用生物信息学的方法在已有的DNA数据库中搜索SNP，这种方法有着直接、快捷的优点；
单链构象多态性（SSCP），通过个别碱基的变化影响DNA的构象的原理来检测SNP，这种方法操作简单、经济、适用面广。
但许多因素，如温度，凝胶电泳的浓度可以影响灵敏度，所以稳定性不高；
杂交法的缺点，PCR法，利用引物序列3′端的SNP不能与模板有效结合，导致PCR扩增结果的不一，通过特定的手段检测PCR结果来达到确定SNP位点的目的。
PCR法方便快捷但受较多其它因子的干扰，重复性较差。
利用SNP标记，人们已成功标记了一些抗病、抗逆和优质基因[18]。
酶切法，基因中个别碱基的变化，可造成原来基因中部分酶切位置的变化，通过特异酶切割所扩增的序列，产生大小不一的切割片段，再利用简单的检测手段来可达到区分该位点的目的。
酶切检测法方便、准确，但只能分析酶切位点处的SNP，而不能检测酶切位点以外的SNP，所以有一定局限性。
1.1.2小麦分子标记的研究现状
随着目前分子标记技术的迅猛发展，其在小麦育种中的应用也越来越广泛，在目前传统育种难以在小麦的产量上有重大突破时，分子育种及时的出现，成为了小麦育种中行之有效的新方法，在农业中的地位日益提高。
SSR分子标记在构建小麦遗传连锁图谱、标记和定位目的基因、鉴定和标记染色体片段、鉴定品种、遗传多样性分析和标记、辅助选择等方面有着重要的应用[19]。
抗病品种的选育，小麦白粉病是小麦产量的影响因素，抗病品种是更有效的方法，经济。
近年来，选育抗病品种一直是育种家的研究热点，而传统的育种方法很难较为准确有效的选育出抗病品种，运用分子方面的手段进行育种，成为了选育抗病品种的新方法。
现在，已在小麦基因组中定名38个抗自粉病主效基因，其中被标记和作图的有41个基因位点的57个抗白粉病基因。
小麦赤霉病抗性存在主基因效应，由多基因控制，抗病基因表达易受环境条件得影响。
在染色鲈2A、2D、3B、4A、4D、5A、15B、6A、6B、7A上发现了与控制抗赤霉病的QTL位点[22]。
全世界广泛应用的抗源有望水白和苏麦3号。
综上所述，分子标记在小麦的育种中运用日益广泛，解决了传统育种方式难以在产量和其他形状难以取得突破和改良的问题。
目前，分子标记育种已经取得较好的成效。
在构建小麦遗传连锁图谱、标记和定位目的基因、鉴定和标记染色体片段、鉴定品种、遗传多样性分析和标记、辅助选择等方面有着重要的应用。
但现在的分子育种也存在一定的问题，一大问题就是可用的基因标记数量少,有关小麦产量形状的标记就更加短缺，对于丰富和开发新的标记依然是目前研究的热点。
同时，对于航天诱变材料的研究还鲜有报道，对航天诱变材料进行开发和研究，丰富小麦的育种材料，对于小麦的分子方面的育种有着重要的意义。
1.2小麦产量性状的遗传研究
小麦是中国第三大粮食作物，提高和保证我国的小麦籽粒产量的安全有重要意义。
由于受我国耕地面积的限制，提高小麦的单产潜力是一条行之有效的途径。
目前，小麦品质的改良，加强抗小麦和提高小麦的产量潜力仍然是我们的育种努力的方向[23]。
小麦产量性状，穗粒数，粒重，单位面积穗数和籽粒产量的直接形式的三大因素。
其中，千粒重是产量构成因素中贡献最大的因子，提高品种群体产量潜力的关键是能够在群体条件下增加单穗粒重[24]。
王俊振等[25]利用回归和相关分析，对位于黄淮冬麦区的，超高产小麦品种相互间的关系及其产量结构进行了研究。
建议：
多穗型品种必须协调三个元素可以达到很高的重要性，以保证足够的增加穗粒数，千粒重和穗粒数，它的最佳产量结构可达到每公顷穗数大约680.6*104穗，穗粒数大约38.16粒，千粒重可达到大约40.34g；
提高千粒重和穗粒数对于大穗型品种的高产具有非常重要的意义，它的最佳产量结构可达到每公顷穗数大约467.6*104穗，穗粒数大约49.73粒，千粒重大约49.38g。
不同年度间，变异系数最大是千粒重，其次是有效穗数，每穗粒数的变异系数最小。
这3个产量构成因素能够对产量都具有正值的净效应，而且其中的每一个因素经过其他的因素对产量也都为正值的间接效应。
说明提高每一个产量构成因素，都可以提高产量。
有效穗数是影响产量，而间接影响产量较小：
重量影响有效穗数，进而影响产量；
每穗粒数对产量有着较小的间接影响和直接影响。
千粒重是小麦籽粒产量是最重要的因素之一。
