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九、合成生物学从基本元件到新的生物体的获得11
十、合成生物学的应用11
十一、代谢工程和合成生物学的应用12
十二、代谢工程到合成生物学的联系和不同：
13
十三、合成生物学国内外研究概况13
一、基本概念
利用基因工程技术定向改造细胞的代谢途径，以改善产物的形成和细胞的性能。
以系统生物学思想为指导，利用综合化学（生物化学）技术、物理（生物物理）技术和信息（生物信息）技术，利用基因和基因组的基本要素（Buildingblock）及其组合，进行理性的设计、改造、重建或制造新的生物分子（如蛋白质）、生物体部件（蛋白质复合物）、生物反应系统（光反应系统）、代谢途径与过程（抗生素的生产过程）、具生命活动能力的细胞和生物个体的学科就叫做合成生物学。
二、合成生物学的举例
青蒿酸的合成
50个途径基因改变——导入途径基因、改变启动子、增大前提供应等
通过对代谢途径（网络）不断的改造和优化，使青蒿酸产量实现了若干数量级的提高
支原体基因组的全人工合成
丝状支原体（Mycoplasmamycoides）的几乎不带蛋白质的裸genomicDNA移植到山羊支原体（M.capricolum）细胞中，首次实现了不同细菌种类的整个基因组的替换，将一种物种变为另一种物种，向从零开始构建简单的基因组迈出关键一步
哈佛医学院单细胞模型的构建
构建了初级细胞：
初级细胞主要由两部分组成：
1）自我复制的基因聚合物
2）自我复制的膜（将细胞自身的内容物圈起来，和外界环境分开，使胞内环境相对独立，以便细胞进行自身生命活动）
制作过程：
脂肪酸和相应的甘油酯做成模型细胞的细胞膜，允许外界活化的核酸进入，进而根据模板进行自我复制，已具备“生命”的基本特征。
一般情况下，脂肪酸微粒很难自发的连在一起，当加入酸脂肪酸离子发生质子化后，流动性等各方面的性质都得到改善，于是可以聚集在一起连成一个平面，当平面的两端偶然的碰在一起并融合在一起时，便形成一个杯状的结构，形成细胞膜，这种细胞膜可以允许胞外活化的核苷酸分子穿过膜进入细胞内（允许核苷酸等穿透该膜进入）并且可以自我复制；
进入胞内的核苷酸通过非酶催化的过程以RNA为模板进行自我复制；
单细胞生物模型已具备基本的生命特征
三、合成生物学的发展的基础
1、开发、建立生物制造所需要的相关技术、发展相关理论
2、设计和构建具有生物功能的新的生物元件、组件和系统，并构建相关的库，以便于筛选和利用；
3、重新设计和改造现有的、天然存在的生物系统
四、合成生物学的研究两个发展方向
1、合成生物学的理论
1）鉴定生物体的功能模块（体系）；
2）研究基因组组分的结构及调控机理；
3）设计生物学的原件或反应系统
2、技术平台和方法：
1）获取鉴定和构建生命功能元件的平台；
2）发展检测、分析、网络系统设计技术；
发展生物合成工程技术（如生物大分子（DNA片段）的合成和拼接）
同时发展合成生物学的理论和核心的工程技术
五、合成生物学存在的意义（宗旨：
生产目的产物或利用廉价的底物）：
1、现有的问题
1）现有的基因表达系统往往不能适用于复杂的改造——即通过基因重组技术将内在的启动子和外源基因相连后接入载体，并将载体导入宿主细胞中令宿主细胞表达目的基因；
这种表达系统表达一个或少数几个基因是可以的，但想要表达一个很长的途径或是一整套信号转导途径则不可行，导入的外源基因可能携带原有的特点，使之在宿主细胞内不能很好的工作；
合成生物学则可以实现很长的代谢途径或一整套信号转导途径的表达
2）生物系统具有非线性和不可预见性：
代谢工程需要使用已被鉴定的标准生物学元件，使其能够构建、组合成为更大的系统；
