生物化学实验报告137030032Word下载.docx
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起始刻度
终点刻度
体积(mL)
酸价
备注
空白对照
六、思考题
请对你的实验结果进行分析。
批阅教师:
年月日
实验三蛋白质的提取及浓度测定(紫外吸收法)
掌握蛋白质的提取方法;
学习紫外分光光度法测定蛋白质含量的原理;
熟练掌握紫外分光光度计的使用方法。
二、实验原理
大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液,少数与脂类结合的蛋白质则溶于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂中,因些,可采用不同溶剂提取分离和纯化蛋白质及酶。
由于蛋白质中存在着含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸,因此蛋白质具有吸收紫外光的性质,最大吸收峰在280nm波长处。
在此波长范围内,蛋白质溶液的光密度OD280nm与其浓度呈正比关系,可作定量测定。
三、实验材料、主要仪器和试剂
1.试验材料:
萌发3天的小麦种子
2.主要仪器
(1)紫外分光光度计,
(2)离心机(3)试管与试管架,(4)刻度吸量管(5)研钵(6)100mL容量瓶
3.试剂:
标准牛血清蛋白溶液:
准确称取经凯氏定氮法校正的结晶牛血清蛋白,配制成浓度为1mg/mL(0.5克标准牛血清蛋白纯水定容至500mL)的溶液。
1.蛋白质(淀粉酶)的提取
称取1g萌发3天的小麦种子(芽长约1cm),置于研钵中,加入少量石英砂和2mL蒸馏水,研磨匀浆。
将匀浆倒入离心管中,用6mL蒸馏水分次将残渣洗入离心管。
提取液在室温下放置提取15~20min,每隔数分钟搅动1次,使其充分提取。
然后在3,000r/min转速下离心10min,将上清液倒入100mL容量瓶中,加蒸馏水定容至刻度,摇匀,即为蛋白质原液,用于蛋白质浓度的测定。
2.标准曲线制作
按表1分别向每支试管内加入各种试剂,混匀。
以光程为1cm的石英比色杯,在280nm波长处测定各管溶液的光密度值OD280nm。
以蛋白质浓度为横坐标,光密度值为纵坐标,绘出标准曲线。
批阅教师:
年月日
表1蛋白质标准曲线制作
管号
标准蛋白质溶液(mL)
蒸馏水(mL)
蛋白质浓度(mg/mL)
OD280nm
1
4
2
0.5
3.5
0.125
3
1.0
3.0
0.25
1.5
2.5
0.375
5
2.0
0.50
6
0.625
7
0.75
8
4.0
3.样品测定
取提取的蛋白质溶液,按上述方法测定280nm的光密度,并从标准工作曲线上查出提取蛋白质溶液的浓度。
若提取蛋白质溶液的浓度大于2.0,超出测量范围,则稀释后再测,计算蛋白质浓度时乘以稀释倍数。
蛋白质浓度=
五、思考题
1.为何要在280nm波长下测定蛋白质浓度?
在其它波长下测定可以吗?
2.如果考虑核酸的存在,蛋白质浓度的实际的值比测量值是大还是小?
为什么?
实验四淀粉酶活力的测定
学习和掌握测定淀粉酶(包括α-淀粉酶和β-淀粉酶)活力的原理和方法。
淀粉是植物最主要的贮藏多糖,也是人和动物的重要食物和发酵工业的基本原料。
淀粉经淀粉酶作用后生成葡萄糖、麦芽糖等小分子物质而被机体利用。
淀粉酶主要包括α-淀粉酶和β-淀粉酶两种。
α-淀粉酶可随机地作用于淀粉中的α-1,4-糖苷键,生成葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖,同时使淀粉的粘度降低,因此又称为液化酶。
β-淀粉酶可从淀粉的非还原性末端进行水解,每次水解下一分子麦芽糖,又被称为糖化酶。
淀粉酶催化产生的这些还原糖能使3,5-二硝基水杨酸还原,生成棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。
淀粉酶活力的大小与产生的还原糖的量成正比。
用标准浓度的麦芽糖溶液制作标准曲线,用比色法测定淀粉酶作用于淀粉后生成的还原糖的量,以单位重量样品在一定时间内生成的麦芽糖的量表示酶活力。