根据河南省小麦育种的研究进展20年，小麦产量水平有了较大提高，从400kg/667m2左右提高到了600kg/667m2左右。
新品种对产量起到很大的作用，贡献率达到了51.3％。
在产量构成三因素中，如果千粒重、穗粒数同时增加．其中增幅最大是千粒重[27]。
了解其遗传规律，这对于小麦遗传改良中。
正确匹配的组合，在小麦大小的遗传效应分析，选择有效的后代。
1000粒重遗传规律一致，加性显性模型，加性效应[28]。
在遗传变异中。
如果主要分为加性效应，如果在早代选择分离，对小麦群体，预期的结果是相当不错的。
如果是非加性效应的主要成分，则在杂种优势就会有较大的利用潜力。
1.3小麦产量性状相关的QTL分析
协调好这三个产量构成因素的关系，对提高小麦的产量有着关键的作用。
近年来，国内外的育种家从分子方面研究这三个因素的关系一直是研究的热点。
对小麦产量性状的QTL分析也是非常深入。
周淼平等[29]利用小麦品种Alondra与望水白多代杂交，不断选择后得到的重组自交系群体，对主穗粒数、单株有效穗数、千粒重和单稳粒数4个性状进行QTL分析，研究后表明，在5A染色体上，可以检测到与单株有效稳数相关的QTL，解释10.3％～18.8％；
同时检测到与主稳粒数相关，分别在染色体1D、4A、3B、6B、5D、1B上和连锁群4上的QTL8个单个QTL可以解释9.9％～19.9％；
同时检测到与单穗粒数相关分别位于染色体1D、4A、lB、、2A、2B、6B、3B、7A和5D上的QTL11个，单个QTL解释表型变异的7.5%至43.4%；
同时检测到与5个与千粒重相关的QTL，分别在2A、2B、3B、4D和7A染色体上，每个QTL表型变异可解释9.6％～25.7％。
严峻等[31]利用来自欧洲的四倍体栽培小麦与野生二粒小麦杂交，得到重组自交系152个家系，种植于黔中，对宽和厚的数量性状的QTL分析，主穗重，粒长，主穗粒重，1000粒重与产量性状相关，被发现qtl16个，贡献率为7.4-39.4%。
在LB染色体被发现2个相关的QTL和主穗重；
5A和7B是1的QTL的发现和主穗粒重；
lA和4B上各发现1个与千粒重有关的QTL；
2A、3A、4B和5A上共发现5个与籽粒长有关的QTL；
在5A和7A染色体各发现2个与籽粒宽有关的ＱＴＬ；
在5A染色体上发现２个与籽粒厚有关的QTL。
张国华等[32]利用黄淮麦区的小麦品种为材料，，共检测出49个与产量性状在相关联的QTL位点，其中有17与株高相关联的QTL，有6个与穗长相关联QTL，有5个与可育小穗数相关联的QTL，14个与总小穗数相关联的QTL，15个与每平方米穗数相关联的QTL，5个与穗粒数相关联的QTL，13个与千粒重相关联的QTL。
杨文利等[33]通过研究，发现4个SSR标记分别，株高，穗长，穗粒数，每穗粒数，单株穗数显著相关。
QTL的显着与xgwm294和每穗粒数的控制相关，穗数QTLQTLQTL，株株高，干重的QTL，小穗数，同时对每个性状变异的贡献率分别为5.32％、4.56％、3.11％、3.48％和6.73％：
Xgwm339与控制株高的QTL以及每穗小穗数QTL显著关连，同时对每个性状变异的贡献率为5.03％、4．32％：
Xgwml82与穗长的QTL以及每穗粒数QTL有关，同时对每个性状变异的贡献率为5.65％和6.23％：
Xgwm275发现与千粒重的QTL具有显著关连的关系，贡献率为7．55％；
而且Xgwm294与单株穗数和每穗小穗数有关。
控制穗长和每穗粒数有Xgwml82，与控制株高的QTL显著关联有Xgwm339和Xgwm471，贡献率分别为6.01％和5.38％；
与控制每穗粒数QTL显著关联有Xgwml82。
对性状变异贡献率为14.79％，与控制每穗小穗数QTL相关联有Xgwm582和Xgwm294，对各个性状变异贡献率为11.13％和7.67％；
与不孕小穗数的QTL显著关联有Xwmsl045，对性状变异的贡献率为5.13％；
综上所述，目前对小麦产量性状的QTL的定位几乎涉及了小麦全部的21条染色体，同时对粒重的研究也非常的多，对粒重的QTL定位非常的深入和成熟，为以后对小麦粒重相关的QTL定位提供可靠的理论基础。
同时，千粒重对小麦的产量有着重要的作用，可见，对小麦粒重相关的QTL的必要性。