合成生物学则可以提供这些标准生物学元件。
2、合成生物学的如何解决如上问题：
1）使代谢途径上的基因足量协调表达，而不是过量表达——生产某种产物时，即是指没有中间产物的积累；
过量表达某种物质可能会掠夺细胞内的资源，或者合成过程中的中间代谢物是对细胞有毒性的；
2）形成一个工具箱，能够对细胞内源的和外源的反应进行准确的控制——使细胞能在正确的时间做正确的事情。
3）制定生物学元件的标准，研究不同元件之间的相互作用以及组装规则，从而使组装元件更加容易更加省时，组装出的新的生物体的预见性也更好
六、真正形成一个细胞工厂需要的基本的要素
1、基因型稳定的细胞工厂（可以进行长期培养和被不断的放大）：
要求载体稳定，宿主的排他性小（宿主的应急机制整合酶插入基因片段等方法让基因不表达甚至将外源基因去掉）
2、最少营养需求以减少成本：
宿主在最简单的培养基上也能长得很好，细菌比较好因为营养需求比较低。
3、各个代谢途径活性的准确控制：
启动子、表达系统（希望细胞能在正确的时间做正确的事情，比如说希望产物的合成途径不在细胞生长阶段不表达，对合成途径进行准确控制）
4、合成途径上各个基因的协调表达：
涉及启动子和表达系统；
在合成生物学中，途径上的所有基因表达量并不是越多越好，而是应当协调表达，保证没有多余的中间产物。
5、计算机辅助设计系统：
元件的准确描述和设计组装等复杂的任务，必须借助计算机辅助系统。
合成生物学的工程学特色很明显，对元件的描述和鉴定标准非常精确（如：
启动子对宿主有什么样的要求；
在什么时候、诱导物在什么浓度时启动子被激活；
诱导物浓度为多少时，该启动子下游基因的表达量是多少）从而构建标准的元件库，以便于进行组装；
就像计算机回路中有标准的晶体管和二级管之后，就可以轻而易举的把他们组装成电子回路；
但是，目前想要达到一种流量分布，需要怎样对细胞进行改造，导入哪些基因，敲除哪些基因，如何进行调整，才能达到目的产物的量最大的计算机辅助设计软件仍很匮乏。
6、系统检测和调试：
无论是构建新的生物体、重头合成某种目的产物或是改造已有的生物体，都需要知道构建和改造的结果怎样，构建和改造是否按照预期进行、存在什么问题等，从而迅速容易的发现和反馈问题，以利于进一步的改造和优化。
七、合成生物学研究对元件的要求
宿主
1）最少营养需求、能够利用廉价底物
2）遗传背景清楚、实验操作方便（便于进行大规模的改造和操作）
3）能够长期稳定地持有外源基因
4）较高的生长速率（以便提高生产效率）
改造宿主的实例：
Reduced-genomeE.coli
去除染色体上的一些大片断，包括可移动区域以及隐性致毒基因（共计约占整个基因组的15%）；
从而构造能够长期持有外源基因的稳定的、强壮的宿主细胞（因为此时，宿主对外援基因的排他性变小）。
载体
1）分离稳定性：
确保所有细胞持有质粒、生产目的产物
2）尽可能少的拷贝数：
不对宿主造成负担，否则宿主有排他效应
3）在所有细胞中具有恒定的拷贝数：
保证可以稳定生产
4）能够携带大片断DNA
5）整合到染色体上：
最稳定
启动子
分类：
1、诱导型启动子（普遍使用）：
lac、阿拉伯糖表达系统。
但是都是allornone的表达
2、不同水平的诱导：
希望所有细胞被均一诱导，诱导程度随着诱导物的浓度而变化，这样就可以对启动子进行很准确的工程化的鉴定
如阿拉伯糖加了多少的时候，诱导程度有多大
正常情况下：
a）阿拉伯糖诱导的启动子为PBAD，被活性为阿拉伯糖调控的调控蛋白AraC调控（不结合阿拉伯糖时，被其调控的基因被抑制，结合阿拉伯糖后，被其调控的基因被激活）