淀粉酶存在于几乎所有植物中,特别是萌发后的禾谷类种子,淀粉酶活力最强,其中主要是α-淀粉酶和β-淀粉酶。
两种淀粉酶特性不同,α-淀粉酶不耐酸,在pH3.6以下迅速钝化。
β-淀粉酶不耐热,在70℃15min钝化。
根据它们的这种特性,在测定活力时钝化其中之一,就可测出另一种淀粉酶的活力。
本实验采用加热的方法钝化β-淀粉酶,测出α-淀粉酶的活力。
在非钝化条件下测定淀粉酶总活力(α-淀粉酶活力+β-淀粉酶活力),再减去α-淀粉酶的活力,就可求出β-淀粉酶的活力。
1.实验材料
萌发的小麦种子(芽长约1cm)
2.仪器
(1)离心机
(2)离心管(3)研钵(4)电炉(5)容量瓶:
50mL×
1,100mL×
(6)恒温水浴(7)20mL具塞刻度试管×
13(8)试管架(9)刻度吸管:
2mL×
3,1mL×
2,10mL×
1(10)分光光度计
3.试剂(均为分析纯)
(1)标准麦芽糖溶液(1mg/mL):
精确称取100mg麦芽糖,用蒸馏水溶解并定容至100mL。
(2)3,5-二硝基水杨酸试剂:
精确称取3,5-二硝基水杨酸1g,溶于20mL2mol/LNaOH溶液中,加入50mL蒸馏水,再加入30g酒石酸钾钠,待溶解后用蒸馏水定容至100mL。
盖紧瓶塞,勿使CO2进入。
若溶液混浊可过滤后使用。
(3)0.1mol/LpH5.6的柠檬酸缓冲液
A液:
(0.1mol/L柠檬酸):
称取C6H8O7·
H2O21.01g,用蒸馏水溶解并定容至1L。
B液:
(0.1mol/L柠檬酸钠):
称取Na3C6H5O7·
2H2O29.41g,用蒸馏水溶解并定容至1L。
取A液55mL与B液145mL混匀,既为0.1mol/LpH5.6的柠檬酸缓冲液。
(4)1%淀粉溶液:
称取1g淀粉溶于100mL0.1mol/LpH5.6的柠檬酸缓冲液中。
1.麦芽糖标准曲线的制作
取7支干净的具塞刻度试管,编号,按表1加入试剂:
表1麦芽糖标准曲线制作
试剂
管号
麦芽糖标准液(mL)
0.2
0.6
1.4
1.8
麦芽糖含量(mg)
3,5-二硝基水杨酸(mL)
吸光度值
摇匀,置沸水浴中煮沸5min。
取出后流水冷却,加蒸馏水定容至20mL。
以1号管作为空白调零点,在540nm波长下比色测定光密度。
以麦芽糖含量为横坐标,光密度为纵坐标,绘制标准曲线。
2.淀粉酶液的制备
称取1g萌发3天的小麦种子(芽长约1cm),置于研钵中,加入少量石英砂和2mL蒸馏水,研磨匀浆。
然后在3000r/min转速下离心10min,将上清液倒入100mL容量瓶中,加蒸馏水定容至刻度,摇匀,即为淀粉酶原液,用于α-淀粉酶活力测定。
吸取上述淀粉酶原液10mL,放入50mL容量瓶中,用蒸馏水定容至刻度,摇匀,即为淀粉酶稀释液,用于淀粉酶总活力的测定。
3.酶活力的测定:
取6支干净的试管,编号,按表2进行操作。
表2酶活力测定取样表
操作项目α淀粉酶活力测定α+β-淀粉酶活力测定
Ⅰ-1Ⅰ-2Ⅰ-3Ⅱ-4Ⅱ-5Ⅱ-6
淀粉酶原液(mL)1.01.01.0000
钝化β-淀粉酶置70℃水浴15min,冷却
淀粉酶稀释液(mL)0001.01.01.0
3,5-二硝基水杨酸(mL)2.0002.00.0
预保温将各试管和1%淀粉溶液分别置于40℃恒温水浴中保温10min
1%淀粉溶液(mL)1.01.01.01.01.01.0
保温在40℃恒温水浴中准确保温5min
3,5-二硝基水杨酸(mL)02.02.002.02.0
将各试管摇匀,置沸水浴中煮沸5min。
以1号管(做标准曲线时用过的)作为空白调零点,在540nm波长下比色测定光密度,记录测定结果。
Ⅰ-1
Ⅰ-2
Ⅰ-3
Ⅱ-4
Ⅱ-5
Ⅱ-6
吸光度
麦芽糖含量
五、结果计算
计算Ⅰ-2、Ⅰ-3光密度平均值与Ⅰ-1光密度之差,在标准曲线上查出相应的麦芽糖含量(mg),按下列公式计算α-淀粉酶的活力。
=
计算Ⅱ-5、Ⅱ-6光密度平均值与Ⅱ-4光密度之差,在标准曲线上查出相应的麦芽糖含量(mg),按下式计算(α+β)淀粉酶总活力(单位同上)。
(α+β)淀粉酶总活力
β-淀粉酶活力=(α+β)淀粉酶总活力-α-淀粉酶活力=
1.为什么要将Ⅰ-1、Ⅰ-2、Ⅰ-3号试管中的淀粉酶原液置70℃水浴中保温15min?