然而，国内外对小麦粒重相关基因的QTL分析集中在常规的小麦品种，对航天诱变小麦材料的研究鲜有报道。
1.4研究目的及意义
小麦是我们第三大粮食作物，提高和保证小麦的产量，对于我国乃至全世界的粮食安全与稳定都有非常重要的意义。
提高小麦品质，发掘和提高小麦单产潜力一直是世界育种家们研究的热点和方向。
然而当前小麦育种处于一个瓶颈期，难以通过传统的育种方法大幅度提高小麦的产量，在这种情况下，从小麦产量组成要素的分子方面，结合分子标记技术提高小麦产量，成为小麦育种的新途径。
对于小麦产量分子方面的研究，还主要集中在对与产量性状相关的QTL的挖掘上。
但国内外还大部分集中在对传统小麦品种的研究，对小麦航天诱变材料的研究还鲜有报道。
本研究利用西北农林科技大学杜九元郑麦9023、兰天10号两套小麦航天诱变系为材料，以前人对小麦产量性状QTL分析为理论基础，利用12对与粒重等产量显著相关的SSR引物，对这两套航天诱变材料进行QTL分析，找出这两套材料与粒重等产量性状相关的变异位点，证明太空诱变能够使小麦发生基因突变，航天诱变可以作为小麦种植资源创新和品种选育的方法之一。
并进一步通过分析比较，寻找出对小麦产量具有促进作用的有利突变，丰富了小麦的育种材料。
在同一时间，以便为基因的定位和克隆后的基础。
1.5本研究的技术路线图
第二章小麦航天诱变材料粒重相关基因的QTL分析
引言
利用前人对小麦产量性状的QTL分析，查找到与粒重显著相关的12对SSR引物，对待研究的两套小麦航天诱变系进行PCR扩增，利用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），找出材料中的变异位点。
2.1实验材料与仪器
2.1.1植物材料
千粒重差异显著的两个小麦品种：
杜九元郑麦9023和兰天10号小麦航天诱变系，共40个材料，由西北农林科技大学小麦改良中心提供。
2.1.2试剂
（1）1XTE（PH=8.0）
500ml用量配置方法：
将10mMTris和1mMEDTA混合，利用500ml容量瓶定容，调试PH=8.0，然后高温灭菌，自然冷却至室温，4℃保存备用。
（2）NaAc溶液（3M）
250ml用量配置方法：
千分之一天平称取102g的NaAc*3H2O用DDH2O溶解，利用冰醋酸将PH调至5.2，定容至250ml,4℃保存备用。
核糖核酸酶A溶液不含DNase
第一步：
万分之一天平称取0.605g的10mMTris和0.438g的15mMNaCl，用50ml的DDH2O溶解，利用盐酸将PH调至7.5，高温灭菌30min，制成Tris-HCL-NaCL缓冲液；
第二步：
称取10mg的RNaseA溶于1ml第一步配置成的缓冲液中，最后浓度为10mg/ml，滚水煮15min，自然冷却至室温后分装，-20℃保存备用。
（4）0.5M的EDTA溶液
千分之一天平称取186.1g的EDTA用DDH2O溶解，利用氢氧化钠将PH调至8.0，定容至1000ml,，然后高温灭菌15min，自然冷却至室温，4℃保存备用。
（5）0.5%的亲和硅烷
要求：
现配先用
量取199ml的无水乙醇和1ml的0.5%冰醋酸溶液混合；
向上述混合液中加入10μL的亲和硅烷（Binding-silance）原液，混合均匀，4℃保存备用。
（6）2%的剥离硅烷
用500ml的量筒量取490ml的三氯甲烷，加入10ml的剥离硅烷（Repel-silance）原液后，混合均匀，4℃保存备用。
LoadingBuffer
利用万分之一天平称取溴酚蓝50mg,二甲苯青50mg,然后加入甲酰胺95ml,再加入5M氢氧化钠0.2ml,用DDH2O定容至100ml,室温保存即可。
（8）10%过硫酸铵
称取1.0g的过硫酸，用DDH2O混匀定容至10ml。
（9）脱色液
量取150ml的冰醋酸，用蒸馏水定容至1500ml即可。
（10）染色液
称取3g的硝酸银溶于2L的蒸馏水中，溶解充分，摇匀，装入瓶内备用。
（11）显影液
称取30g左右的氢氧化钠溶于2L水中，摇匀后加入2ml的甲醛溶液即可。
（12）电极缓冲液
如下表所列配置：
10XTBE缓冲液配置试剂用量：
Tris
108g
硼酸
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