b）当少量阿拉伯糖和AraC结合后解除其对PBAD的抑制作用后，外源基因即可表达，但由于阿拉伯糖也通过AraC以同样的方式调控阿拉伯糖转运蛋白AraE的表达，所以，当少量阿拉伯糖激活AraE的表达后，新产生的AraE便可以大量转运胞外的阿拉伯糖进入胞内，直到可以被阿拉伯糖激活的所有启动子（包括PBAD）的启动效率达到最大~这样的结果是，在modest浓度的阿拉伯糖存在的情况下，有的细胞充分表达外源基因，有的则很少表达，所以，PBAD被激活的细胞数目和阿拉伯糖的浓度相关，而非PBAD被激活的程度和阿拉伯糖浓度相关，因此为非均一表达；
我们想要的结果是，所有细胞中为PBAD控制的基因都均一表达，且表达的程度和阿拉伯糖的浓度相关；
改进方法是：
把AraE的启动子换成组成型的启动子，这样转运蛋白的浓度不受阿拉伯糖的控制，所有细胞中所含转运蛋白的数目是一样的；
此时，诱导程度和阿拉伯糖的浓度成正比。
其他
通过改造诱变sigma因子提高代谢物的产率和对酒精的耐受性，
如何使多个基因协同表达
方法一：
每个基因使用不同的诱导型启动子
缺点：
①这样就注定在培养基中加不同的诱导物，成本会提高；
②不好对诱导的时间点进行控制；
③不同启动子之间可能存在cross-talk
方法二：
每个基因使用不同强度的诱导型启动子
构造不同强度的启动子库
构建攻略：
改变启动子的-10或-35区及-10或-35区中间16-bp间隔区的核酸序列
方法三：
①将相关的基因组成一个操纵子，用一个启动子去控制这些基因的转录，所有基因都可以同时被表达出来
②不同基因的相对表达量通过调节转录后的过程来控制，如转录终止、mRNA的稳定性以及翻译过程；
③组合合成基因间区域，构建相应的库
该寡核苷酸库中的寡核苷酸可以形成各种各样的发夹结构，也携带有各种RNAase的位点，
根据需要设计基因间的区域，从库中选择适当的寡核苷酸序列，将这些序列拼接起来，连入操纵子中基因间的区域；
操纵子转录完成后，通过这些连入的寡核苷酸片段转录形成的基因间区域形成的发夹结构或携带的核酸酶切位点对整个操纵子进行转录后调控，从而调节操纵子上不同基因的相对表达量；
如上图，通过设计基因间的区域，将苦衷合适的寡核苷酸拼接起来，然后通过PCR将其连在基因2的两端，再通过PCR把gene2连到gene1河gene3的两端，得到完整的重组结构；
对于上图中，在gene3的启动子区域引入了强有力的发夹结构，使其蛋白表达量相对较低，所以，虽然具有同等的转录水平，但却得到不同的蛋白表达量，这样的方法可以是同一操纵子内的两种蛋白的表达量相差100倍以上
八、计算机辅助设计
在合成生物学中，对基本元件进行描述，建立相应的组装规则从而将基本元件进行组装必须借助计算机辅助设计，实现从Insilicon到invivo的转化
1、计算机辅助设计的内容：
计算机辅助设计可以帮助预测为了大量生产目的产物，需要导入、去除或调整的元件（代谢网络重构，代谢流量模型），导入后如何进行微调（系统检测和优化，代谢流量模型）才可以达到产物的最大产量；
2、计算机辅助设计的不足：
但目前生物设计工具非常少，且只关注某一方面；
3、计算机辅助设计的重要任务
1）代谢网络重构：
①为什么要进行代谢网络重构：
a.若要将外源的代谢途径导入宿主，就要求知道宿主细胞本身的代谢网络及宿主能够做什么，将基因信息map到代谢网络上，这样才能有目的的导入相应的途径；
b.所构建的代谢途径中的基因并非单一的物种来源的，而是不同物种的基因经优化整合后再导入宿主的；
因此希望通过分析基因组的信息找到能够有效达到某个目的的代谢途径及与该途径相适应的基因，即什么样的基因对什么样的途径和什么样的目的是适合的。
c.但是现在的数据库存在很多的不一致性和途径Gap，为了填补这些途径缺口，可以用基于genomecontext的方法填补缺口，然后用生化学和分子生物学的方法对基因预测的结果进行鉴定，从而得到比较完整的代谢网络和代谢调控网络。