2.为什么要将各试管中的淀粉酶原液和1%淀粉溶液分别置于40℃水浴中保温?
实验五 醋酸纤维薄膜电泳法分离血清蛋白质
一、目的
学习醋酸纤维薄膜电泳的操作,了解电泳技术的一般原理。
二、原理
带电质点在电场中移动的现象称为电泳。
电泳有很多类型,如,纸电泳、醋酸纤维薄膜电泳、纤维素或淀粉粉末电泳、淀粉凝胶电泳、琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。
任何一种物质的质点,由于其本身在溶液中的解离或由于其表面对其他带电质点的吸附,会在电场中向一定的电极移动。
例如,氨基酸、蛋白质、酶、激素、核酸及其衍生物等物质都具有许多可解离的酸性和碱性基团,它们在溶液中会解离而带电。
不同的质点在同一电场中泳动速度不同,据此可将不同带电物质分开。
醋酸纤维薄膜电泳是用醋酸纤维薄膜作为支持物的电泳方法。
醋酸纤维薄膜由二乙酸纤维素制成,它具有均一的泡沫样的结构,厚度仅120微米,有强渗透性,对分子移动无阻力,作为区带电泳的支持物进行蛋白电泳有简便、快速、样品用量少、应用范围广、分离清晰、没有吸附现象等优点。
目前已广泛用于血清蛋白、脂蛋白、血红蛋白和同功酶的分离及用在免疫电泳中。
三、器材及试剂
1.器材:
①醋酸纤维薄膜(2×
8cm)
⑥玻璃板
②常压电泳仪
⑦竹镊
③点样器(盖玻片)
⑧白磁反应板
④培养皿(染色及漂洗用)
⑨人血清或鸡血清
⑤粗滤纸
2.试剂:
①巴比妥缓冲液(PH8.6):
巴比妥2.76克,巴比妥纳15.45克,加水至1000毫升。
②染色液:
氨基黑10B0.25克,甲醇50毫升,冰醋酸10毫升,水40毫升(可重复用)。
③漂洗液:
含甲醇或乙醇45毫升,冰醋酸5毫升,水50毫升。
④透明液:
含无水乙醇7份,冰醋酸3份。
1.浸泡:
用镊子取醋酸纤维薄膜1张(识别出光泽面与无光泽面,并在无光泽面角上用铅笔做上记号)放在缓冲液中浸泡20分钟。
2.点样:
把膜条从缓冲液中取出,夹在两层粗滤纸内吸干多余的液体,然后平铺在玻璃板上(无光泽面朝上),将点样器先在白磁板上的血清中沾一下,再在膜条一端2—3厘米处轻轻地水平落下并随即提起,这样即在膜条上点上了细条状的血清样品。
+
膜条
样品
3.电泳:
在电泳槽内加入缓冲液,使两个电极槽内的液面等高,将膜条平悬于电泳槽支架的滤纸桥上。
(先剪裁尺寸合适的滤纸条,取双层滤纸条附着在电泳槽的支架上,使它的一端与支架的前沿对齐,而另一端浸入电极槽的缓冲液内。
用缓冲液将滤纸全部润湿并驱除气泡,使滤纸紧贴在支架上,即为滤纸桥。
它是联系醋酸纤维薄膜和两极缓冲液之间的“桥梁”。
)膜条上点样的一端靠近负极。
盖严电泳室。
通电。
调节电压至160V,电流强度0.4—0.7毫安/厘米膜宽,电泳时间约为60分钟。
4.染色:
电泳完毕后将膜条取下并放在染色液中浸泡10分钟。
5.漂洗:
将膜条从染色液中取出,置漂洗液中漂洗数次至无蛋白区底色脱净为止,可得色带
清晰的电泳图谱。
6.定量(了解):
有两种方法
(1)将上述漂净的薄膜用滤纸吸干,剪下各种蛋白质色带,分别浸于4.0ml0.4mol·
L-1NaOH溶液中(37℃)5—10分钟,色泽浸出后,比色(590nm)。
设各部分的光密度分别为:
OD白、ODα1、ODα2、ODβ、ODγ。
则光密度总和(OD总)为:
OD总=OD白+ODα1+ODα2+ODβ+ODγ
白蛋白%=
×
100α1球蛋白%=
100α2球蛋白%=
100
β球蛋白%=
100γ球蛋白%=
(2)把薄膜放在滤纸上用电吹风吹干,待薄膜完全干燥后,浸入透明液中约5—10分钟,取出,平贴于干净玻璃片上,自然干燥或用电吹风冷风吹干,即得背景透明的电泳图谱,可用刀片刮开并从玻板上取下图谱。
能用光密度计测定各蛋白斑点。
此图谱可长期保存。
五、思考题
1.点样端为何放在负极?