②什么叫代谢网络重构：
代谢网络重构是完全基于生物信息学比较基因组学的方法，对物种进行全基因组测序，通过对宿主细胞的基因组的分析，建立gneomicmap和代谢网络之间的连接，即从genomicmap——>
metabolicmap，并对代谢途径上的gap进行填补（其中一种方法就是基于Genomecontext的方法）
③Genomecontext
什么叫genomecontext：
基于Genomecontext的方法都建立在比较基因组学上的方法，即：
通过分析基因库、分析基因调控组，根据这些信息对基因功能进行预测，填补相应途径上缺口，完成整个代谢途径的重构工作。
举例：
乙酰葡糖胺的利用途径甲壳素的单体重要成分
乙酰葡糖胺在大肠杆菌中的利用途径
a.背景介绍：
通过PTS转运系统进入胞内进行磷酸化、脱乙酰基化、脱氨基化等反应最终形成6-磷酸果糖，现在知道PTS、脱乙酰基酶和脱氨基酶分别由nagE、nagB、nagA三个基因决定，且他们形成一个operon（操纵子）；
这些基因被一个调控蛋白NEGZ调控，绿色的点点就是NAGZ的结合位点；
但是在另一种生物中Shewanella（在进化上和大肠杆菌是很接近的，但是很多代谢途径却相差甚远）中，虽然同样存在将乙酰葡糖胺转化成F6P的这条代谢途径，但是，只找到nagA的同源基因，并没有发现nagE和nagB的同源基因；
也就是说用这种基于同源比对的传统方法，理论上这个代谢途径在shewanella中是不能完成工作的。
b.用比较基因组学的分析，发现在shewanella中nagA和两个未知的基因是聚集在一起的，
1）一个基因的产物是具有激酶活性的转录调控因子；
2）另一个基因的产物和GlcN-6Psynthase（GlmS）的C端的一部分一致，GlmS由具有转氨酶活性（amidotransferase）的N末端结构和具有糖磷酸异构酶活性（phosphosugarisomerase）的C末端结构域构成，而未知基因SO3506的产物恰巧和GlmSC末端具有异构酶活性的结构域相似；
3）该基因簇，即与nagA形成的基因簇，在其他许多种属重都存在
4）基因上游的调控区都是conserved，这些基因都是被nagR所调节的
c.根据以上证据可以预测，第一个未知基因编码的产物具有乙酰葡糖胺激酶的活性，将乙酰葡糖胺转化成6-磷酸乙酰葡糖胺，第二个未知基因编码的产物具有6-磷酸葡糖胺脱氨基酶的活性，将6-磷酸葡糖胺转化成F6P
d.进行预测的鉴定：
将这两个基因克隆出来，进行表达纯化，并测酶活性；
1）invitro测试：
先加入底物，然后加入三个酶，得到了预期的产物；
2）invivo测试：
shewanella种属中，除了S.frigidimarina这一株菌株不能在以乙酰葡糖胺为碳源的培养基上生长外，其余的都长的非常好，这样的结果与S.frigidimarina中无和上述乙酰葡糖胺代谢途径相关的基因簇的事实是一致的。
这就证明，这个基因簇的确是和乙酰葡糖胺转化为F6P的代谢途径联系在一起的。
2）系统检测和调试
系统检测测和调试的目的：
检测基于元件库按照相关的标准进行元件组装后得到的改造的生物体是否按照预期运行，迅速的发现问题并反馈问题，以利于纠正出现的问题并对系统进行调整，进行进一步的改造和优化，使目的产物的产量达最大。
基本元件库—>
组装得到改造的生物体—>
系统检测—>
优化
过量表达一个代谢途径可能造成：
1）细胞出现应激反应，基因表达发生改变
2）细胞生长缓慢
3）细胞内外代谢物谱发生变化
4）细胞内的代谢流量发生变化
检测上述变化，并将其归纳起来得到有用的信息，从而指导人们进行有效的改造