2.实验中应注意哪些事项?
实验六氨基酸的分离鉴定――纸层析法
一、实验目的
通过氨基酸的分离,学习纸层析法的基本原理及操作方法。
二、实验原理
纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法。
层析溶剂由有机溶剂和水组成。
物质被分离后在纸层析图谱上的位置是用Rf值(比移)来表示的:
Rf=原点到层析中心的距离/原点到容剂前沿的距离
在一定的条件下某种物质的Rf值是常数。
Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。
本实验利用纸层析法分离氨基酸。
三、器材
1、层析缸2、毛细管3、喷雾器4、培养皿5、小烧杯6、长颈漏斗7、层析滤纸(新华一号)8、电吹风
四、试剂
1、扩展剂正丁醇:
88%甲酸:
水=15:
2.5:
2.5(体积比),平衡溶剂与扩展剂相同。
每组配制40mL。
2、氨基酸溶液0.5%的赖氨酸、脯氨酸、缬氨酸、亮氨酸溶液及它们的混合液(各组份浓度均为0.5%)。
3、显色剂50~l00mL0.1%水合茚三酮正丁醇溶液。
五、操作
1.将盛有扩展剂10mL的小烧杯和培养皿置于密闭的层析缸中。
2.戴手套取层析滤纸(长22cm、宽14cm)一张。
在纸的一端距边缘2~3cm处用铅笔划一条直
线,在此直线上每间隔2.5cm作一记号。
3.点样:
用毛细管将各氨基酸样品分别点在这5个位置上,干后重复点一次,直径最大不超过3mm。
缝成筒状,两边不能接触。
点样面朝外,点样端朝下,盖上层析缸盖,平衡约10~30分钟。
4.展层 用长颈漏斗,扩展剂的液面需低于点样线1cm。
溶剂扩展至滤纸上沿约5厘米时,取出滤纸,用铅笔标出溶剂前沿界线,干燥。
5.显色 用0.1%茚三酮丙酮溶液均匀浸透,用热风吹干。
脯氨酸、羟脯氨酸产生黄色物质外,所有α-氨基酸及一切蛋白质都能和茚三酮产生兰紫色物质。
6.计算各种氨基酸的Rf值。
六、实验结果
各种氨基酸的Rf值:
赖氨酸
脯氨酸
缬氨酸
苯丙氨酸
亮氨酸
Rf值
七、思考题
1.实验过程中切勿用手直接接触滤纸和显色剂,为什么?
2.点样过程中必须在第一滴样品干后再点第二滴,为什么?