检测方法：
1）组学的方法（如，过量表达会使细胞的蛋白质表达发生变化，所以可以通过蛋白质组的方法进行鉴定，或者通过代谢物谱进行鉴定）
2）直接测量代谢物途径的活性，如：
fluxomics，直接对细胞的表性进行表征，给出细胞内各个代谢反应途径的活性，对细胞进行内部精确列表，指导下一步改造和优化
3）代谢流量分析
①代谢流量模型的意义：
通过建立相关的化学计量学模型，通过对硫平衡？
的分析来分析中心代谢途径的流量，从而帮助预测基因改造对宿主细胞的生长和产物形成的影响，但目前仍没有软件可以预测需要改造什么元件、以及如何改造才能够到想要的代谢流量分布。
②代谢流量分析的方法
基于同位素的代谢流量分析
大致过程：
a.将13C标记的底物（位置标记的或全标记的）加入培养基中，用此培养基进行细胞培养；
b.经过一段时间的培养后，收集细胞，分离胞内的代谢物如，氨基酸、甘油，葡萄糖；
c.数据收集：
—通过质谱和核磁共振分析这些中间代谢物的13C标记状态，进而得到各中间代谢物的含量分布；
—同时在胞外测量一些速率：
底物消耗速率、产物生成速率、细胞生长速率
d.进行分析：
分析基于两大类平衡方程①代谢物的平衡；
②同位体的平衡
③举例：
一位碳标记的葡萄糖，糖酵解途径得到三位标记的丙酮酸，走…途径则得到一位标记的丙酮酸，如果走磷酸戊糖途径，则没有被标记过的丙酮酸，通过检测三位碳，一位碳和二位碳的标记状态，即测得labeling-pattern就可以知道各个途径的活性。
九、合成生物学从基本元件到新的生物体的获得
例子：
青蒿酸的合成（宿主：
E.coli和S.cerevisiae）
1）考察了宿主的合成途径
E．coli中有脱氧戊酮糖磷酸途径，生成IPP——>
生成青蒿酸的前体物质
2）切断原有的生成IPP的DXP途径
3）导入来自酵母的mevalonate途径：
TOP和BOTTOM基因放入两个操纵子中，两个操纵子都使用lac启动子，为相容质粒；
之所以放在两个操纵子上是因为可以很容易的能够进行检测，通过检测甲羟戊酸，检测TOP操纵子是否起作用；
同样，可以通过向medium中添加甲羟戊酸，检测BOTTOM操纵子是否起作用；
把这两个操纵子导入后，将底物乙酰辅酶A转化成FPP，但是这条代谢途径是走得不通的，因为此时细胞将会积累有毒的中间代谢物，所以有如下第四步：
4）导入codon优化的amophadienesynthase（amophadienesynthase是植物来源的，必须进行优化）此时，虽然有毒代谢物不积累了，但整个反应的甲羟戊酸的产量受到限制，所以想办法提高TOF操纵子的表达量，但此时有毒代谢物HMG-CoA会积累，细胞停止生长，；
5）增加下游基因hmgR的表达，从而增加了前提供应，甲羟戊酸的量提高两倍
6）改造TOP操纵子上的基因间区域，导入发夹结构，使TOP操纵子上这些基因的相对表达量发生改变，最后甲羟戊酸的供应量提高到7-8倍
7）导入编码优化的细胞色素P450单氧化酶，实现从amorphadiene到青蒿酸的三步氧化反应
8）优化启动子，优化vector，从而进一步提高产量
十、合成生物学的应用
1、有目标的重新设计和改造现有生物体（对于遗传背景非常清楚的生物体进行人工操作，得到改造的生物体）
-例：
2、从头设计、合成新的生物体，赋予其新的功能
支原体基因组的全人工合成（现在国内可以合成1kb的片段，但是500kb的片段就不可能合成，准确的进行大分子片段的合成和拼接技术亟待提高）
3、研究生命起源与进化
例：
单细胞模型的构造（对于细胞来说，膜很关键，膜将细胞内的活动和外界环境隔离开，从而，核苷酸可以在细胞内进行正常的复制，指导生命活动的正常进行）