实验七基因组DNA的快速提取---碘化钾法
了解碘化钾法提取动物组织基因组DNA的原理;
掌握DNA提取的相关操作技术。
快速、经济地从血液、组织或培养细胞中得到高产量、高纯度的DNA对于基因研究非常重要。
目前国内外基因组DNA的提取方法有传统的蛋白酶K消化法、尿素法、氯化锌法、辛酸法等,这些方法存在操作步骤繁杂或者使用蛋白酶,且国内许多实验室不易得到方法中使用的试剂。
高浓度碘化钾可直接将细胞膜、核膜破坏、使DNA释放出来,然后用异丙醇沉淀DNA。
实验表明,KI的浓度对DNA的提取效率有影响,5mol/L的KI提取DNA效果较好。
KI法操作简便,不用价格较高的蛋白酶K。
DNA丢失少。
该方法提取的DNA与经典的蛋白酶K法提取的DNA比较电泳结果基本一致。
三、实验材料、试剂及主要器材
1.实验材料
冷冻的新鲜动物肝脏。
2.试剂
氯仿/异戊醇(24∶1):
异戊醇21mL加入到500mL的氯仿试剂瓶中,混匀;
5mol/L碘化钾:
(41.5克碘化钾溶于50mL纯水中);
0.9%NaCl:
4.5克NaCl溶于500mL纯水中;
无水乙醇。
3.主要器材
台式高速(冷冻)离心机、移液器(10,100,1000µ
L),旋涡混合器、Eppendorf管等。
四、实验步骤
1.取黄豆粒大小冷冻肝组织于EP管中(EP管上写上自己学号的最后两位数),有眼科剪捣碎;
2.加50µ
L5mol/LKI,旋涡振荡30s,静置3min;
3.加0.9%NaCl375µ
L,氯仿/异戊醇(24:
1)600µ
L,充分振荡10min,10000r/min离心5min;
4.吸取水相层(上清)于另一Ependorf管中,加-20度预冷乙醇1000µ
L,轻轻混匀(此时应能看到DNA的絮状沉淀),12000r/min离心5min弃上清;
5.加冷无水乙醇1000µ
L,12,000r/min离心3min弃净乙醇,待干(可在37℃烘干约10min);
以50µ
L无菌双蒸水溶解DNA,备用。
L5mol/LKI,旋涡振荡30s,将沉淀物混匀3min;
3.加0.9%NaCl250µ
L,氯仿/异戊醇(24∶1)375µ
L,充分振荡10min,10000r/min离心5min;
4.吸取水相层(上清)于另一Ependorf管中,加-20度预冷乙醇(-20度)300µ
L,轻轻混匀(此时应能看到DNA的絮状沉淀),-20度冰箱静置5min后12000r/min离心5min弃上清;
L,12,000r/min离心3min弃净乙醇,待干(可在37℃烘干约10min);
1)在DNA提取过程中乙醇的作用是什么?
为什么用-20度预冷的乙醇效果更好?
2)实验所用的EP管和枪头等需要高温灭菌吗,为什么?
实验八琼脂糖凝胶电泳技术――DNA样品检测
学习与掌握琼脂糖凝胶电泳的技术方法,利用琼脂糖凝胶电泳检测DNA含量以及分子量,分离不同大小DNA片段。
琼脂糖凝胶电泳是以琼脂糖凝胶为支撑物的区带电泳。
不同大小、不同形状和不同构象的DNA分子在相同的电泳条件下(如凝胶浓度、电流、电压、缓冲液等),有不同的迁移率,所以可通过电泳使其分离。
凝胶中的DNA可与荧光染料溴化乙锭(EB)结合,在紫外灯下可看到荧光条带,籍此可分析实验结果。
三、试剂配制
1.5×
TBE:
Tris54g;
硼酸27.5g;
0.5MEDTA(pH8.0)20mL;
加双蒸水至1L。
用时5倍稀释。
2.EB:
用水配制成10mg/mL的贮存液,分装,避光,4℃保存(1g溴乙锭于100mL水中)。
3.6×
加样buffer:
0.25%溴酚蓝;
40%(W/V)蔗糖;
溶于水中,贮存于4℃。
四、实验操作
1.胶模水平放置胶模。
2.制胶量取200mL1×
TBE缓冲液倒入三角烧瓶中,称取1.6克琼脂糖加入,在微波炉上加热至全熔(清澈透明)。
凝胶加热时间不宜过长,以免蒸干。
3.倒胶用琼脂糖封好胶模,待凝胶冷至50℃左右时(手感容器能耐受),缓缓倒入制胶模中,迅速放好梳子。
凝胶的厚度在3~5mm之间。
避免产生气泡,尤其梳子周围不能有气泡,若有气泡,可用吸管小心吸去。
4.凝胶条件凝胶通常需要在室温中放置20~30分钟。
5.电泳缓冲液凝胶完全凝固后,将凝胶放入电泳槽中(点样孔在负极),加入1×
TBE电泳缓冲液,液面应高出凝胶表面1mm。
6.拔梳子小心移去梳子和隔离板,保持点样孔完整。
7.点样用移液器取1-2µ
L配制好的LoadingBuffer,分别与需要电泳的样品或Marker混合(5-10µ
L),点样,记录点样次序。
注意:
每次电泳每块胶需留一孔点DNAmarker。
加样时Tip头不必插入孔中,可对准加样孔,在孔的上方加样,样品会