4、更多的例子：
非自然途径法合成
用非自然途径法合成高级醇
如合成丁醇，既是良好的有机溶剂，又是新一代的生物燃料（极性小、燃值小）
1）天然生产过程：
乙酰辅酶A——>
乙酰乙酰辅酶A——>
丁酰辅酶A，经脱氢酶作用形成丁醇；
2）研究小组利用氨基酸合成途径，在E.coli中合成正丁醇，之所以选择大肠杆菌的氨基酸合成途径是因为：
a.大肠杆菌的生长能力很强的；
b.氨基酸合成途径上的酶的活性很高；
c.支链氨基酸合成途径中常涉及α-酮酸代谢物；
3）大致过程：
①向E.coli中导入α-酮酸脱羧酶，和广谱的醇脱氢酶，这样让α-酮酸不向支链氨基酸合成的通路上走；
②通过增大前体供应，切断旁路途径等手段，使异丁醇的合成量大大增高。
合成生物学更多强调的是一种理念，即，可以在原有的代谢途径上进行缝补，也可以对宿主本身或整个代谢网络和调控网络进行非常大的改造；
可以通过设计、优化生产过程中的每一个元素，让细胞利用某一廉价底物生成大量的目的产物；
十一、代谢工程和合成生物学的应用
由于合成生物学是代谢生物学的延伸，故他们从一定程度上有相同的应用范围，其目的都包含：
1）提高现有途径的产率；
2）通过设计合成一些新的有用的分子；
合成一些新的有用的分子
利用生成oleandromycin的抗生素链霉菌构建一个DNAlibrary;
将此DNAlibrary导入红霉素的合成途径已经被阻断的红色糖多孢菌，此重组的菌可以生成一些具有新的结构的新抗生素（e.g.2-norerythromycin）
对聚酮合成酶的改造
聚酮类的物质（抗生素，抗癌药物），由聚酮合成酶合成，聚酮合成酶的催化方式和脂肪酸的合成途径非常相似（聚酮合成酶的各domain的功能可以和脂肪酸合成途径中的不同酶的功能相对应），通过对这些部件（聚酮合成酶的domain）进行重新组装（重新安排其顺序和数目），藉此生成新的药物（其实这个过程就是组合生物合成）。
莽草酸
改造过程：
1）增加共同前体的供应量
2）解除反馈抑制
3）增加限速步骤酶的基因的拷贝数
4）切断其进一步的代谢途径（使莽草酸为最终产物）等
例四：
展望如何有效利用廉价的木质素
利用廉价的木质纤维素生产酒精
木质纤维素通过酸水解生成纤维素（单糖，包括葡萄糖和木糖）、半纤维素（单糖，葡萄糖和木糖）和木质素（进一步降解可以生成很多有用的物质）
由于酒精生产菌不能很好的利用木糖或在葡萄糖的存在下不能很好的利用木糖，而造成很大的资源浪费，所以希望通过代谢工程和合成生物学——很好的利用木糖最终实现木质纤维素的有效利用很有发展前景。
联系：
合成生物学时代谢工程的延伸，代谢工程可以为合成生物学提供一些技术平台，如：
代谢流量的分析方法，系统监测平台，计算机辅助设计的平台；
不同点：
代谢工程：
从90年代开始发展，是面向对象的，有很多分析方法，通过分析代谢途径，在代谢分析的方法上增强某些限速酶的表达，减除反馈，敲除某些酶基因，去除副产物（面向生产均，如何进行胞内改造，）
合成生物学：
面向过程的，是对生物体更大规模的改造，甚至从头合成；
合成生物学的工程学特色很明显，对元件的描述和鉴定标准非常精确，需要建立标准的元件库；
从底物到产物的过程中所涉及的任何元素（宿主、启动子、酶等）都是可以去改造的（如：
优选宿主并做适当改造；
优选酶基因，优化密码子；
优选启动子，核糖体结合位点等调控元件），通过改造和优化这些元素而达到最终目的（如，从头合成等）
十三、合成生物学国内外研究概况
国外：
美国：
约二十个实验室从事生命系统设计和合成生物学
相关研究。
欧盟：
剑桥大学和苏黎世大学已建实验
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